ð I H C ðÀ N NG TRƯ NG ð I H C BÁCH KHOA KHOA HOÁ K THU T B MƠN CƠNG NGH TH C PH M GIÁO TRÌNH CÔNG NGH SINH H C TH C PH M II TH I LƯ NG 45 TI T ðÀ N NG 2007 M ð U Công ngh sinh h c m t ngành khoa h c ñang ñư c th gi i quan tâm Giá tr c a công ngh sinh h c ch m t cơng c có th áp d ng cho nhi u ngành kinh t s n xu t lương th c th c ph m, chăn nuôi thú y, công nghi p dư c cơng nghi p hố h c, chuy n hoá sinh kh i thành lư ng, x lý ph li u ph li u công nơng nghi p, phịng ch ng nhi m v sinh môi trư ng… - Công ngh sinh h c giúp cho chương trình c i thi n nông nghi p, ngh vư n ngh r ng tăng su t tr ng, tăng ch t lư ng dinh dư ng c a nông ph m, ch n gi ng ch ng ch u v i sâu b nh v i th i ti t đ t đai khơng thu n l i t o gi ng thích nghi v i u ki n th ng khí h u nh t ñ nh ð ng th i t o u ki n đ trì m t s đa d ng di truy n ñ r ng gi a gi ng tr ng gi gìn ngu n gen đư c t o nên t h hàng hoang d i c a chúng Tính đa d ng di truy n đư c th hi n thơng qua m t s lư ng c c l n ki u k t h p gen có m t s cá th c a m t lồi thơng qua s khác v tính tr ng c a gi ng m t loài: ki u sinh trư ng, tính kháng sâu b nh, tính kháng v i ngo i c nh (sương mu i, h n, nóng…) su t Sau nghiên c u k t qu c a nhi u t h p lai m t cách c n th n nghiêm túc, nhà ch n gi ng d a tính đa d ng di truy n đ ch n dịng có tính tr ng mong mu n ð thành công, nhà ch n gi ng ph i có đư c tay v n di truy n l n t t V n di truy n bao g m gi ng tr ng, gi ng ch ng ch u, gi ng ñ a phương (các gi ng thư ng b b quên su t th p r t q có tính ch ng sâu b nh ñi u ki n ngo i c nh không thu n l i) Trong v n di truy n cịn ph i k đ n hoang d i có tác d ng tăng s c s ng cho gi ng tr ng Tính đa đ ng di truy n nhân t b o đ m tr ng khơng b tai bi n khí h u ho c sâu b nh tiêu di t hoàn toàn Cây tr ng thu n nh t d b h i có tai ho - Cơng ngh sinh h c ñư c ng d ng r ng rãi lĩnh v c th c ph m dinh dư ng Ngành công ngh lên men m t b ph n c a công ngh sinh h c ñã s n xu t nhi u s n ph m r t thú v cho ngành th c ph m Ho c vi c s n xu t n m men có m t nghĩa r t quan tr ng Ngư i ta có th s d ng m t lư ng nh n m men ñ b sung protein, vitamin ch t khống cho th c ph m Ngồi ra, sinh kh i n m men ngu n th c ăn b sung chăn ni r t có hi u qu - Công ngh sinh h c giúp cho chăn ni thú y t o đư c nh ng gi ng nuôi mong mu n s n xu t lo i vacxin đ phịng ch ng b nh t t cho v t ni Ví d : vi c c y chuy n h p t bị t o đư c gi ng bị t t, có s c ch u ñ ng cao K thu t c y chuy n ñư c th c hi n sau: gây s r ng tr ng m t bị có đ c m mà ngành chăn ni c n ñ n ñem th tinh nhân t o b ng tinh trùng c a m t bò ñ c có nh ng ñ c ñi m ngư i ta mong mu n Các h p t hay phơi đư c thu nh n b ng cách r a d Làm đơng l nh phơi nitơ l ng -179oC có th v n chuy n tr ng thái này: 1000 phơi đơng l nh khơng n ng q 50kg Phơi đư c c y vào bị ch a đ h Bê phát tri n lên t phôi s ñ i môi trư ng s ng sau c a chúng khơng ph i đương đ u v i nh ng s b t l i c a môi trư ng mà súc v t nh p hay g p ph i S b o v b ng kháng th c a bò m nh bú s a c a bò m mà sau đ i bê sơ sinh có th ch u ñ ng t t ñ i v i lo i b nh t t thông thư ng - Cơng ngh sinh h c cịn tích c c giúp ñ ngành y t ñ b o v s c kho c a c ng ñ ng Ngư i ta nói r ng y h c d phịng (và lâu dài y h c d báo d a hi u bi t v ñ c ñi m di truy n m i cá th ) s mang l i l i ích nhi u phương pháp ñi u tr M t lĩnh v c c a cơng ngh sinh h c có th góp ph n quan tr ng gi i quy t v n đ y t , khn kh m t sách ưu tiên cho y h c d phịng, c i ti n vacxin hi n có ch t o vacxin m i ð ng th i cịn giúp ích vi c s n xu t lo i kháng sinh, vitamin thu c ch a b nh khác Nh ng năm g n ñây, nh vào k thu t di truy n ngư i ta ñã tìm cách tách chi t ho t ch t c a th c v t b c cao ñ làm v t li u xu t phát cho hàng lo t lo i thu c - Công ngh sinh h c cịn góp ph n vi c s n xu t lư ng như: s n xu t c n b ng ñư ng lên men, chương trình biogas…và ngu n lư ng l i ñi ph c v cho q trình s n xu t khác - Cơng ngh sinh h c tham gia vào vi c chuy n hoá ch t ngăn ch n s ô nhi m môi trư ng S n ph m ph ch t th i ch a hydratcacbon có th đư c chuy n hố b ng cách lên men nh vi sinh v t thông thư ng hay b ng qui trình cơng ngh sinh h c Ho c k thu t tái t h p AND s góp ph n tích c c ñ tách ñư c gi ng vi khu n thích h p nh t cho vi c t i ưu hoá nh ng s chuy n hoá Ví d : chuy n gen mã hố enzym xenluloza hemixenluloza c a Clostridium thermocellum thành nh ng lồi Clostridium khác có th u n ñư c s chuy n hoá xenluloza hemixenluloza thành etanol, axeton, butanol, axít axetic axít lactic Dùng m t vài gi ng ưa nhi t Clostridium (toop= 65-75oC) có l i c t gi m đư c chi phí vi c chưng c t s h ñư c giá thành s n ph m ð ngăn ch n s ô nhi m môi trư ng ngư i ta có th dùng lo i vi sinh v t khác Các k thu t tái t h p AND ñã t o nh ng ch ng vi khu n có th phân hu h p th m t s l n ch t cơng nghi p hố ch t th i Như v y cơng ngh sinh h c có liên quan ñ n nhi u lĩnh v c bao g m ngành như: - Công ngh di truy n - Công ngh nuôi c y mô t bào - Công ngh enzyme - Công ngh vi sinh v t… Trong h c ph n s nghiên c u v m t s ph n c a cơng ngh vi sinh v t Các q trình vi sinh ñư c s d ng r ng rãi lĩnh v c khác c a n n kinh t Nh ng thành t u khoa h c k thu t sinh hoá cho phép t o nh ng trình s n xu t có su t cao d a phương pháp cơng ngh đư c u ch nh đ có m t s s n ph m th c ph m, chăn nuôi, thu c ch a b nh ch t h u CHƯƠNG I: NH NG NGUYÊN T C HOÁ SINH TRONG CÔNG NGH VI SINH V T ð t o b t kì m t s n ph m lên men ñ u ph i qua bư c sau: - Chu n b môi trư ng - Chu n b gi ng - Lên men - Thu h i tinh ch s n ph m ð t o s n ph m có ch t lư ng t t su