a VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ THANH NGA NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CÂY DƯA HẤU (CITRULUS LANATUS THUMB.) CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC HÀ NỘI, 2015 b VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Thanh Nga NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CÂY DƢA HẤU (CITRULUS LANATUS THUMB.) CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH Viện Công nghệ Sinh học HÀ NỘI, 2015 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Thanh Nga NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CÂY DƢA HẤU (CITRULUS LANATUS THUMB.) CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH Viện Công nghệ Sinh học HÀ NỘI, 2015 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo, GS.TS. Lê Trần Bình đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Tường Vân, TS. Lê Văn Sơn, TS. Phạm Bích Ngọc, Ths. Phạm Thị Vân cùng tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện làm việc, nhiệt tình giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin cũng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bộ phận Đào tạo, các phòng chức năng và Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và bảo vệ luận án. Tôi xin cảm ơn Trại Sinh học thực nghiệm Cổ Nhuế, Viện Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ tôi trong việc trồng cây thu hạt giống trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới lãnh đạo Trường Đại học Tây Bắc, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông – Lâm cùng các đồng nghiệp đã luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ để tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin dành lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó! Hà Nội, ngày 7 tháng 01 năm 2015 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thanh Nga ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Hà Nội, ngày 7 tháng 01 năm 2015 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thanh Nga iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………… 4 1.1. Giới thiệu về cây dưa hấu và bệnh hại dưa hấu………………………… 4 1.1.1. Cây dưa hấu…………………………………………………………… 4 1.1.2. Các loại bệnh hại dưa hấu……………………………………… …… 10 1.1.3. Bệnh virus hại dưa hấu………………………………………….……… 11 1.2. PRSV và PRSV gây hại trên dưa hấu…………………… …………… 13 1.2.1. Phân loại ……………………………………………………………… 13 1.2.2. Cấu trúc…………………………………………………………………. 14 1.2.3. Phạm vi kí chủ, cơ chế truyền bệnh ……………………………………. 19 1.2.4. Biện pháp phòng trừ …………………………………………………… 20 1.2.5. PRSV gây bệnh trên dưa hấu…………………………………………… 20 1.3. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng chuyển gen kháng virus… 21 1.3.1. Kỹ thuật RNAi………………………………………………………… 21 1.3.2. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng kháng virus…………… 26 1.3.3. Một số hạn chế của công nghệ RNAi và giải pháp…………………… 28 1.3.4. Một số nghiên cứu chuyển gen tạo tính kháng virus cho dưa hấu …… 29 iv Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………. 31 2.1. Vật liệu, địa điểm nghiên cứu…………………………………………… 31 2.1.1. Vật liệu thực vật………………………………………………………… 31 2.1.2. Chủng vi sinh vật, vector……………………………………………… 31 2.1.3. Dụng cụ, thiết bị, vật tư………………………………………………… 32 2.1.4. Hóa chất………………………………………………………………… 33 2.1.5. Địa điểm………………………………………………………………… 33 2.2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………. 33 2.2.1. Xây dựng quy trình tái sinh in vitro cây dưa hấu………………………. 34 2.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen vào cây dưa hấu thông qua chuyển gen gus ………………………………………. 39 2.2.3. Chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu…………………… 44 2.2.4. Phân tích cây chuyển gen kháng PRSV 45 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………… 49 3.1. Xây dựng quy trình tái sinh cây dưa hấu ………………………………… 49 3.1.1. Khả năng tái sinh chồi và cụm chồi …………………………………… 49 3.1.2. Kết quả kích thích kéo dài chồi………………………………………… 54 3.1.3. Kết quả tạo rễ cho chồi ………………………………………………… 55 3.1.4. Ảnh hưởng của giá thể tiếp nhận đến khả năng thích ứng cây in vitro… 56 3.1.5. Tổng kết quy trình tái sinh …………………………………………… 58 3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen vào cây dưa hấu thông qua chuyển gen gus ……………………………… … 59 3.2.1. Đánh giá khả năng sống sót của cây dưa hấu trên môi trường chứa chất v chọn lọc Km 59 3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn (OD 600 ) đến hiệu quả chuyển gen 60 3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen 61 3.2.4. Kết quả biến nạp gen gus vào dưa hấu ………………………………… 63 3.2.5. Kết quả phân tích các dòng cây chuyển gen gus ………………………. 