LỜI MỞ ĐẦU: Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm, lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Protease là một trong những enzyme được ứng dụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực, trong đó, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm Protease đã có những đóng góp rất to lớn trong việc phục vụ, nâng cao đời sống của con người. Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm fomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Vì tầm quan trọng của protease trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong công nghệ thực phẩm, nên tôi chọn ”Tìm hiểu về protease và ứng dụng của protease trong công nghệ chế biến thịt” làm đề tài đồ án. 1 PHẦN I: TỔNG QUAN ENZYME PROTEASE 1.1. Giới thiệu enzyme protease 1.2.1. Định nghĩa [2] Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự. 1.2.2. Phân loại [1] Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống phân loại các nhóm enzyme. Protease được phân chia thành hai loại: Endopeptidase và exopeptidase; Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptit, exopeptidase được phân chia thành hai loại: - Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptit ở đầu N tự do của chuỗi polypeptit để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptit. - Carboxypeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi polypeptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptid. Dựa vào sự có mặt của các nhóm chức năng ở trung tâm hoạt động, các protease được chia làm 4 nhóm sau: 2 Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptide - Serine protease: Là những protease có nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động, có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xác tác của enzyme. - Nhóm này bao gồm tripsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. - Cysteine protease: Các protease có nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cysteine protease bao gồm protease thực vật như: papain, actindin, bromelin, một vài protease động vật và protease lý sinh trùng. Các Cysteine protease thường hoạt động mạnh ở pH trung tính, có tính đặc hiệu rộng và chỉ hoạt động khi nhóm –SH trong trung tâm hoạt động của nó bị bao vây. - Aspartic protease: hầu hết các Aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin, renin, các protease của nấm mốc. Các Aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động ở pH trung tính. - Metallo protease: Metallo protease là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao. Các Metallo protease thường hoạt động mạnh nhất ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm dưới tác dụng của EDTA. Người ta cũng có thể dựa vào vùng pH hoạt động tối thích để phân thành các protease acid tính (pH<6), kiềm tính (pH 8-11) và trung tính (pH 6- 7,5). Tuy nhiên, cách phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng, không thật sự chính xác vì pH tối thích của mỗi enzyme còn phụ thuộc vào bản chất cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa. 1.2.3. Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của protease [2] 3 Trong TTHĐ của protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số Protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau: - TTHĐ của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc acid amin và trong một số trường hợp còn có cả kim loại. + Các protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 21 0 A, có thể phân biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng với mỗi gốc amino acid trong phân tử cơ chất. + Đối với các protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh thể Protease acid của Phizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho thấy phân tử các protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 20 0 A. Khe hở này là phần xúc tác của các enzyme, các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy. - Đối với các protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide. Mặc dù TTHĐ của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau: Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, E- S: Phức chất enzym- cơ chất, P 1 : Là sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P 2 : Là sản phẩm thứ hai của phản ứng. 1.2.4. Đặc tính của enzyme 4 E + S