 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ từ phía gia đình thầy cô và bạn bè. Nhờ đó mà tôi đã hoàn thành đồ án được như mong muốn, nay cho phép tôi được gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến: Trước hết là ThS. Lê Phương Chung, người trực tiếp hướng dẫn đề tài. Trong suốt thời gian thực hiện, thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm, giúp tôi giải quyết các vấn đề nảy sinh trong quá trình làm đồ án và hoàn thành đồ án đúng định hướng ban đầu. Sau đó, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Văn Duy,Viện phó, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đồ án này. Đồng thời bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang và các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã tạo môi trường thuận lợi, cung cấp đầy đủ thiết bị, dụng cụ cho tôi thực hiện đề tài một cách xuyên suốt. Sau cùng, tôi xin cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ của gia đình, bạn bè, chị Nguyễn Minh Nhật, và các anh chị cao học. Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Chúc tất cả mọi người sức khỏe thành đạt. SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang  MỤC LỤC SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang  DANH MỤC BẢNG SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang  DANH MỤC HÌNH DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT STT Kí hiệu viết tắt Nghĩa 1 TSB Tryptone Soya Broth 2 TSA Tryptone Soya Agar 3 BC Bacterial Cellulose 4 LAB Lactic Acid Bacteria 5 ATP Adenosine Triphosphate 6 DNA Acid Deoxyribo Nucleic 7 HPK Histidine protein kinase 8 RR Response regulator SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang  LỜI MỞ ĐẦU Vào thời kỳ khai sinh ra vi sinh học hiện đại ngày nay, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và phát hiện ra chất kháng sinh. Từ thế kỷ 17, một thầy thuốc Hoàng gia Anh đã biết cách chữa bệnh bằng cách dùng rêu áp lên vết thương, hay dùng mẫu bánh mì để chữa trị thương tích. Đến những năm của thế kỷ 18, thuật ngữ “chất kháng sinh” lần đầu tiên được Pasteur và Joubert sử dụng để mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên động vật nhiễm bệnh, và một số nhà khoa học khác đã phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của một vài chủng vi sinh vật. Vào năm 1929, khi Alexander Fleming tìm ra thuốc kháng sinh penicillin từ nấm Penicillium notanum, có khả năng ức chế vi khuẩn sự sinh trưởng của các loại vi khuẩn, được ứng dụng để chữa trị các bệnh nhiễm trùng trên phạm vi rộng. Việc tìm ra thuốc kháng sinh của Alexander Fleming đã mở ra bước ngoặc mới cho y học loài người. Chỉ với một số lượng rất nhỏ nhưng hiệu quả tiêu diệt vi sinh vật của penicillin rất cao. Thuốc kháng sinh không chỉ được ứng dụng trong điều trị bệnh cho người, mà còn dùng điều trị bệnh cho vật nuôi, tăng trọng cho vật nuôi và cả trong bảo quản thực phẩm (như chlotetracycllin dùng để bảo quản thịt; tetracycline, oromycine… để bảo quản sản phẩm nhằm ngăn chặn quá trình thối rữa của thịt cá, tôm). Tuy nhiên do lạm dụng quá mức kháng sinh đã dẫn đến khả năng kháng thuốc ở vi sinh vật nên việc nghiên cứu chất kháng khuẩn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm cần phải đi theo một hướng mới, hiệu quả hơn. Không những thế, trong những năm gần đây, khi người tiêu dùng đã nhận thức rõ hơn về tác động của phụ gia thực phẩm đối với sức khỏe và chuộng các loại thực phẩm chế biến không bổ sung chất bảo quản hóa học tổng hợp vì tính an toàn cho thực phẩm. Và từ yêu cầu cao về chất lượng, tính an toàn của thực phẩm từ phía người tiêu dùng cũng như những yêu cầu nghiêm ngặt của chính phủ về an toàn thực phẩm trong sản xuất, chế biến, bảo quản đã thúc đẩy nghiên cứu rộng rãi các chất có khả năng bảo quản thực phẩm có nguồn góc tự nhiên. SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang  Xuất phát từ những yêu cầu đó, việc tiếp tục tìm ra những chất kháng khuẩn mới trở nên quan trọng trong lĩnh vực y dược và chăn nuôi, và trong công nghệ thực phẩm. Một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng bacteriocin, một nhóm các hợp chất có bản chất là peptide, nguồn gốc từ vi sinh vật và có khả năng kháng khuẩn mà không gây ra tác động kháng thuốc ở vi sinh vật. Ngoài ra, bacteriocin cũng không gây dị ứng cho con người, an toàn với sức khỏe. Đó là một sự lựa chọn được xem là có nhiều ưu điểm và hiệu quả nhất. Vì thế, tôi chọn tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu đặc điểm và phân loại vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin phân lập được từ tôm hùm ở Khánh Hòa ”, giúp làm phong phú thêm bộ sưu tập chủng vi sinh vật sinh chất kháng khuẩn, tạo ra nhiều sự lựa chọn cho việc tuyển chọn chủng, và hiểu được đặc tính của các chủng này để tăng khả năng sinh bacteriocin. Đề tài nhằm các mục đích chính sau đây: - Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng kháng khuẩn từ tôm hùm. - Sàng lọc các chủng vi sinh vật phân lập từ tôm hùm có khả năng sinh bacteriocin. - Xác định các đặc điểm của vi sinh vật sàng lọc được. - Định danh vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin phân lập được bằng phương pháp sinh học phân tử. SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang  Chương I. TỔNG QUAN  Bacteriocin Nghiên cứu đầu tiên và lâu đời nhất về bacteriocin là công trình nghiên cứu của Gratia và cộng tác viên vào năm 1925 về khả năng kháng khuẩn của Escherichia coli (colicin V) và thuật ngữ bacteriocin không xuất hiện cho đến những năm 1950. Định nghĩa về bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc tính của colicin, đó là một chất sinh tổng hợp gây tử vong, phổ hoạt động hẹp bị giới hạn ở những loài tương tự như vi khuẩn sản xuất. Ba chủng vi khuẩn Gram (+) được nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là: Bacillus sp.;Listeria sp. và Staphylococcus sp. Các nghiên cứu trong những năm 1980 đã cho thấy có sự gia tăng đáng kể về số lượng các công bố trên bacteriocin. Từ thời điểm này bắt đầu bùng nổ những nghiên cứu bacteriocin, định hướng như một chất kháng khuẩn an toàn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm[12],[23].  Khái niệm Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là peptide hay protein được tổng hợp trên ribosome ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương để chống lại vi khuẩn khác có quan hệ gần gũi với chúng. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong con người và vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym proteinase, lipase.  Các chủng vi sinh vật sinh bacteriocin Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm hoặc vi khuẩn Gram dương với những đặc điểm : - Bacteriocin của vi khuẩn gram âm: gồm nhiều loại khác nhau về kích thước, nguồn gốc chủng vi sinh vật sản xuất, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch. Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương. - Bacteirocin của vi khuẩn Gram dương: các bacteriocin này cũng nhiều như ở vi khuẩn gram âm. Tuy nhiên chúng khác vi khuẩn gram âm ở chỗ là: việc tạo bacteriocin không cần thiết phải gây chết vi sinh vật chủ và sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram âm . SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang  Những nghiên cứu trước đây về bacteriocin chủ yếu tập trung vào vi khuẩn Gram âm, điển hình là E. coli sinh tổng hợp colicin. Tuy nhiên những nghiên cứu về bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương cũng đã được tiến hành và đã có nhiều báo cáo cung cấp những thông tin về vấn đề này. Ba chủng vi khuẩn Gram dương được nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là Bacillus sp.;Listeria sp. và Staphylococcus sp. Ngày nay thì các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin được nghiên cứu nhiều hơn, do tính ưu việt của bacteriocin này dùng trong bảo quản thực phẩm là an toàn với người sử dụng, không độc với tế bào nhân chuẩn, bị phân hủy bởi proteinase trong hệ tiêu hóa nên ít ảnh hưởng đến quần xã sinh vật trong ruột người. Thêm vào đó chúng hoạt động trong khoảng pH rộng, chống lại nhiều vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, cơ chế hoạt động dựa trên màng tế bào vi khuẩn nên không gây ra tính đề kháng chéo với các kháng sinh và được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid nên thuận tiện cho thao tác di truyền. Vi khuẩn lactic từ lâu đã được sử dụng trong thực phẩm vì chúng có hoạt tính kháng các loại vi sinh vật khác. Đặc tính này là do vi khuẩn lactic sinh acid hữu cơ và sinh bacteriocin kháng khuẩn