t cao c n hi u rõ v n ñ sau 1.1 Phân lo i s n ph m c a công ngh vi sinh v t Các s n ph m lên men cơng nghi p đư c phân lo i theo tiêu chu n sinh lí trao đ i ch t S phân lo i d a vào s n ph m c a q trình lên men trình s n xu t nh vi sinh v t luôn t o thành nhi u s n ph m 1.1.1 V t ch t bào (sinh kh i) Cơ ch t t bào Ví d : + protein ñơn bào (tr ng thái ch t) + vi khu n c ñ nh ñ m (s ng): Rhizobium, Azotobacter, VK tr sâu Bacillus thuringiensis… Vi c t ng h p sinh kh i hay v t ch t t bào ñ ng nh t v i sinh trư ng c a vi sinh v t Sinh trư ng sinh s n g n li n v i Sinh trư ng tăng kh i lư ng, sinh s n tăng s lư ng 1.1.2 Các s n ph m trao ñ i ch t Cơ ch t s n ph m + t bào Các s n ph m cu i c a s trao ñ i lư ng (các s n ph m lên men) Ví d : etanol, axít lactic, axeton-butanol… Lên men q trình y m khí c a s thu nh n lư ng, hydro tách đư c chuy n ñ n ch t nh n h u (nó khơng đ ng nghĩa v i s lên men ngơn ng qu c t - đư c hi u trình s n xu t công nghi p nh vi sinh v t) M t s th ti n hành lên men khơng có oxy làm ch t nh n hydro cu i (k khí tuỳ ti n), nh ng nhóm th lên men b t bu c khơng ch a enzym hô h p Các h p ch t h u nh n hydro nh ng h p ch t ñư c hinh thành q trình trao đ i ch t d hố Sau nh n hydro, h p ch t th i t bào gi ng s n ph m cu i c a s hơ h p T n y v n ñ s n xu t c n ch n u ki n ni cho nhi u ch t ñư c chuy n thành s n ph m lên men t t Ví d : s n xu t rư u ñ tăng hàm lư ng rư u c n tăng hàm lư ng ñư ng gi m y u t quan tr ng cho sinh trư ng Các ch t trao ñ i b c Ví d : axít amin, nucleotit, vitamin, axít xitric Các ch t trao ñ i b c m t nh ng viên g ch c u trúc có tr ng lư ng phân t th p c a cao phân t sinh h c c a t bào ch t: axít amin, nucleotit, nucleozit, đư ng, axít béo, vitamin… Ngoài s n ph m trung gian c a q trình trao đ i ch t (các axít h u chu trình ATC) ch t trao ñ i b c Các ch u hồ phát tri n q trình ti n hố b o đ m cho ch t trao ñ i b c ch ñư c t ng h p ñ n m c ñ c n thi t Các ch t trao đ i b c Ví d : kháng sinh, alcaloit Các ch t trao ñ i b c nh ng ch t trao đ i có tr ng lư ng phân t th p, không g p m i th , s phân b c a chúng ch gi i h n nh ng ñơn v phân lo i nh t đ nh Chúng khơng có ch c chung trao đ i ch t c a t bào t bào có th t n t i mà khơng c n đ n chúng Tuy nhiên, ch t trao ñ i b c có th có ý nghĩa v i s sinh trư ng th s n sinh chúng Ch ng h n m t s ch t trao đ i b c có vai trò s h p th s t thi u nguyên t Thư ng ch t b c ñư c t o thành s sinh trư ng ñã k t thúc Các ch ng t n t i t nhiên thư ng ch t o thành r t ch t trao đ i b c 2, nh ng ch t ñư c tích lu t bào ho c th i ngồi 4.Các enzym Ví d : enzym ngo i bào: proteaza, amylaza enzym n i bào : asparaginaza, penixilinaza T bào vi sinh v t ch a kho ng 1000 enzym khác M t s enzyme ch có m t v i s lư ng vài phân t nhi u enzym có m t v i s lư ng l n Ch nh ng enzym ch u trách nhi m phân hu ch t khơng hồ tan tinh b t, xenlulo, protein…m i ñư c ti t t t bào vào môi trư ng Vi sinh v t có kh s d ng ch t khác cho sinh trư ng thích ng v i u ki n sinh trư ng r t khác Trong s gi i h n c a th tích t bào ch t ng h p nh ng enzym mà c n Trong công ngh s n xu t enzym c n ph i ñi u n trao ñ i ch t cho enzym mà ta mong mu n ñư c t ng h p nhi u t t 1.1.3 Các s n ph m c a s chuy n hố ch t Ví d : s oxy hố khơng hồn tồn đ t o thành axit axetic soboza Trong q trình chuy n hố t bào ho t ñ ng nh ng h th ng xúc tác cho m t ho c nhi u bư c chuy n hố ch t V m t lí thuy t nh ng ph n ng x y nh enzym cô l p, nhiên đư ng khơng th th c hi n đư c ho c khơng kinh t (ví d v i ph n ng enzym ph thu c lư ng) Các enzym chuy n hoá ch t theo cách r t đ c hi u Ví d : s chuy n hoá ho c tách hydro x y nh phân t steroid khơng có ý nghĩa ñ i v i t bào (cũng có th ñó nh ng ph n ng kh ñ c) Trong s chuy n hố đ t o axít axetic g n li n v i sinh trư ng, g n li n v i s thu nh n lư ng 1.2 ð ng h c c a sinh trư ng c a s t o thành s n ph m Sinh trư ng c a m t qu n th vi sinh v t di n qua giai ño n khác S sinh s n c a t bào b t ñ u sau m t giai ño n ti m phát Trong giai ño n log ti p theo x y s sinh s n theo hàm s mũ Sau m t th i gian sinh trư ng ng ng l i thi u ch t dinh dư ng b n tích lu ch t c ch Các t bào chuy n vào giai ño n cân b ng Trong giai đo n khơng di n sinh trư ng n a t bào v n cịn ho t đ ng trao đ i ch t Tồn b q trình ni g n li n v i s thay ñ i kéo dài c a u ki n ni Ch t dinh dư ng gi m ñi, s lư ng t bào tăng lên ð ng th i ho t tính trao ñ i ch t thay ñ i V phương di n ch c c a s n ph m trao ñ i ch t ñ i v i t bào có th phân bi t nhóm: - Các s n ph m mà s hình thành c a chúng g n li n v i s sinh trư ng Ví d : s n ph m lên men, ch t trao ñ i b c 1, enzym S t ng h p nh ng s n ph m x y th i gian sinh trư ng cịn có th ti p di n sau sinh trư ng ñã k t thúc - Các s n ph m mà s hình thành c a chúng x y sau sinh trư ng k t thúc; ví d s n ph m trao ñ i ch t b c ð ng th i Th i gian Khơng đ ng th i Th i gian Hình 1: ð ng h c c a trình sinh trư ng t o thành s n ph m Nhi u s n ph m chi m m t v trí trung gian Ví d s t ng h p axít amin m c dù di n th i gian sinh trư ng v n ti p di n sau sinh trư ng ñã k t thúc, trình t ng h p ti p di n s c a m t sai h ng di truy n S t ng h p c a nhi u enzym x y không song song v i sinh trư ng mà g n li n v i m t tr ng thái sinh lí nh t ñ nh c a t bào lên men công nghi p c n ph i tìm tr ng thái sinh lí c a su t cao nh t trì th i gian dài 1.3 S t ng h p th a Vi sinh v t t n t i t nhiên sinh s n ph m trao ñ i ch t thành ph n t bào ch m c ñ c n thi t cho s sinh s n t i ưu cho s trì lồi S trao đ i ch t v y ñư c b o ñ m nh ch u hồ Ví d : ch c n ho t ñ ng cho axit amin khơng đư c t ng h p nhu c u c a s t ng h p protein Như v y, ñi u ki n t nhiên khơng có s s n sinh dư th a s n ph m trao ñ i ch t b c 1, b c enzym N u t nhiên ch ñi u hồ b r i lo n, ví d k t qu đ t bi n th ñ t bi n sai h ng trao ñ i ch t thư ng có h i đ t v i ch ng ban ñ u 1.3.1 Nh ng nguyên t c u hồ trao đ i ch t Có ch ch u trách nhi m u hồ trao đ i ch t: ði u hồ ho t tính enzym nh s c ch b ng s n ph m cu i hay g i s kìm hãm theo liên k t ngư c ði u hoà t ng h p enzym nh s ki m ch b ng s n ph m cu i s gi i ki m ch ði u hoà t ng h p enzym nh s ki m ch d hoá Các enzym c u trúc Glucoza Ki m ch d hoá Ki m ch b ng s n ph m cu i A E.1 B E.2 C E.3 D E.4 S.ph m cu i c ch b ng s n ph m cu i Sơ ñ 1: Các nguyên t c c a s ñi u hoà enzyme * Trong ch s n ph m cu i c a trình sinh t ng h p gây s c ch q trình t ng h p c a đây, s n ph m cu i dù ñư c hình thành t bào hay ñư c thu nh n t môi trư ng dinh dư ng, ñi u ñó ý nghĩa Trong ch này, s n ph m cu i nói chung nh hư ng ñ n enzyme ñ u tiên c a chu i sinh t ng h p Enzym có tính quy t ñ nh protein d l p th Nó có đ c m thay đ i c u hình khơng gian có m t s n ph m cu i nh m gi m b t ho t tính xúc tác S c ch x y nhanh r t có hi u qu * Trong ch 2, s n ph m cu i c ch s t ng h p enzym c n cho s t o thành s n ph m y, vi c đ c thơng tin di truy n c n cho s t ng h p enzym (s phiên âm) b phong to n ng ñ cao c a s n ph m cu i s t ng h p c a enzym tham gia vào chu i ph n ng b ng ng ho c b kéo dài m t cách ñáng k N u n ng ñ c a s n ph m cu i gi m xu ng dư i m c x y s gi i ki m ch , nghĩa enzym ñư c t o thành v i t c ñ cao S u hồ theo ki u x y t t g n li n v i s t ng h p enzym Ho t ñ ng Ch t nh hư ng d l p th Ch t nh hư ng d l p th Th đ t bi n Khơng ho t đ ng D ng hoang d i Hình 2: Mơ hình c a s c ch b ng s n ph m cu i *S ki m ch d hố u hồ q trình t ng h p enzym d hoá xúc tác s phân hu ch t Các enzym ñư c t ng h p nh s c m ng enzym Cơ ch tương t ch ki m ch t c x y m c ñ phiên âm Trong s c m ng enzym, m t ch t dinh dư ng đóng vai trị ch t c m ng kích thích s t ng h p enzym xúc tác cho s phân hu nó, nghĩa ch t c m ng s t ng h p Do đó, vi c t ng h p enzym c m ng ch x y có m t ch t tương ng môi trư ng * S ki m ch d hố u hồ q trình t ng h p enzym d hoá xúc tác s phân hu ch t Các enzym ñư c t ng h p nh s c m ng enzym Cơ ch tương t ch ki m ch t c x y m c ñ phiên âm Trong s c m ng enzym, m t ch t dinh dư ng đóng vai trị ch t c m ng kích thích s t ng h p enzym xúc tác cho s phân hu nó, nghĩa ch t c m ng s t ng h p Do đó, vi c t ng h p enzym c m ng ch x y có m t ch t tương ng mơi trư ng Gen u n ch t ki m ch khơng ho t đ ng khơng có s n ph m cu i khơng phong to s truy n thông tin t ng h p enzym Các gen c u trúc ch t ki m ch ho t ñ ng ch t ki m ch khơng ho t đ ng b sai h ng (ngay c khơng có s n ph m cu i ) không phong t a s truy n thông tin t ng h p enzym ch t ki m ch khơng ho t đ ng S n ph m cu i Ch t ki m ch ho t đ ng Khơng có s truy n thơng tin không t ng h p enzym D ng hoang d i không phong t a s truy n thông tin t ng h p enzym Th ñ t bi n Hình 3: Mơ hình ki m ch b ng s n ph m cu i N u môi trư ng có m t nhi u ch t trư c h t x y s t ng h p c a enzym xúc tác phân hu ch t d s d ng nh t S t ng h p c a enzym khác b c ch b i s ki m ch d hố Thơng thư ng glucoza ch t thích h p nh t 1.3.2 Nh ng sai h ng di truy n c a u hồ trao ñ i ch t Các ch ñi u hoà trao đ i ch t có th b thay đ i nh ng ñ t bi n d n t i s t ng h p th a ch t trao ñ i ch t Nh ng enzyme d l p th ngồi v trí ph n ng v i ch t, chúng m t v trí khác đ i v i s n ph m cu i (hình 2) V trí th g i trung tâm d l p th Hai v trí tách bi t v khơng gian khác v c u trúc M t ñ t bi n có th d n ñ n k t qu làm protein enzyme d l p th b thay ñ i b ng cách m t ñi kh ph n ng v i ch t hi u ng v n cịn ho t tính xúc tác M t protein b bi n ñ i v y v n cịn ho t đ ng c có m t s n ph m cu i d n đ n s t ng h p th a c a s n ph m cu i tương ng (hình phía bên ph i) Trong s ki m ch t ng h p enzym x y nh ng ph n ng quy t li t ph m vi thông tin di truy n, s phiên âm (hình 3) S u hồ t ng h p enzym có th b r i lo n nh ng ñ t bi n khác Nh ng đ t bi n có th ñ ng ch m ñ n gen ki m ch d n t i m t sai h ng c a ch t ki m ch ho c làm bi n m t nó; hay đ ng ch m đ n gen ñi u n làm cho gen m t kh tác d ng v i ch t ki m ch (bên ph i hình 3) Toàn b nh ng sai h ng tương ng có th bi u hi n s c m ng enzyme Nh nh ng s sai h ng y mà enzyme c m ng tr thành enzyme c u trúc, nghĩa chúng t n t i t bào không ph thu c vào ch t s ki m ch d hố b m t CHƯƠNG II: NH NG V N ð K THU T VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG TRONG CÔNG NGH VI SINH V T S n xu t sinh kh i s n ph m trao ñ i ch t q trình lên men có nhi u m gi ng v phương pháp k thu t Vi c áp d ng k thu t phương pháp tuỳ t ng ñ i tư ng vi sinh v t m c tiêu s n ph m cu i Trên s có th áp d ng nh ng m c tiêu phương pháp riêng Chính th khơng th có m t phương pháp chung cho t t c s n ph m Vi c áp d ng k thu t phương pháp ch có th s nh ng nguyên t c chung c a k thu t phương pháp trình bày Vì th , chương s gi i thi u nh ng nguyên t c chung c a k thu t phương pháp ñư c áp d ng r ng rãi ngành vi sinh công nghi p Các nguyên t c chung bao g m vi c n ch n gi ng vi sinh v t, gi gi ng vi sinh v t, trình thi t b đ ng s ng nên có khuynh hư ng t o bào t h n ch s t ng h p enzyme Khi đ m q cao đ tơi x p thống khí c a canh trư ng b gi m, s t ng h p enzyme khó khăn ð m cho phép vi sinh v t t ng h p enzyme t t thư ng t 53÷65%, ph thu c vào đ c ñi m sinh lí c a vi sinh v t, vào c