E– S E– S + P 1 E + P 2 Hình 1.2 Cơ chế xúc tác TTHĐ Enzyme Phần lớn protease của vi khuẩn chỉ hoạt động trong một khoảng pH hẹp còn protease của nấm mốc thì ngược lại, có nhiều loài rất khác nhau và cá thể hoạt động trong phạm vi pH rộng. Dựa vào khoảng pH tối thích người ta chia chúng làm nhiều loại: [1],[3] - Protease acid: pH ≤ 3 [3], pH < 6 [1] - Protease trung tính: 6-7,5 - Protease kiềm : 8-11 Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa 1 trong 2 loai endo và exoprotease. Còn vi sinh vật có khả năng sinh ra là 2 loại trên do đó protease của vi sinh vật có tính đặc hiệu khác thường, chúng có thể phân hủy tới 80% các liên kết peptid có trong phân tử protein. Nó không những phá hủy hoàn toàn và nhanh chóng các liên kết peptid còn có khả năng phá hủy chậm một số liên kết không đặc trưng khác. Như vậy trong từng trường hợp cụ thể của sự thủy phân protein, cần nghiên cứu chọn lọc loài vi sinh vật và những điều kiện tối ưu cho hoạt độ protease của nó.[3, 271] 1.2.5. Ứng dụng enzyme protease 1.1.5.1. Ứng dụng trong y dược [6] Dùng enzyme làm thuốc, ví dụ protease làm thuốc chống tắc nghẽn tim mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa protein và một sốloại thuốc dùng trong da liễu và mỹ phẩm… 1.1.5.2. Công nghiệp thực phẩm:  Protease với công nghiệp thịt: Việc sử dụng protease trong chế biến làm mềm thịt là ứng dụng có tính truyền thống. Nhân dân ta từ rất lâu đã dùng thơm để chế biến thịt bò, nấu chân giò với đu đủ xanh, kết hợp thức ăn nhiều thịt với đu đủ để trị chứng khó tiêu hóa và táo bón…mà thực chất là sử dụng 5 các enzyme papain, bromelain, ficin. Người Nga còn dùng protease từ hạt đậu tương nẩy mầm để làm mềm thịt. Ngoài khả năng phân giải để làm mềm thịt, tạo thức ăn dễ tiêu hóa, công nghệ sản xuất các loại dịch thủy phân giàu protein đã được áp dụng một cách có hiệu quả bởi tính năng của protease. [1]  Công nghệ chế biến sữa: Enzyme là một công cụ để chế biến các phế liệu của công nghiệp thực phẩm thành thức ăn cho người và vật nuôi. Người ta còn khai thác tính đông tụ sữa của renin, pepsin vào công nghiệp sản xuất phomat.  Trong công nghiệp sản xuất bia rượu - Tăng tỉ lệ nguyên liệu thay thế - Giảm thời gian lên men - Hiệu suất thu hồi tăng - Bia, rượu thành phẩm đạt các chỉ tiêu quy định tốt hơn khoảng 30% - Nâng cao hiệu quả kinh tế, giảm chi phí sản xuất.[4]  Trong công nghệ sản xuất nước chấm - Sử dụng enzym từ các nguồn tự nhiên: + Động vật: trong nội tạng của gia súc có hiện diện nhiều enzym thủy phân protease như: pepsin, tripsin, cathepsin. + Thực vật: có một vài loại thực vật cũng có enzym protease như trong đu đủ có enzym papain, dứa có enzym bromelin. + Vi sinh vật: trong quá trình hoạt động sống nhiều hệ enzym sinh ra từ nấm mốc Aspergillus oryzae, Asp. niger. - Phương pháp sử dụng + Sử dụng dưới dạng thô: cho các nguyên liệu có enzym đó vào chượp với tỉ lệ nhất định. 6 + Sử dụng dưới dạng chiết xuất: chiết enzyme từ các nguyên liệu trên thành dạng tinh chế sau đó cho vào trong chượp. 1.1.5.3. Công nghiệp thuộc da Trong công nghiệp da, enzyme protease được dùng để làm mềm da, làm sạch lông và da, rút ngắn thời gian, tránh ô nhiễm môi trường. Việc xử lý đã được tiến hành bằng cách ngâm da trong dung dịch enzyme, hay phết dịch enzyme lên bề mặt da. Enzyme sẽ tách các chất nhờn và làm đứt một số liên kết trong phân tử collagen làm cho da mềm hơn. Thực tế cho thấy khi xử lý da bằng chế phẩm protease từ vi sinh vật có thể rút ngắn thời gian làm mềm và tách lông xuống nhiều lần. Điều quan trọng là chất lượng lông tốt hơn sau khi xử lý. So với phương pháp hóa học thì việc xử lý bằng enzyme có số lượng lông tăng 20-30%. Lông không cần xử lý thêm sau khi ngâm trong dịch enzyme. [6] 1.1.5.4. Trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa - Công dụng của protease là phân hủy vết bẩn dạng protein trên vải. - Tên thương mại: Savinase và Relase. - Proteaza có tác dụng tẩy rửa các vết bẩn như máu, lòng đỏ trứng, sữa, nước rau, đậu, nước xốt thức ăn,… và chỉ có hoạt tính trong dung dịch giặt. - Enzyme có những tác dụng như sau khi được sử dụng trong chất tẩy rửa: + Giúp tăng hiệu quả của việc giặt tẩy. + Giảm thời gian giặt nhờ khả năng phân hủy vết bẩn nhanh + Giảm năng lượng tiêu thụ do có thể giặt ở nhiệt độ thấp. + Giảm lượng