kháng nấm. Bảng 1.1: Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại I Bacteiocin Vi khuẩn Nisin A Nisin Z Mutacin 1140 Carnocin U149 Cytolysin Lacticin 481 Lactocin S Salivaricin A Mersacidi Lactococcus lactis (nhiều chủng) Lactococcus lactis (nhiều chủng) Streptococcus mutans JH1000 Carnobacterium piscicola 149 Enterococcus faecalis DS16 Lactococcus Lactis CNRZ481 Lactobacillus sake L45 Streptococcus Salivarius 20P3 Bacillus spp Bảng 1.2 : Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại II Bacteiocin Vi khuẩn SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang  Bavaricin A Bavaricin MN Carnobacteriocin B2 Carnobacteriocin BM1 Curvacin A Divercin V41 Enterocin A Enterocin P Leucocin A/B –Talla Mesentericin Y105 Acidocin J1132 Lactacin F Lacticin 3147 Lactobin A Lactococcin G Divergicin A Lactococcin A – Plantaricin 1.25β Lactobacillus sake MI401 Lactobacillus sake MN Carnobacterium pisciocola LV17B Carnobacterium pisciocola LV17B L. curvatus LTH1174 Carnobacterium pisciocola divergens V41 Enterococcus faecium CTC492/T136 Enterococcus faecium P13 Leuconostoc gelidum UAL187; Leuconostoc carosum Talla Leuconostoc mesenteroides Y105 L. acidophilus JCM 1132 L. johnsonii 11088 Lc. lactis DPC3147 L. amylovorus LMG P-13139 Lc. latis LMG2081 Cb. divergens LV13 Lc. lactis subsp. cremoris LMG 2130 L. plantarum TMW  Phân loại Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên việc phân loại các bacteriocin vẫn chưa được xác định rõ ràng và nó vẫn đang là vấn đề tranh cãi. Các bacteriocin thường được phân loại dựa trên các tiêu chí khác nhau. Những tiêu chí chính là họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng và cuối cùng là trình tự chuỗi amino acid [20]. Trong đó, phương pháp phân loại được chấp nhận và sử dụng phổ biến là bacteriocin được chia thành 4 lớp: lớp I, lớp II lớp III và lớp IV. Hai nhóm bacteriocin lớp I và lớp II là đối tượng được tìm hiểu và nghiên cứu nhiều hơn hơn hai nhóm còn lại. SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang   Lớp I Bacteriocin lớp I hay còn gọi là Lanbiotic là những peptide nhỏ (<5 kDa), bền nhiệt và tác động lên cấu trúc màng. Một bacteriocin của nhóm này là nisin. Các lantibiotic chia thành 2 phân lớp là Ia và Ib dựa trên sự tương đồng cấu trúc.  Phân lớp Ia Phân lớp Ia gồm các peptide dạng thuôn dài, linh hoạt và tích điện dương, chúng hoạt động bằng cách kết hợp với các lipid mang điện tích âm hình thành các lỗ trong màng tế bào chất của các loài vi khuẩn nhạy cảm [24]. Nisin cũng thuộc nhóm này. Đây là một peptide được hình thành bởi 34 aminoacid, các loại acidamin phổ biến có trong nisin là lanthionine (Lan), methyllanthionine (MeLan), didehydroalanine (DHA) và acid didehydroaminobutyric (Dhb). Nisin có 2 biến thể của nisin được ghi nhận là nisin A và nisin Z. . Hình 1.1: Cấu trúc của nisin ( Nguồn: Ruiz-Larrea và cộng sự, 2005) Loại bacteriocin này được sản xuất bởi một vài chủng Lactococcus lactic, được sử dụng như một chất phụ gia trong thực phẩm. Nó có phổ kháng khuẩn Gram (+) rộng, E. coli và các vi khuẩn Gram (-) khác chỉ bị ảnh hưởng bởi nisin khi màng ngoài của chúng bị phá hỏng. Nisin được cho là có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả đối với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, các tế bào sinh dưỡng của Bacillus spp. và Clostridium spp. [24]. Chúng được sử dụng chủ yếu trong các thực phẩm đóng hộp và các sản phẩm từ sữa, đặc biệt trong sản xuất phô mai, nhằm chống lại các vi sinh vật chịu nhiệt như Bacillus và Clostridium .Nisin cũng được ghi nhận có hiệu quả chống lại các bệnh viêm vú do vi khuẩn Gram (+) gây ra [10].  Phân lớp Ib SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang [...]