u trúc h c c a môi trư ng u ki n m c a môi trư ng nuôi c y pH c a môi trư ng: So v i phương pháp nuôi chìm phương pháp b m t ch u nh hư ng c a pH mơi trư ng đ n trình sinh t ng h p enzyme q trình ni pH c a mơi trư ng n đ nh V i phương pháp ni c y chìm pH mơi trư ng bi n đ i rõ r t q trình ni gây nh hư ng l n t i s t ng h p enzyme Do đó, ngư i ta thư ng ñi u ch nh pH ñ thu ñư c enzyme v i hi u su t cao M i lo i enzyme thư ng ñư c t ng h p m nh m t vùng pH xác ñ nh ñ i v i t ng lo i vi sinh v t Ví d : amylaza pectinaza c a n m m c ñư c t ng h p m nh mơi trư ng có pH=4,5÷5, cịn proteaza mơi trư ng có pH=6÷6,5 Nhi t đ : Ph n l n vi sinh v t có kh t ng h p m nh enzyme ñ u thu c lo i ưa nhi t trung bình, có nhi t đ t i thích 22÷320C V i vi khu n có lo i thích nhi t đ cao (35÷550C) chúng có kh t ng h p enzyme có đ b n nhi t cao Khi nâng nhi t đ mơi trư ng t i q m c thích h p kh sinh t ng h p enzyme b gi m rõ r t Oxy: ð vi sinh v t sinh trư ng phát tri n ñư c ph i có oxy Do đó, th i kỳ tích lu sinh kh i ph i cung c p đ y đ oxy cho mơi trư ng Th i gian nuôi: Th i gian nuôi c y thích h p c a m i lo i vi sinh v t ñư c xác ñ nh b ng th i gian cho phép tích t enzyme t i ña Th i gian ñó ph thu c vào ch ng vi sinh v t ph thu c vào enzyme chúng t ng h p 5.3.2.2 L a ch n môi trư ng nuôi c y: Thành ph n môi trư ng dinh dư ng m t nh ng y u t có nh hư ng quy t ñ nh ñ n ho t ñ ng s ng c a vi sinh v t kh sinh t ng h p enzyme c a chúng ð b o ñ m nh ng yêu c u t i thi u cho vi sinh v t phát tri n t ng h p enzyme mơi trư ng c n có ch t ch a cacbon, nitơ, hydro, oxy ch t khoáng Mg, Ca, P,S , Fe, K v.v - Ngu n cung c p cacbon thư ng dùng gluxit Khi s d ng ñư ng c n nh r ng m t s đư ng có tác d ng kìm hãm s sinh t ng h p m t s enzyme thu phân Ví d : đư ng glucose có th kìm hãm sinh t ng h p m t s enzyme h amylaza Ngồi gluxit có th s d ng ngu n cacbon khác m , d u, axit h u cơ, rư u Trong s axit h axit lactic đư c vi sinh v t h p th d dàng c Axit có nhi u nư c chi t ngơ Cho nên cao ngơ đư c dùng v a ngu n b sung ñ m v a ngu n cung c p cacbon cho vi sinh v t phát tri n - Ngu n cung c p nitơ có th h p ch t h u ho c vô Các h p ch t h u nh ng h p ch t giàu đ m cao ngơ, b t đ u tương, khơ đ u, khơ l c… Ngu n nitơ vô urê, NH3, mu i amơn Ngồi ra, m t s axit amin, bazơ purin (adenine, guanine…), pyrimidin ñư c b sung vào môi trư ng nuôi c y Các axit amin có tác d ng khác đ i v i vi sinh v t vi c sinh t ng h p enzyme Nhi u axit amin có kh tăng cư ng sinh t ng h p enzyme, m t s khác l i kìm hãm ho c khơng có nh hư ng rõ r t - Các ngun t khống có nh hư ng rõ r t đ n q trình sinh t ng h p enzyme Các nguyên t bao g m c nguyên t ña lư ng vi lư ng Vi lư ng s t, k m, ñ ng, coban Các nguyên t thư ng có nư c ho c thành ph n h u khác c a môi trư ng (b t, cao ngô) khơng c n b sung ho c ch b sung d ng v t N ng ñ c a nguyên t tăng s kìm hãm m nh s phát tri n c a vi sinh v t Các nguyên t ña lư ng ñư c ñưa vào dư i d ng mu i vô c n tính c hàm lư ng c a chúng có s n thành ph n c a môi trư ng Trong nguyên t c n lưu ý đ n P S ngun t thành ph n c u t o c a nhi u ch t quan tr ng, nh t nucleotit, lipit, vitamin… - Các y u t sinh trư ng: vitamin ch y u dùng ñ kích thích sinh trư ng c a vi sinh v t Tuy nhiên c n nh r ng, nhi u trư ng h p mơi trư ng thích h p cho s sinh trư ng c a vi sinh v t chưa h n thích h p đ sinh t ng h p enzyme Có mơi trư ng kìm hãm s tích lu sinh kh i t bào v n tăng cư ng sing t ng h p enzyme ð xác ñ nh thành ph n mơi trư ng dinh dư ng thích h p cho m i vi sinh v t có th ti n hành l a ch n s kinh nghi m ho c dùng phương pháp toán h c qui ho ch th c nghi m Khi l a ch n nguyên li u ñ chu n b môi trư ng c n ý r ng, nguyên li u t nhiên có ch a nhi u ch t khác nhau, k c nguyên t khống đa lư ng vi lư ng có c y u t sinh trư ng Do v y, nhi u trư ng h p không c n b sung thêm lo i mu i vô M t khác, nguyên li u r ti n v y thư ng dùng cơng nghi p đ s n xu t ch ph m enzyme t vi sinh v t Các nguyên li u t nhiên thư ng dùng ñ chu n b môi trư ng cám g o, b t ngơ, b t đ u tương, khơ l c ho c ph li u men bia, r ñư ng… Trong nguyên li u cám g o b t ngô ngu n cacbon t t nh t Còn n m men bia t phân, khô l c ngu n nitơ t t nh t Khi chu n b mơi trư ng cịn c n ph i ý ñ n ch t có tác d ng u hồ sinh t ng h p enzyme, ñ c bi t ch t c m ng ð i v i m i lo i enzyme có th có nhi u ch t c m ng ph i l a ch n ch t c m ng có hi u qu nh t Ví d ch t c m ng c a sinh t ng h p amylaza tinh b t, dextrin; c a proteaza protein có tr ng lư ng phân t nh S d ng ch t c m ng thư ng làm tăng ñáng k lư ng enzyme ñư c t ng h p Tuy nhiên, l a ch n ch t c m ng c n tính tốn c n th n v giá thành c a 5.3.2.3 Các phương pháp nuôi c y vi sinh v t: Có nhi u phương pháp khác đ ni vi sinh v t t ng h p enzyme Phương pháp b m t: Phương pháp thích h p đ ni lo i n m m c kh phát tri n c a nhanh, m nh nên t p nhi m • Qui trinh công ngh : Môi trư ng ph i tr n làm m h p ñánh tơi làm ngu i gieo m c gi ng vào thi t b nuôi vào phịng ni ni m c canh trư ng Các ch t dinh dư ng thư ng nguyên li u t nhiên ch t th i c a công ngh th c ph m ho c h n h p c a nhi u ch t Trong môi trư ng c n thêm ch t c m ng c n thi t cho s t ng h p enzym ho c b sung thêm ch t dinh dư ng ngu n nitơ, photpho nư c chi t ngô, khoai tây, d ch t phân n m men…ð b o ñ m ñ x p c a mơi trư ng c n có ch t làm x p tr u (10÷20%) Trư c gieo c y c n trùng mơi trư ng đ ñ m b o không b nhi m vi sinh v t l Q trình ni c y kéo dài t 33÷48h Có hi n tư ng: - Th i nhi t, c n gi to=28÷32oC - Gi m m, gi ϕphịng=96÷100% - Cung c p