65 3.2.6. Kết quả chuyển gen gus vào cây dưa hấu 67 3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc RNAi vào dưa hấu 68 3.4. Kết quả phân tích biểu hiện gen và đánh giá khả năng kháng virus của các dòng cây chuyển gen 69 3.4.1. Phân tích các dòng cây chuyển gen T0 69 3.4.2. Phân tích các dòng cây chuyển gen T1 79 Chƣơng 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU….……………………. 83 4.1. Khả năng nuôi cấy in vitro cây dưa hấu……………………………….…. 4.2. Khả năng chuyển gen ở dưa hấu…………………………………….……. 4.3. Tạo tính kháng virus bằng chuyển gen ở dưa hấu……………………… 4.4. Triển vọng của các dòng chuyển gen trong bối cảnh GMO chung 83 86 90 94 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 96 1. KẾT LUẬN 96 2. ĐỀ NGHỊ 97 SUMMARY 98 NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit Deoxyribonucleic ARN Axit Ribonucleic BAP 6 - Benzyl Amino Purin IAA Indol - 3 - Axetic Axit IBA 3 - Indol Butyric Axit NAA α - Naptalen Axetic Axit bp Base pair CP Coat protein Nib Nuclear Inclusion Body protein HC-Pro Helper component-proteinase dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylene diamine Tetra-acetic Acid LB Luria-Bertani PCR RT-PCR Polymerase Chain Reaction Reverse transcription polymerase chain reaction RNAi RNA interference miRNA microRNA siRNA small interfering RNA mRNA messenger RNA dsRNA double-stranded RNA RISC RNA-induced silencing complex Taq Thermus aquaticus vii PRSV Papaya ringspot virus Km kanamycin Cefo Cefotaxime X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide gus beta-glucuronidase viii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng trong dưa hấu…………………………… 9 Bảng 1.2. Danh sách các vi sinh vật gây hại chủ yếu trên dưa hấu ………… 10 Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trường tái sinh có bổ sung IBA và BAP… 36 Bảng 2.2. Thành phần các loại môi trường tái sinh có bổ sung IBA, BAP, NAA…………………………………………………………………………… 36 Bảng 2.3. Nồng độ GA 3 sử dụng trên MT kéo dài chồi…………………… 37 Bảng 2.4. Nồng độ IBA sử dụng trên MT tạo rễ …………………………… 37 Bảng 2.5. Thành phần các loại giá thể thích ứng cây in vitro ……………… 38 Bảng 2.6. Các nồng độ Km sử dụng 39 Bảng 2.7. Thành phần các loại môi trường 40 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của tuổi lá mầm tái sinh chồi…………………………. 50 Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của tổ hợp IBA, BAP, NAA đến sự phát sinh chồi… 53 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của GA3 và IBA đến sự kích thích kéo dài chồi có kích thước < 1cm…………………………………………………….…….… 54 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của IBA và môi trường cơ bản đến khả năng tạo rễ của chồi dưa hấu……………………………………………………………… …. 56 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng thích ứng cây ra môi trường 58 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ Km đến sự phát triển của chồi 60 Bảng 3.8. Kết quả biến nạp gen gus vào dưa hấu…………………………… 64 Bảng 3.9. Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu 67 Bảng 3.10. Kết quả biến nạp cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu 69 [...]