... sinh bacteriocin nhờ sự không có mặt của những thụ thể đặc biệt và kết quả là chúng không bám được vào tế bào vi sinh vật đó[14] 1.1.5 Cơ chế hoạt động của bacteriocin 1.1.5.1 Phạm vi hoạt động Phạm vi hoạt động của bacteriocin được xem xét dựa trên phạm vi kháng khuẩn, giống vi sinh vật sinh ra, khối lượng phân tử, tính ổn định, tính chất hóa sinh và kiểu hoạt động của bacteriocin Hầu hết các bacteriocin...11 Phân lớp Ib gồm các peptide có dạng hình cầu, cấu trúc không linh động, tích điện âm hoặc không tích điện Chúng thể hiện hoạt động bằng cách gây ức chế sinh tổng hợp peptidoglycan [11], gây nhiễu với các phân tử enzyme thiết yếu của vi khuẩn nhạy cảm Chúng thường hoạt động trong các phản ứng lên men quan trọng của vi khuẩn Nhóm này bao gồm các chất kháng... định hoạt tính kháng khuẩn của chủng vi khuẩn Xác định hoạt tính bacteriocin Xác định đặc điểm, phân loại chủng vi khuẩn sinh bacteriocin SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang 34 Hình 2.1: Quy trình thực hiện SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang 35 Các mẫu máu, nội tạng, và cơ thịt của tôm hùm được tiến hành phân lập độc lập Tiến hành đồng nhất mẫu lấy dịch huyền phù để phục vụ cho việc cấy phân lập tạo khuẩn lạc đặc... quá trình thử hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn phân lập được với chủng chỉ thị Khi đã tuyển chọn được chủng vi khuẩn sinh kháng khuẩn, tiếp tục xác định hoạt tính bacteriocin bằng cách sử dụng enzyme proteinase K và trypsin Sau đó, sử dụng chủng sinh bacteriocin để xác định đặc điểm và phân loại chủng vi khuẩn sinh bacteriocin 2.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật Mục đích của thí nghiệm... tỉnh miền Trung từ Quảng Bình đến Bình Thuận, đặc biệt phân bố nhiều ở các tỉnh Khánh Hoà, Ninh Thuận và Bình Thuận Phân bố theo độ sâu: Tùy vào giai đoạn phát triển và tùy vào từng loài mà chúng phân bố theo độ sâu khác nhau Ở giai đoạn trưởng thành tôm hùm bông thường phân bố ở độ sâu từ 20m trở lên, ở giai đoạn ấu trùng và con non chúng thường phân bố ở các bãi rạn, đá san hô ở độ sâu từ 2 - 10m nước... các hang đá ít hoạt động, ban đêm hoạt động tích cực tìm mồi Tôm hùm sống thích hợp ở các vùng biển có độ mặn từ 30 -36 ‰, nhiệt độ từ 25 – 32oC 1.2.2 Tập tính Tôm hùm là loại động vật ăn tạp, trong tự nhiên chúng ăn chủ yếu là các loại động vật như: Cá, tôm, cua ghẹ, cầu gai, giáp xác nhỏ, nhuyễn thể, ngoài ra còn ăn các loại thực vật như rong rêu., chúng thường có tập tính bắt mồi tích cực vào ban... bacteriocin sinh ra bởi sự trao đổi của chính mình Cả cấu tạo thành tế bào và thành phần cấu tạo màng lipid của vi khuẩn cho thấy sự liên quan đến hoạt động của bacteriocin cũng như sự kháng cự bacteriocin Sự biến đổi nhạy cảm của vi khuẩn Gram dương về phía những bacteriocin đáng kể Hoạt động kìm hãm của bacteriocin có thể thay đổi giữa những gen khác nhau, những loài cùng bộ gene và thậm chí đến môi trường... dụng để ức chế sự phát triển của vi khuẩn không mong muốn, có thể là nguyên nhân gây nhớt và gây mùi ở các sản phẩm  Lớp IIb Lớp IIb hình thành bởi một phức hợp của 2 peptide riêng biệt, những peptide này ít hoặc không có hoạt động nào và nó không có sự giống nhau giữa các peptide bổ sung Các bacteriocin nhóm này có thể hoạt động riêng lẻ, cũng có thể liên hiệp khi hoạt động cùng nhau (enterocin L50A,... L50A, L50B) tạo lỗ trên màng tế bào, hoặc chúng có thể cùng cần thiết cho hoạt động kháng khuẩn (lactococcins Gα/Gβ, Lactococcins M/N và plantaricins EF, JK) Các bacteriocin đặc trưng cho nhóm này là lactococcin G, plantaricin EF và plantaricin JK Lactococcin G là một bacteriocin có hoạt động phụ thuộc vào hoạt động bổ sung của 2 peptide, là lactococcins Gα và Gβ Lactococcin Gα gồm có 39 acid amin,... phẩm, theo các tài liệu phân tích, phần ăn được của tôm hùm chiếm 20 – 30% thể trọng Trong thịt của tôm Hùm tính theo trọng lượng tươi, hàm lượng protein chiếm 17,62%, lipid chiếm 0,29%, các axit amin chiếm 77,2% protein cơ thể Do thịt thơm ngon giàu chất dinh dưỡng, nên tôm Hùm được coi là món ăn sang trọng quý hiếm và được ưa thích ở nhiều nước 70% còn lại là vỏ, đầu SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang 26 thân . có mặt của những thụ thể đặc biệt và kết quả là chúng không bám được vào tế bào vi sinh vật đó[14].  Cơ chế hoạt động của bacteriocin  Phạm vi hoạt động Phạm vi hoạt động của bacteriocin. ra [10].  Phân lớp Ib SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang  Phân lớp Ib gồm các peptide có dạng hình cầu, cấu trúc không linh động, tích điện âm hoặc không tích điện. Chúng thể hiện hoạt động bằng. sự liên quan đến hoạt động của bacteriocin cũng như sự kháng cự bacteriocin. Sự biến đổi nhạy cảm của vi khuẩn Gram dương về phía những bacteriocin đáng kể. Hoạt động kìm hãm của bacteriocin có