O2: trình m c phát tri n l y O2 th i CO2 c n cung c p không khí vơ trùng • Ưu c m c a phương pháp: Ưu: - Cho n ng ñ enzym cao so v i phương pháp b m t - Có th s y khơ nhanh chóng mơi trư ng (d ng thơ) mà khơng nh hư ng đ n ho t l c enzym - Tránh s nhi m trùng toàn b kh i canh trư ng - T n n Như c: - Khó gi i hố, t đ ng hố - Năng su t th p - T n nhi u lao ñ ng - T n nhi u m t b ng Phương pháp ni c y chìm: • V i phương pháp vi sinh v t phát tri n mơi trư ng l ng có s c khí khu y đ o liên t c Ngu n cacbon s d ng phương pháp tinh b t, ch t th i có ñư ng r ñư ng nguyên li u khác Ngu n nitơ hay dùng ch t h u cao ngô, d ch men bia, d ch thu phân, khơ l c…Ngồi thành ph n môi trư ng c n b sung thêm ch t khống Mơi trư ng c n ñư c trùng b ng cách s c tr c ti p to=121÷125oC th i gian 60÷90 phút đ i v i mơi trư ng ch a ngun li u b t, đ m thơ 20÷30 phút v i lo i mơi trư ng có ch a đư ng Trong q trình ni c y chìm c n ph i s c khí vơ trùng khu y ñ o liên t c N u có b t ph i dùng d u phá b t Th i gian t 1÷4 ngày tuỳ ch ng Ph i ý u ch nh pH • Ưu, c: + Ưu: - Ti t ki m di n tích - D gi i hố, t đ ng hố - S d ng h p lí ch t dinh dư ng, tránh lãng phí - Thu enzym t p ch t - ð m b o v sinh, vơ trùng nên nhi m vi sinh v t l + Như c: - N ng ñ enzym th p, c n làm ñ c canh trư ng trư c tách nên giá thàcao - T n n s c khí - N u khơng đ m b o vơ trùng s nhi m hàng lo t Phương pháp ni chìm bư c: - Bư c 1: vi sinh v t ni thi t b đ phát tri n t i ña - Bư c 2: chuy n sinh kh i sang thi t b khác ñ sinh t ng h p enzym 5.3.3 Tách tinh ch enzym: Trong th c t enzym ñư c s d ng nhi u d ng khác M t s lĩnh v c có th s d ng dư i d ng canh trư ng khô mà ch t lư ng s n ph m khơng thay đ i (như s n xu t rư u, công ngh thu c da) ða s ngành công nghi p (ch y u th c ph m công nghi p nh ) địi h i ph i s d ng ch ph m enzym s ch (g i ch ph m k thu t) Còn y h c ph i s d ng ch ph m enzym tinh t Tuy nhiên, cho ñ n chưa tìm đư c m t phương pháp chung đ tách m t enzym mà ph i ph i h p nhi u phương pháp khác Quá trình làm s ch enzym g m giai ño n chi t enzym tách enzym 5.3.3.1 Chi t enzym: M c đích c a cơng đo n tách enzym kh i canh trư ng sau lên men Quá trình ph thu c vào lo i enzym (ngo i bào hay n i bào) môi trư ng lên men (l ng ho c r n) mà ti n hành khác ð i v i enzym ngo i bào n m canh trư ng l ng ti n hành tách sinh kh i đ thu dung d ch có ch a enzyme N u enzym ngo i bào n m canh trư ng r n (x p) dùng nư c vơ trùng ho c dung d ch đ m thích h p đ chi t enzym ð thu enzym n i bào ph i ti n hành phá v t bào b ng m t phương pháp sau: - Phương pháp đ ng hố (nghi n máy đ ng hố) - Nghi n v i b t thu tinh, cát… - T phân - Làm l nh đơng tan giá l p ñi l p l i nhi u l n - Nh tác ñ ng c a siêu âm - Dùng áp su t th m th u cao - Phương pháp khuy ch tán Sau phá v t bào dùng nư c c t ho c dung d ch mu i loãng ho c dung d ch ñ m thích h p ñ chi t enzym 5.3.3.2 Tách enzym: M c đích c a giai đo n làm s ch tách enzym kh i h n h p ph thu c vào m c ñ tinh s ch c a ch ph m enzym mà trình tách r t khác Thu nh n ch ph m k thu t: Ch ph m enzym k thu t ch ph m enzym ñư c tinh ch sơ b có th ch a m t ho c vài enzym ch y u ð thu ch ph m enzym k thu t đ u tiên ph i đ c dung d ch enzym nhi t ñ 30oC cho ñ n ñ t n ng ñ 20g/lit Sau ti p t c nhi t đ 40oC cho đ t n ng đ 30÷50g/lit Khi có th cho thêm ch t b o qu n ho c ch t n ñ nh Ti p theo ñem s y phun v i nhi t đ khơng vư t q 70oC Ngồi đ thu ch ph m enzym k thu t ngư i ta có th k t t a b ng dung môi h u ho c mu i trung tính sau cho ch t n đ nh vào s y khơ r i nghi n Dung môi h u thư ng dùng rư u etylic, izopropylic, axeton…k t t a b ng dung môi h u d a nguyên t c thêm dung môi vào dung d ch enzym l c hút gi a phân t protein-enzym tích n phân t nư c bao quanh chúng b gi m Khi n ng đ dung mơi thêm vào đ t đ n m c làm cho lư ng hydrat hoá gi a phân t nư c protein nh lư ng liên h p gi a phân t protein-enzym lúc phân t proteinenzym liên h p l i t o k t t a Tuỳ theo tính ch t c a enzym dung môi h u mà m i m t lo i enzym ñư c k t t a m t n ng đ dung mơi khác Ví d proteaza k t t a etanol 76÷78%, α-amylaza k t t a etanol 70%, glucoamylaza k t t a etanol 45% axeton 70% Dùng dung môi h u có ưu m c t thu h i đư c Nhưng dung mơi d làm cho enzym b vô ho t ð kh c ph c c m ph i ti n hành k t t a enzym nhi t ñ th p (5oC) th i gian ng n Các mu i trung tính thư ng dùng đ k t t a enzym là: (NH4)2SO4, NaCl…tuỳ theo tính ch t t ng lo i enzym mà ngư i ta dùng n ng đ mu i khác Ví d amylaza thư ng k t t a (NH4)2SO4 n ng đ 0,75% đ bão hồ; glucoamylaza n ng đ 0,8÷0,9% đ bão hồ Phương pháp dùng mu i trung tính k t t a cịn g i diêm tích Phương pháp d a nguyên t c ion mu i có tác d ng phá v l p hydrat bao quanh phân t protein s hút phân t trái d u v phía K t qu làm phân t protein b m t nư c đơng t Sau k t t a ph i lo i mu i trung tính kh i enzym b ng phương pháp th m tích ð th c hi n ngư i ta cho enzym vào màng bán th m (xenlofan) r i cho vào dung d ch đ m thích h p ngâm 24 gi sau th l i n u ñã lo i h t mu i đưa x lí ti p Thu nh n ch ph m tinh t: ð thu nh n ch ph m tinh t ph i k t h p nhi u phương pháp qua nhi u giai ño n ð u tiên ph i ti n hành lo i b protein không ho t đ ng b ng phương pháp bi n tính ch n l c Các protein bi n tính có th tách b ng cách l c ho c ly tâm Sau enzym đư c k t t a b ng dung môi h u ho c mu i trung tính Ti p theo dùng s c kí (s c kí trao đ i ion, h p ph , phân b , gel phân t v.v ) ñ thu phân ño n enzym có ho t l c cao nh t Sau tinh ch xong ph i dùng phương pháp ñi n di ñ ki m tra m c ñ ñ ng nh t c a enzym 5.4 