nước tiêu thụ do hiệu quả giặt rửa cao. + Giảm ảnh hưởng đối với môi trường vì enzym là chất có thể phân hủy sinh học. + Tăng độ trắng và chống chất bẩn bám trở lại. [4] 7 1.1.5.5. Trong sản xuất tơ tằm - Quá trình làm sạch tơ sợi tự nhiên tương đối phức tạp và khó khăn - Sợi sau khi kéo kén thường có khoảng 30% xerixin. Muốn tách xerixin phải nấu trong dung dịch xà phòng. Một lượng nhỏ xerixin nằm lại ở trên lụa sẽ làm giảm độ đàn hồi của lụa. - Để tách lượng xerixin còn lại người ta thường dùng chế phẩm protease từ nấm mốc, vi khuẩn. [6] 1.1.5.6. Trong hương phẩm, mỹ phẩm Hiện nay, một số nước sản xuất những loại kem chứa enzyme để xoa mặt, xoa tay, cạo râu… Dưới tác dụng của protease trong kem, các biểu bì da đã chết tách ra, da non và mới sẽ xuất hiện trên bề mặt, sự phát triển của lông, tóc, chậm lại.[6] 1.2. Nguồn thu nhận enzyme protease Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ). 1.2.1. Thực vật Enzyme protease được lấy từ nguồn thực vật được sử dụng nhiều nhất là: papain (đu đủ), bromelin ( dứa), Ficin (sung), Keratinase. 1.2.1.1. Enzyme papain  Cấu tạo hóa học và tính chất của papain Papain là một endoprotease có chứa 16,1 % N và 1,2% S. Papain là một protease thiol. Papain là một chuỗi polypeptide gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 Dalton.[2] Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của trái đu đủ chín (tính trên 100g) [6] Thành phần Hàm Thành Hàm Thành phần Hàm 8 lượng phần lượng lượng Nước( %) 89 Calcium (mg) 24 Natri (mg) 3 Năng lượng (cal) 55 Sắt (mg) 0,1 Niacin (mg) 0,34 Protein (g) 0,61 Phosphor (mg) 5 Panto acid (mg) 0,22 Chất béo (g) 0,14 Kali (mg) 257 Vitamin A (IU) 1094 Carbohydrate (g) 9,8 Magie (mg) 10 Vitamin E (mg) 0,73 Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi 212 amino acid, trong đó không chứa methionine. Phân tử lượng là 23.350 Da, phân tử của nó là một polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành ba cầu disulfur ở các vịtrí 22-63, 56- 95, 153-200, không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính chất bền vững của cấu trúc và một nhóm -SH tự do ở vị trí 25. Thành phần chính của papain chưa hoạt hóa là hỗn hợp protein disulfurcysteine. Khi hoạt hóa papain bằng KCN sẽ giải phóng ra nhóm thiol của enzyme và β-thio cyanatalanine do sự tương tác giữa cyanur và cysteine. Sau đó, β-thio cyanatalanine khép vòng tạo thành α-iminotiazolidin. Khi có oxy không khí, cơ chế trên xảy ra theo chiều ngược lại, tức là cystein kết hợp với nhóm sulfurhydride của papain hoạt hóa tạo thành sản phẩm không hoạt hóa.  Cấu trúc không gian [2] Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các amino acid, đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase. So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất 9 rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxyl tự do. Papain có thể nhận biết một chuỗi gồm 7 amino acid trên cơ chất peptide của mình và sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên một chuỗi có phenylalanine như sau: nếu peptide có dạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papain sẽ cắt tại vị trí giữa Y và Z, nhưng nếu peptide có dạng X-Phe-Y (có Phe nằm ở vị trí thứ hai trước đầu tận cùng) thì không được thủy phân bởi papain. Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và transferase.  Hoạt hoá papain: [2] Papain chỉ thể hiện hoạt tính xúc tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do. Vì vậy ta phải sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động. Do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có tính khử như cysteine, glutation acid, hydrocyanic… Trong đó cysteine là chất hay dùng nhất. Khi có mặt các chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ.  Bất hoạt: [2] - Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxi hoá như: O 2 , O 3 , H 2 O 2 , iodur acetate, cystine và các hợp chất disulfur khác. Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain và làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó. - Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp. 10 [...]... chất Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt đông thích hợp,…Các nhà khoa học đã phân loại các proteinase vi sinh vật thành 4 nhóm như sau: Protease- serine, protease- thiol, protease- kim loại, protease- acid Một số tác giả khác chia protease ra 3 nhóm, dựa vào pH hoạt động của chúng bao gồm: protease- acid, protease trung tính, protease kiềm 26 Trong bốn nhóm protease kể trên, các protease- serine và protease- thiol... Pen.chrysogenum Hai Protease: Protease acid và ……vv Protease kiềm Protease acid có tác dụng làm đông sữa Protease acid có tác dụng làm đông sữa đã được dùng ở Nhật để thay thế cho rennin 1.2.3.2 Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật Các công trình nghiên cứu protease vi sinh vật ngày càng nhiều Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh vật cũng có thể khác nhau về nhiều... nhận enzym protease Nhiều VSV có khả năng tổng hợp mạnh protease Các enzym này có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy Một số protease nội bào đã sản xuất theo quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp ,trong nông nghiệp và y học - Nguồn vi sinh vật thu nhận enzyme protease chủ yếu gồm: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn  Vi khuẩn [2] Lượng protease sản... giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với các dẫn xuất của amino acid Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này... tác dụng trên 27 các cơ chất phân tử lớn tính đặc hiệu của các enzyme này cũng đựơc xác định bởi tương tác thứ cấp Các protease vi sinh vật mới được nghiên cứu từ năm 1960 Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng protease trong thực tế 1.2.3.3 Các phương pháp thu nhận enzym protease [2] Để thu nhận chế phẩm protease. .. nhất là proteaseserine Các protease- serine có trọng lượng vào khoảng 20.000-27.000 dalton.Tuy nhiên, cũng có một số protease- serine có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme của Penicillium cyoneo-fulvum (44.000) Trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease- serine (vào khoảng 33.800-48.400) Protease- thiol và nhiều loại protease- acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng... có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của bromelin và mức độ kìm hãm thay đổi nồng độ của muối Ngoài ra, còn có những chất có tác động ức chế bromelin do chúng kết hợp với nhóm SH của trung tâm phân ứng của enzyme [2]  Phương pháp lấy enzyme Bromelin từ cây dứa [2] Enzyme bromelin có thể thu được trong thân, trong phần thịt quả và trong chồi quả Việc thu nhận và tinh sạch bromelin có thể thực hiện... acid có 5 protease, hai Str.reetus Peptidase (lơxinamino_peptidase, 25 var.pro-teolyticus cacboxypeptidase), hai protease: Nấm Asp.oryzae protease- serin Protease- kim loại protease serin,có mốc Asp.satoi ba loại: Protease acid, protease Asp.awamori tung tính, Protease kiềm Protease Asp.niegr acid (aspergilopepti-dase A) Asp.shirousami Protease acid Asp.fumigatus Hai Protease acid Asp.tericola Protease. .. Pepsin ở cả hai dạng: kết tinh và thô (pepsin thô là hỗn hợp của pepsin, gelatin và cathesin) Điểm đẳng điện của pepsin ở gần pH = 1 Pepsin thủy phân protein trong vùng acid khá rộng, từ 1 - 4 pH hoạt động tối ưu của pepsin thay đổi tùy theo bản chất và trạng thái của cơ chất, thường pH trong khoảng từ 1.9 – 2.2 Với cơ chất là protein biến tính, pH tối ưu của hoạt tính xúc tác của pepsin hơi chuyển vùng... giai đoạn quan trọng nhất và khó khăn nhất trong kỹ thuật sản xuất chế phẩm enzyme Ở Nhật Bản đã tìm được phương hướng thích hợp để 29 làm trong nước chiết và dịch môi trường nuôi cấy Theo các tác giả Nhật thì nên lọc chứ không nên ly tâm vì khi ly tâm thường làm giảm đáng kể hoạt độ enzym PHẦN II: TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU THỊT 2.1 Thành phần hóa học và cấu trúc của thịt Thịt gia súc được cấu tạo bởi . Vì tầm quan trọng của protease trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong công nghệ thực phẩm, nên tôi chọn Tìm hiểu về protease và ứng dụng của protease trong công nghệ chế biến thịt làm đề tài. một sốloại thuốc dùng trong da liễu và mỹ phẩm… 1.1.5.2. Công nghiệp thực phẩm:  Protease với công nghiệp thịt: Việc sử dụng protease trong chế biến làm mềm thịt là ứng dụng có tính truyền thống có hiệu quả bởi tính năng của protease. [1]  Công nghệ chế biến sữa: Enzyme là một công cụ để chế biến các phế liệu của công nghiệp thực phẩm thành thức ăn cho người và vật nuôi. Người ta còn