Đang tải... (xem toàn văn)
Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm PHƯƠNG PHÁP PCR Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm PHƯƠNG PHÁP PCR Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm PHƯƠNG PHÁP PCR Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm PHƯƠNG PHÁP PCR Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm PHƯƠNG PHÁP PCR Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm PHƯƠNG PHÁP PCR Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm PHƯƠNG PHÁP PCR Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm PHƯƠNG PHÁP PCR Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm PHƯƠNG PHÁP PCR Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm PHƯƠNG PHÁP PCR Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm PHƯƠNG PHÁP PCR Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm PHƯƠNG PHÁP PCR Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm PHƯƠNG PHÁP PCR
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm GVHD: Nguyễn Thị Mỹ Lệ Lớp: 01DHTP3 PHƯƠNG PHÁP PCR ! "# $%&! ! "'( )*#+ GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP POLYMERASE CHAIN REACTION(PCR) PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH SALMONELLA SPP., SALMONELLA ENTERICA TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI !"#$!#%!#&' (%) • %*+,-'./0-1)23-4(567-1&89:*+,--1;-725<2=>8?2@> #AB:'(<CA)D89*-**-1<CA) *+&$,"# /012& • E1::A0*,A7FGH/-+I+JK • L2M2)@-C)<N:0 O0*)-/I+JJ)-*-7* • E1::A0*,A7FGH/-+I+JK • L2M2)@-C)<N:0 O0*)-/I+JJ)-*-7* 3 @):'(:P/2)@52Q-R-S58967-1&.AT)@-2, D5U):+N1AN23-4(A(+P<4A 45&&6# % &72& 89:& 9;% V(895W=<?--1;-7:N)X6ND2)@YZ+@2)@=#23-?-8?+$ ):):N)X6N V(895W=<?--1;-7:N)X6ND2)@YZ+@2)@=#23-?-8?+$ ):):N)X6N [)@5=#<CC+T\)]-*+@2.>=O/Q+$F+$\9>+$'(H 2)@+$]23\/2/23+<]-2=-4(5 2)@+$]23\/2/23+<]-2=-4(5 ^O2=2D/:)@:N)X6N65">6">6_">6^" `a+N-N1+AbXAFbH>+,-5):+N1AN `a+N-N1+AbXAFbH>+,-5):+N1AN 3 < = % 1 > # - ? @7AB @5&C8D$/ 1(#-?#) DE ?& .!F B !"#$!(#-?GHI0) JKL% M NO ^/-*=D?DCc"^d B P Đoạn mồi QF !BR !"#$! Các nucleotid [...]... hiện được vi sinh vật có trong mẫu chứnên đa số trường hợp số lượng vi sinh vật có trong mẫu • Chi phí cho vi c phát hiện các vi sinh vật đơn lẻ trong thực phẩm thường tốn kém ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR XÁC ĐỊNH SALMONELLA SPP., SALMONELLA ENTERICA TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI TRÌNH TỰ XÁC ĐỊNH SALMONELLA BẰNG PP PCR VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Tổng cộng có 260 mẫu thực phẩm được... điểm của phương pháp PCR Ưu điểm Nhược điểm •• Kích thước của trình tự phân biệt được phương pháp PCR không hoạt vậy được dẫn đến trường DNA lớn hơn Phương pháp này không cần khuếch đại: tế bào sống với tế bào chết, dođộngcó thể với những đoạn hợp dương 3kb tính giả do DNA từ tế bào chết •• Mật độ vi sinh vật hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp, không xác định được cần tăng sinh Phương pháp này... trùng cho đủ thể tích 25 PhẢn Ứng PCR ĐA MỒI Tiến hành phản ứng o 94 C trong 2p o o Gắn mồi ở 60 C trong 1p và kéo dài ở 72 C trong 1p30s o Sau cùng phản ứng được duy trì 72 C trong 7p Phân tích sẢn phẨm PCR Sử dụng thang chuẩn 100bp • Những mẫu nào xuất hiện hai vạch 600bp và 400bp chứng tỏ mẫu đó có chứa vi khuẩn S enteritica • Những mẫu chỉ xuất hiện một vạch 600bp chứng tỏ mẫu