ðánh giá ch t lư ng c a enzym: 5.4.1 Phương pháp ñánh giá: Ch t lư ng c a enzym ñư c ñánh giá b ng m c đ ho t đ ng c a t c ho t ñ c a enzyme Th c t ngư i ta ño ho t ñ c a enzym thơng qua vi c xác đ nh lư ng ch t m t ñi hay lư ng s n ph m ñư c t o thành ph n ng V nguyên t c có th chia làm nhóm phương pháp xác đ nh ho t ñ enzym: ðo lư ng ch t b m t ñi hay lư ng s n ph m ñư c t o thành m t th i gian nh t ñ nh v i m t n ng ñ enzym xác ñ nh ðo th i gian c n thi t ñ thu ñư c m t lư ng bi n thiên nh t ñ nh c a ch t hay s n ph m ng v i m t n ng ñ enzym nh t ñ nh ðo n ng ñ enzym c n thi t ñ làm bi n ñ i m t lư ng ch t hay thu nh n m t lư ng s n ph m nh t ñ nh m t th i gian nh t ñ nh 5.4.2 ðơn v : ð ño ho t ñ c a enzym ngư i ta dùng ñơn v ho t ñ - ðơn v enzym qu c t (kí hi u UI): lư ng enzym có kh xúc tác làm chuy n hóa m t micromol ch t sau m t phút ñi u ki n tiêu chu n ( pHopt, toopt ñ i v i enzym c n xác ñ nh) - ðơn v Katal (Kat): lư ng enzym có kh xúc tác làm chuy n hoá m t mol ch t m t giây ñi u ki n tiêu chu n 1UI= -6 × 10 Kat=16,67 nKat (nanoKat) 60 - Ho t ñ riêng c a ch ph m enzym: s ñơn v UI ho c s ñơn v Kat ng v i 1ml ch ph m (n u dung d ch) ho c 1mg ch ph m (n u b t) N u enzym tinh s ch ho t đ đư c bi u th b ng s UI ho c s Kat 1mg enzym - Ho t ñ phân t : s phân t ch t ñư c chuy n hoá b i m t phân t enzym m t ñơn v th i gian 5.4.3 Nh ng ý ñánh giá ch t lư ng enzym: ð đánh giá xác đ ho t đ ng c a enzym xác đ nh ho t đ c a c n ý: - N ng ñ ch t ph n ng ph i m t gi i h n thích h p đ th a đ bão hồ enzym khơng q cao đ n m c kìm hãm enzym - V i nh ng enzym c n có ch t ho t hoá ho c ch t làm b n ph i cho ch t vào enzym trư c cho ch t vào ph n ng - Xác ñ nh ho t ñ c n ti n hành pHopt c ñ nh pH thư ng thay ñ i ph thu c vào ch t thành ph n dung d ch ñ m - Nhi t ñ dùng xác ñ nh ho t ñ ph i nh nhi t ñ t i ưu c a enzym đ đ phịng s kìm hãm c a enzym nhi t ñ cao - Th i gian xác đ nh ho t đ thư ng 5÷30 phút Nhưng có trư ng h p kéo dài ñ n 24 gi n u ho t ñ c a enzym th p Trong th i gian dài ph i cho thêm nh ng ch t di t khu n ñ tránh hi n tư ng t p nhi m 5.5 Enzym không tan: Enzym không tan hay cịn g i enzym c đ nh enzym n m m t không gian b gi i h n S gi i h n linh ho t c a enzym ñ t ñư c b ng cách ñưa vào m t pha cách li, tách r i kh i pha dung d ch t ñó v n có kh ti p xúc ñư c v i phân t ch t Pha ch a enzym thư ng không tan nư c có th polymer cao phân t ưa nư c 5.5.1 Ưu c ñi m c a enzym khơng tan: Ưu m: - Gi m giá thành có th s d ng l p l i nhi u l n m t lư ng enzym xác đ nh - Enzym khơng l n s n ph m tránh đư c nh hư ng khơng t t c a đ i v i s n ph m - Có th làm ng ng nhanh chóng ph n ng c n thi t - Enzym không tan b n enzym tan k t h p t n d ng y u t nhi t ñ , pH… - Dùng enzym c đ nh có th d dàng thay th trình lên men b ng ph n ng enzym t bào Như c m: Enzym khơng tan có ho t ñ riêng nh enzym tan 5.5.2 Phương pháp s n xu t enzym khơng tan: G m có phương pháp: 5.5.2.1 G n liên k t ñ ng hố tr : ða s enzym khơng tan đư c s n xu t b ng phương pháp Nó chia làm hai phương pháp g n enzym vào ch t khơng hồ tan ho c g n phân t enzym v i ñ t o thành đ i phân t khơng hồ tan G n phân t enzym vào ch t mang không hồ tan: • u c u v ch t mang: - Có đ hồ tan th p b n v ng v i tác ñ ng cơ, nhi t hoá h c - Các ch t mang khơng gây tác đ ng kìm hãm enzym - Khơng h p ph phi ch n l c ñ i v i protein - Nên háo nư c ch t mang k nư c có th gây c ch v i enzym ñư c mang - Vi c g n s có hi u qu n u ch t mang enzym có n tích trái d u • Nh ng ch t mang thư ng dùng: + Ch t mang h u cơ: polypeptit, polysaccarit, d n xu t c a xenlulo (DEAE-xenlulo: dietyl animoetyl xenlulo, CM-xenlulo: cacboxyl metyl xenlulo), d n xu t c a dextran (DEAE-sephadex, CM-sephadex) ho c agaroza (aga khác v i agaroza, thành ph n c a agaroza có g c sunfat) Ch t mang thơng d ng c detran có liên k t ngang g i sephadex agaroza d ng h t g i sepharoza Nói chung c lo i đ u có c u trúc l x p làm cho phân t l n có th xâm nh p vào gel m t cách d dàng Ngồi cịn có polymer t ng h p khác polyacrylamit, polysterol, polyamit + Ch t mang vô cơ: so v i ch t mang h u ch t mang vơ b n v nhi t, h c, hoá h c, vi sinh v t nh t khơng thay đ i c u hình c a khn thay đ i tính ch t c a mơi trư ng xung quanh Các ch t mang vô như: silicagen, pentonit, nhôm hydroxyt … G n enzyme v i Ngư i ta có th g n nh ng enzyme l i v i nh nh ng tác nhân ña hay lư ng ch c ñ t o thành nh ng đ i phân t enzyme khơng hồ tan V i phương pháp thu ñư c nhi u d n xu t enzyme khơng tan, ví d thu d n xu t tripxin không tan b ng cách dùng andehyt glutaric (OHC-(CH2)3-CHO) 1% ñ liên k t phân t enzyme Phương pháp có ưu m: - Ít t n th t enzyme gi i phóng mơi trư ng - Tăng kh ch ng ch u c a enzyme ñ i v i y u t bi n tính nên đưa vào s n xu t ñư c Như c ñi m c a phương pháp s enzyme c đ nh 5.5.2.2 “Gói”enzyme khn gel Ph i ti n hành trùng h p hố gel đ ng th i v i s có m t c a enzyme Sau enzyme đư c gi l i gel gel có enzyme có th làm nh b ng cách nghi n máy ñ ng hoá ho c ép qua l rây r i ñem s y khô nhi t ñ không 400C Có th “gói” enzyme b ng phương pháp sau: - Các gel đư c hình thành s polymer hoá t ng h p - Các enzyme b nh t l nh c a s i t ng h p - Gói bao vi th - Phương pơháp ti n polymer 5.5.2.3 Phương pháp h p ph v t lí Phương pháp h p ph v t lí khơng thơng qua liên k t hố tr g n enzyme ch t mang Quá trình th c hi n h p ph đơn gi n: ch t h p ph enzyme ñư c tr n l n v i m t kho ng th i gian cho phép s h p ph x y nh tương tác c a liên k t ion, k nư c, hydrogen l c Van der Wals Phương pháp có c m q trình