... nghiên cứu ứng dụng trong việc tạo tính kháng virus ở thực vật Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: Nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (Citrulus lanatus Thumb.) chuyển gen kháng bệnh virus đốm vòng PRSV 2 Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng được quy trình tái sinh và chuyển gen vào cây dưa hấu Việt Nam - Tạo dòng dưa hấu chuyển gen có khả năng kháng với virus. .. được quy trình tái sinh vào 4 giống dưa hấu 3 2 Đã tối ưu hóa được quy trình chuyển gen vào 2 giống dưa hấu nghiên cứu 3 Chuyển thành công cấu trúc RNAi/CP-Nib-Hcpro vào 2 giống dưa hấu nghiên cứu nhằm tạo tính kháng đối với PRSV Việt Nam 4 Đã tạo được 2 dòng dưa hấu chuyển gen có khả năng kháng hoàn toàn với PRSV Việt Nam, khả năng kháng virus của 2 dòng cây chuyển gen này đã được di truyền ổn định... tính kháng bệnh PRSV của các dòng dưa hấu chuyển gen 78 Hình 3.23 Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen D2.7 thế hệ T1 với cặp mồi đặc hiệu PRSV- CP-Fi / PRSV- HC-Ri 79 Hình 3.24 Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen L2.3 thế hệ T1 với cặp mồi đặc hiệu PRSV- CP-Fi / PRSV- HC-Ri 80 1 MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết Dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) là cây. .. pK7GWIW2(II)/CP-NibHCpro 3.4 Phân tích cây chuyển gen và đánh giá khả năng kháng với PRSV Việt Nam của các dòng cây chuyển gen thu được 4 Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam ứng dụng thành công nguyên lý làm câm gen RNAi và kỹ thuật chuyển gen ở thực vật để tạo được các dòng dưa hấu kháng bệnh đốm vòng đu đủ do PRSV gây ra Khả năng kháng virus của dòng cây chuyển gen đã được di truyền... mầm bệnh, tạo tính kháng đối với virus cho cây trồng Khi cây đã bị nhiễm virus, các phương pháp kiểm soát trên không còn tác dụng Trong các biện pháp phòng bệnh virus hại cây trồng hiện nay, biện pháp có hiệu quả nhất là tạo ra tính kháng đối với virus cho cây Do dưa hấu là loại cây trồng rất nhạy cảm với nhiều loài vi khuẩn, nấm và virus gây bệnh nên việc cải thiện khả năng kháng bệnh của dưa hấu. .. Kết quả nghiên cứu thu được trong luận án này là cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu tái sinh invitro, chuyển gen vào các giống dưa hấu khác có nguồn gốc Việt Nam Bên cạnh đó, kết quả luận án đã khẳng định khả năng tiếp nhận đoạn gen chuyển trong chuyển gen của 2 giống dưa hấu nghiên cứu (D2 và L2), làm cơ sở để chuyển các gen mục tiêu theo những mục đích khác vào 2 giống dưa hấu này như chuyển gen làm... Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu 72 Bảng 3.12 Kết quả lây nhiễm virus các dòng dưa hấu chuyển gen RNAi/CpNib-HCpro thế hệ T0 và WT 75 Bảng 3.13 Kết quả PCR phân tích các dòng dưa hấu chuyển gen thế hệ T1 80 Bảng 3.14 Kết quả lây nhiễm virus các dòng dưa hấu chuyển gen RNAi/CpNib-HCpro thế hệ T1 và cây WT 82 x DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cấu trúc của PRSV ………………………………………………... trong tạo cây trồng chuyển gen kháng virus Chuyển gen vào cây trồng đã trở thành kỹ thuật thông dụng trong tạo giống cây trồng Cho đến nay, rất nhiều loại gen đã được chuyển vào cây trồng và nhiều loài cây chuyển gen được trồng thử ở điều kiện đồng ruộng, nhiều loại cây chuyển gen được sản xuất đại trà như cà chua, bông, cải dầu, ngô, khoai tây,… Năm 2011, có hơn 160 triệu ha cây trồng biến đổi gen, ... kháng được virus và chất lượng quả tốt Các phương pháp truyền thống đã tạo ra các giống dưa hấu có khả năng kháng bệnh thán thư, bạc lá, bệnh héo do nấm Fusarium (Mohr, 1986; Crall et al., 1994), nhưng đối với một số bệnh như bệnh đốm quả do vi khuẩn, bệnh đốm vòng đu đủ do PRSV, bệnh khảm dưa hấu do WMV, bệnh khảm vàng bí xanh do ZYMV đang gặp rất nhiều khó khăn 13 trong việc tạo giống kháng bệnh bằng... nghệ chuyển gen ngoài việc giúp rút ngắn thời gian chọn tạo giống so với phương pháp truyền thống đồng thời vẫn không làm mất đi những đặc tính tốt sẵn có ở các cây chuyển gen do đó được coi là phương pháp có hiệu quả để kiểm soát các bệnh virus hại cây trồng nói chung, trong đó có dưa hấu Cho đến nay, đã có nhiều công bố về nghiên cứu chuyển gen vào dưa hấu như chuyển gen để tăng cường tính kháng . (Citrulus lanatus Thumb. ) chuyển gen kháng bệnh virus đốm vòng PRSV 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng được quy trình tái sinh và chuyển gen vào cây dưa hấu Việt Nam. - Tạo dòng dưa hấu chuyển gen. NGUYỄN THỊ THANH NGA NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CÂY DƯA HẤU (CITRULUS LANATUS THUMB. ) CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC. nguyên lý làm câm gen RNAi và kỹ thuật chuyển gen ở thực vật để tạo được các dòng dưa hấu kháng bệnh đốm vòng đu đủ do PRSV gây ra. Khả năng kháng virus của dòng cây chuyển gen đã được di truyền