chỉ chứa vi khuẩn Salmonella... thiết bị có ảnh hưởng lớn đến quá trình khuyếch đại Máy PCR - Một bàn phím đơn giản để lập các chương trình chu kỳ nhiệt và ra các mệnh lệnh để máy thực hiện - Một bộ vi xử lý để ghi nhớ các chương trình đã nạp vào máy - Buồng ủ PCR là nơi mà các chu kỳ nhiệt được thực hiện qua sự điều khiển của bộ vi xử lý Ba giai đoạn trong một chu kỳ của phản ứng PCR Giai đoạn kéo dài chuỗi (extension): tổng hợp chuỗi... mẫu thịt bò, 60 mẫu thịt gà, 20 mẫu lòng trắng, đỏ trứng gà, • 20 mẫu vỏ trứng gà, 20 mẫu nem chua, 20 mẫu chả lụa, 10 mẫu ba khía, 10 mẫu da heo và 20 mẫu sò huyết VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguồn vi sinh vật PhƯƠng pháp Chuẩn bị mẫu Cân 25g mẫu Thêm vào túi 225 ml dung dịch môi trường BPW Đồng hóa mẫu bằng máy Stomacher trong 30s o Ủ ở 37 C trong 5h o Chuyển 1ml dung dịch qua bình tam giác... 600bp chứng tỏ mẫu chỉ chứa vi khuẩn Salmonella spp nhưng không chứa chủng S enteritica Kết quả nghiên cứu cho thấy Qui trình PCR mang lại kết quả chính xác, nhanh gọn và độ nhạy rất cao Hiện trạng ô nhiễm trong thức ăn là khá cao Phần lớn thực phẩm bị nhiễm Salmonella spp., thực phẩm nhiễm S enteritica có mang gen spvC khá thấp ... vô trùng, trữ ở -20 C Thiết kế các đoạn mồi PCR từ vi khuẩn Salmonella • • Các đoạn mồi được thiết kế cho Salmonella spp và S enterica dựa trên trình tự gen invA và gen spvC Trình tự nucleotid của gen invA và spvC đã sẵn có từ GenBank Accession number M90846 là của gen invA Accession number FN432031 là của gen spvC PhẢn Ứng PCR ĐA MỒI Thành phần của phản ứng PCR đa mồi gồm: 50-100ng DNA 2.5 buffer 10X... ở 42 C trong 4h o Cho 1ml dung dịch mẫu nuôi cấy từ môi trường TT qua bình tam giác 50ml có chứa 9 ml môi truờng RV, nuôi ở 42 C trong 15h Ly trích DNA Ly trích DNA (phương pháp phenol-chroroform) • Cho vào tuýp nhựa 2 ml dung dịch nuôi vi khuẩn, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/p trong 10p • Hoà tan phần tủa với 1ml TE (10 mM Tris + 1 mM EDTA, pH 8), ly tâm 13000 vòng/p trong 5p • Hoà tan phần tủa với... kỳ một thành phần nào khác Dung dịch đệm - Dung dịch đệm chung nhất của PCR bao gồm các thành phần KCl, MgCl 2, Tris Muối KCl góp phần làm tăng hiệu quả của phản ứng MgCl2 là nhân tố cần thiết để enzym polymerase hoạt động Tris có vai trò giữ cho pH dung dịch ổn định THIẾT BỊ CHO PHẢN ỨNG PCR - Thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính... nhất Thêm 40µl proteinase K (10mg/ml), lắc đều và ủ ở nhiệt độ phòng từ 27-30 C trong 2-3h • Cho 800 µl phenol (pH=7) vào, lắc đến khi có màu trắng đục, ly tâm 13.000 vòng/p trong 10p Ly trích DNA (phương pháp phenol-chroroform) • Hút phần dung dịch phía trên cho vào tuýp nhựa 1.5ml có sẵn 150 µl TE Thêm vào khoảng 700 µl Phenol-Chloroform-isoamyl alcohol lắc cho đến khi dung dịch có màu trắng đục, . THIỆU PHƯƠNG PHÁP POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH SALMONELLA SPP., SALMONELLA ENTERICA TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI . THỰC PHẨM Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm GVHD: Nguyễn Thị Mỹ Lệ Lớp: 01DHTP3 PHƯƠNG PHÁP PCR . đặc hiệu của thử nghiệm - Khởi động Enzyme polymerase Nguyên tắc + Cả hai mồi trong một phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảy gần như nhau + Mồi phải chọn đặc trưng cho DNA cần khuếch đại và