gi i h p ph enzyme d dàng x y b i s thay ñ i pH, nhi t ñ thành ph n ion 5.5.3 M t s tính ch t c a enzyme khơng tan: - Enzyme khơng tan có ho t đ riêng nh enzyme tan - Enzyme khơng tan tuân theo ñ nh lu t Michaelis Menten (s nh hư ng c a n ng ñ ch t đ n ho t tính enzyme) Tuy nhiên có hi n tư ng c nh tranh gi a ch t ch t mang, hi n tư ng khuy ch tán nên có nh ng sai khác ñáng k v t c ñ ph n ng c a enzyme: ch t mang ch t tích n cùnh d u Khơngm khơng tan > Km tan, n u tích n trái d u ngư c l i (Km - H ng s Michaielis) - Enzyme khơng tan có tính b n nhi t cao enzyme tan - Enzyme khơng tan có s d ch chuy n pH t i ưu sang mi n ki m ho c axit so v i enzyme tan - Enzyme không tan có th i gian b o qu n lâu b n v i ch t kìm hãm tác nhân gây bi n tính CHƯƠNG VI: S N XU T AXIT H U CƠ Axit h u ñư c s d ng r ng rãi ch bi n b o qu n th c ph m công ngh vi sinh v t Chính th mà hi n axit h u ñư c nghiên c u s xu t r ng rãi 6.1 Các phương pháp s n xu t axít h u cơ: ð s n xu t axít h u ngư i ta có th dùng nhi u phương pháp khác như: - Phương pháp t ng h p hoá h c - Phương pháp chi t tách t nguyên li u th c v t - Phương pháp sinh t ng h p nh vi sinh v t Trong phương pháp phương pháp sinh t ng h p nh vi sinh v t r t có ý nghĩa trình s n xu t nhanh, s d ng nguyên li u s n có r ti n có th t o đư c nhi u lo i axít h u khác 6.2 K thu t s n xu t m t s axít h u nh vi sinh v t: 6.2.1 S n xu t axít axetic: Axit axetic có th thu nh n b ng cách lên men ñư ng ho c oxy hố rư u etylic Sau xét q trình s n xu t axit axetic t rư u etylic Ch ng vi sinh v t: ð oxy hố rư u etylic thành axít axetic ngư i ta có th s d ng nhi u lo i vi khu n khác Nhưng s d ng nhi u c ch ng vi khu n: Bacterium schuzenbachi, Bacterium curvum Các lo i vi khu n có kh oxy hóa r t l n Phương trình lên men: CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2O + Q K thu t lên men: Có th s d ng phương pháp lên men liên t c ho c gián đo n ð q trình lên men ti n tri n đư c t t c n ý ñi m sau: - Nguyên li u h n h p dinh dư ng: có th s d ng c n thô ho c c n tinh ch đ làm mơi trư ng Theo kinh nghi m cho th y s n xu t t c n thơ nh ng sai khác đáng k v t c ñ ph n ng c a enzyme: ch t mang ch t tích n cùnh d u Khơngm khơng tan > Km tan, n u tích n trái d u ngư c l i (Km - H ng s Michaielis) - Enzyme khơng tan có tính b n nhi t cao enzyme tan - Enzyme khơng tan có s d ch chuy n pH t i ưu sang mi n ki m ho c axit so v i enzyme tan - Enzyme khơng tan có th i gian b o qu n lâu b n v i ch t kìm hãm tác nhân gây bi n tính CHƯƠNG VI: S N XU T AXIT H U CƠ Axit h u ñư c s d ng r ng rãi ch bi n b o qu n th c ph m cơng ngh vi sinh v t Chính th mà hi n axit h u ñư c nghiên c u s xu t r ng rãi 6.1 Các phương pháp s n xu t axít h u cơ: ð s n xu t axít h u ngư i ta có th dùng nhi u phương pháp khác như: - Phương pháp t ng h p hoá h c - Phương pháp chi t tách t nguyên li u th c v t - Phương pháp sinh t ng h p nh vi sinh v t Trong phương pháp phương pháp sinh t ng h p nh vi sinh v t r t có ý nghĩa q trình s n xu t nhanh, s d ng nguyên li u s n có r ti n có th t o đư c nhi u lo i axít h u khác 6.2 K thu t s n xu t m t s axít h u nh vi sinh v t: 6.2.1 S n xu t axít axetic: Axit axetic có th thu nh n b ng cách lên men đư ng ho c oxy hố rư u etylic Sau xét q trình s n xu t axit axetic t rư u etylic Ch ng vi sinh v t: ð oxy hoá rư u etylic thành axít axetic ngư i ta có th s d ng nhi u lo i vi khu n khác Nhưng s d ng nhi u c ch ng vi khu n: Bacterium schuzenbachi, Bacterium curvum Các lo i vi khu n có kh oxy hóa r t l n Phương trình lên men: CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2O + Q K thu t lên men: Có th s d ng phương pháp lên men liên t c ho c gián ño n ð q trình lên men ti n tri n đư c t t c n ý m sau: - Nguyên li u h n h p dinh dư ng: có th s d ng c n thơ ho c c n tinh ch đ làm môi trư ng Theo kinh nghi m cho th y s n xu t t c n thơ axit có mùi m nh hơn, nhiên c n thơ có ch a nhi u d u fuzen nên nh hư ng x u đ n q trình lên men ð cho vi khu n ho t ñ ng t t mơi trư ng ngồi nư c, rư u, axit axetic cịn ph i có mu i khoáng, hydrat cacbon h p ch t ch a nitơ d h p th - N ng ñ rư u axit axetic: n ng ñ rư u thích h p ph thu c vào d nh vi khu n s d ng Nói chung gi i h n cao nh t c a n ng ñ rư u 15% Khi môi trư ng lên men h t rư u vi khu n s s d ng axit Do đó, đ tránh hi n tư ng thi t b lên men đ l i m t rư u (0,3÷0,5%) Mơi trư ng có ph n ng axit r t thích h p cho ho t ñ ng c a vi khu n axetic Tuy nhiên axit tich lu nhi u s nh hư ng ñ n ho t ñ ng c a vi khu n ð b o toàn tính thu n t c a vi khu n ch ng s phát tri n c a vi sinh v t l , ñ ng th i b o đ m cho q trình lên men ti n tri n bình thư ng nên ti n hành lên men n ng ñ axit axetic kho ng 10% - S thơng khí: s oxy hố rư u ch x y vi khu n ti p xúc tr c ti p v i oxy c a không khí Do đó, s có m t nhi u oxy s t o ñi u ki n thu n l i cho q trình lên men Theo lí thuy t đ lên men kg rư u khan c n 2,3 m3 khơng khí - Nhi t đ : nhi t đ có ý nghĩa l n đ i v i trình lên men axetic Nhi t ñ 6÷100C m c t i thi u ñ i v i vi khu n axetic, n u nhi t đ th p n a ho t ñ ng s ng c a vi khu n s b ng ng nhi t đ nh 12÷150C vi khu n sinh s n ch m, kho ng 15÷340C chúng s phát tri n bình thư ng sinh s n nhanh chóng Khi nhi t đ th p q trình lên men s di n ch m ch p, ngư c l i, nhi t đ q cao rư u axit axetic s b c nhi u s gây t n th t l n s n xu t Nhi t đ thích h p c a loài vi khu n khác khơng gi ng ð i v i Bacterium schuzenbachi thích h p nh t nhi t đ 280C Cịn Bacterium curvum 35÷370C nhi t đ cao cư ng đ sinh s n s t o axit b t ñ u gi m Thu nh n s n ph m: Sau lên men xong dung d ch axit ph i ñư c làm l c ð làm thư ng s d ng m t s ch t gelatin, than ho t tính Sau x lí b ng ch t đ n vài ba ngày cho l ng c n ti p theo ñưa h n h p ñi l c Sau l c dung d ch axit r t n ng nên ph i tang tr nh t tháng m i ñem s d ng Mu n làm d m pha lỗng đ n n ng đ u c u r i ñem l c l n n a ð gi ñư c ch t lư ng c a d m có th trùng ho c s d ng ch t b o qu n Ngoài ra, m t s trư ng h p ñ nâng cao n ng ñ c a axit ngư i ta có th ti n hành chưng c t h n h p sau lên men ñ thu h i axít axetic 6.2.2 S n xu t axít lactic: Ch ng vi sinh v t: S d ng vi khu n lactic lên men n hình thích nghi Thư ng hay s d ng ch ng Lactobacillus Delbruckii Phương trình lên men: C6H12O6 2C3H6O3 + Q nhi t ñ cao E C6H12O6 2NAD+ 2NADH2 2CH3COCOOH 2CH3CHOHCOOH E Sơ ñ 6: Cơ ch t ng h p axit lactic t bào vi sinh v t K thu t lên men: ð chu n b môi trư ng lên men có th s d ng r ñư ng ho c lo i nguyên li u khác ð vi khu n phát tri n ñư c c n b sung thêm vào mơi trư ng m t s ch t dinh dư ng khác Có th ti n hành lên men b ng phương pháp liên t c ho c gián ño n Lên men nhi t ñ 500C ph i n ñ nh m t cách nghiêm ng t Gi m nhi t ñ lên men s làm cho ho t l c lên men y u làm phát tri n vi sinh v t l Ngư c l i, tăng nhi t đ s làm vơ ho t enzyme làm ch m trình lên men Quá trình sinh t ng h p axít lactic thích nghi pH axít y u (6,3÷6,5) Tuy nhiên, lên men tích lu axit nên làm cho n ng đ axit c a môi trư ng tăng lên N u ñ pH th p s kìm hãm s t o thành axít lactic q trình lên men s ng ng trư c t t c ñư ng chuy n thành axit lactic Do q trình lên men ph i luôn gi pH m c thích h p Ngư i ta thư ng dùng mu i canxi (CaCO3) đ trung hồ t o canxilactat (Ca(C3H5O3)2) Thu nh n s n ph m: Sau lên men ngư i ta ti n hành x lí đ thu h i dung d ch canxilactat ñem k t tinh Ti p theo làm nóng ch y tinh th canxilactat dùng H2SO4 ñ chuy n thành CaSO4 C3H6O3 nhi t ñ 60÷700C: Ca(C3H5O3)2 + H2SO4 = CaSO4 + 2C3H6O3 Ti p theo ti n hành tách dung d ch axit kh i h n h p Sau ph i tách s t làm dung d ch b ng than ho t tính r i li tâm tách t p ch t Mu n nâng cao n ng đ axít đem dung d ch ñã làm s ch s y chân không B ng cách v y có th nâng cao n ng ñ axit lên ñ n 70% 6.2.3 S n xu t axít citric: Axit citric có nhi u m t s lo i qu cam, chanh, dâu tây.v.v L n ñ u tiên axit citric ñư c s n xu t b ng cách t d ch qu chanh Hi n axit citric ñư c s n xu t b ng phương pháp lên men nh tác d ng c a n m m c Axit citric ñư c s d ng r ng rãi công ngh th c ph m ñ s n xu t nư c gi i khát, ñ h p, ho c ñư c s d ng công nghi p d t, ñi n nh, y dư c… Ch ng vi sinh v t: Thư ng s d ng Asperillus niger đ sinh t ng h p axít citric Cơ ch t ng h p: C6H12O6 ↓ CH3COCOOH CH3CHO + CO2 ↓ CH3COOH -2H CH2COOH -2H CHCOOH +H CH2COOH -2H O→   CH2COOH CHCOOH CHOHCOOH Axit xuxinic ax.fumaric ax.malic oxalacetat CH2COOH  COCOOH  COCOOH + CH3COOH COOH HOOCCH2C–CH2COOH OH Axit citric Sơ ñ 7: Cơ ch t ng h p axit citric t bào vi sinh v t Phương trình lên men t ng quát: C6H12O6 + 3O2 = 2C6H8O7 + 4H2O K thu t lên men: Nguyên li u dùng ñ chu n b mơi trư ng có th r đư ng, d ch thu phân tinh b t ho c có th lo i nguyên li u khác Trong mơi trư ng ngồi đư ng cịn c n ph i có ch t cung c p nitơ, photpho, kali, k m m t s nguyên t vi lư ng khác Q trình tích lu axit citric thích nghi mơi trư ng có pH axit Tuy nhiên tích lu nhi u axit pH c a môi trư ng s gi m nhi u Do v y c n có bi n pháp đ gi pH m c thích h p S thơng khí cho mơi trư ng r t quan tr ng t t c mixen c a n m m c lo i hi u khí n hình Trong trình phát tri n c a n m m c địi h i m t lư ng oxy r t l n Nhi t đ thích h p cho n m m c Aspergillus niger 31÷370C nhi t đ 34÷370C sinh kh i n m m c phát tri n m nh, cịn 31÷320C axit t o nhi u N u nhi t ñ th p phát tri n sinh kh i b ch m s t o thành axit citric b gi m mà s tích lu axit gluconic l i tăng Cịn nhi t đ cao sinh kh i phát tri n nhanh trình t o axit b kìm hãm Thu nh n s n ph m: Dung d ch sau lên men m t h n h p g m nhi u axit, ch y u axit citric, gluconic oxalic Quá trình tách axit citric g m bư c: - Trung hoà dung d ch sau lên men: C6H8O7 + 3Ca(OH)2 = Ca3(C6H5O7)2 + 6H2O Axit citric Canxi citrate 2C6H12O7 + Ca(OH)2 = Ca(C6H11O7)2 + 2H2O Axit gluconic Canxi gluconat C2H2O4 + Ca(OH)2 = CaC2O4 + 2H2O Axit oxalic Can xxi oxalate - Tách r a k t t a thi t b l c chân không - Chuy n canxi citrate thành axit citric: Ca3(C6H5O7)2 + 3H2SO4 = 2C6H8O7 + 3CaSO4 Chú ý: ph i s d ng dư axit sunfuric - Tách dung d ch axit thi t b l c chân không - S y dung d ch axit thi t b s y chân không - K t tinh ñ thu nh n tinh th axit - Li tâm ñ tách tinh th Sau li tâm s thu nh n ñư c tinh th axit citric có đ m 2÷3% s đem s y khơ nư c có ch a axit đư c s d ng vào m c đích khác - S y tinh th : có th dùng thi t b s y thùng quay ho c s y băng t i S y nhi t đ khơng vư t q 350C N u s y nhi t đ cao tinh th c a axit b phá hu Trư c ñưa ñi ñóng gói c n ph i cho axit qua sàn ñ lo i b nh ng t p ch t tình c rơi vào ... ngành như: - Công ngh di truy n - Công ngh nuôi c y mô t bào - Công ngh enzyme - Công ngh vi sinh v t… Trong h c ph n s nghiên c u v m t s ph n c a cơng ngh vi sinh v t Các q trình vi sinh ñư c... y, công nghi p dư c cơng nghi p hố h c, chuy n hoá sinh kh i thành lư ng, x lý ph li u ph li u công nông nghi p, phịng ch ng nhi m v sinh môi trư ng… - Công ngh sinh h c ñã giúp cho chương trình. .. ph m c a công ngh vi sinh v t Các s n ph m lên men cơng nghi p đư c phân lo i theo tiêu chu n sinh lí trao đ i ch t S phân lo i d a vào s n ph m c a q trình lên men trình s n xu t nh vi sinh v