LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc và PGS. TS. Cao Đăng Nguyên đã quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn tận tình. Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, giảng viên của Phòng thí nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên-Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế; Bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế đã giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian th ực hiện đề tài. Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban Đào tạo Sau đại học của Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học và Hợp tác Quốc tế, Phòng Đào tạo Sau đại học Trường đại học Khoa học; Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đ ã có nhiều giúp đỡ quí báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng tôi hoàn thành luận án. Xin cám ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng tôi hoàn thành luận án. Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình đã đóng góp một phần không nhỏ trong việc hoàn thành luận án này. Huế, ngày 15 tháng 02 năm 2014 Tác giả Võ Châu Tuấn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tác giả Võ Châu Tuấn MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU 1 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 3 4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 4 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT 5 1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật 5 1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật 6 1.1.2.1. Nuôi cấy callus 6 1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào 7 1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào 10 1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào 12 1.1.2.5. Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn 16 1.2. SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT NUÔI CẤY IN VITRO 19 1.2.1. Vai trò của các hợp chất thứ cấp ở thực vật 19 1.2.2. Các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu ở thực vật 19 1.2.2.1. Nhóm terpene 20 1.2.2.2. Nhóm phenol 20 1.2.2.3. Các hợp chất chứa nitrogen 20 1.2.3. Những nghiên cứu sản xuất các hợp thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật 21 1.2.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước 21 1.2.3.2. Những nghiên cứu trong nước 25 1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGHỆ ĐEN 28 1.3.2. Thành phần hóa học 28 1.3.3. Công dụng 30 1.3.3.1. Công dụng cổ truyền 30 1.3.3.2. Các hoạt tính sinh học 30 1.3.4. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro của cây nghệ đen 35 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.37 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 37 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 37 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.3.1. Nuôi cấy callus 39 2.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào 39 2.3.2.1. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác 39 2.3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men 40 2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của tế bào 40 2.3.4. Định lượng tinh dầu 41 2.3.5. Định lượng curcumin 41 2.3.6. Định lượng polysaccharide hòa tan trong nước 42 2.3.7. Xác định sesquiterpene 42 2.3.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu 43 2.3.9. Xử lý thống kê 43 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44 3.1. NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN 44 3.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC 47 3.2.1. Ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy 47 3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc 49 3.2.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST 51 3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA 51 3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D 52 3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA 52 3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon 54 3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose 54 3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose 56 3.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO HUYỀN PHÙ TRONG HỆ LÊN MEN 59 3.3.1. Khảo sát sinh trưởng của tế bào 59 3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 61 3.3.2.1. Cỡ mẫu 61 3.3.2.2. Tốc độ khuấy 62 3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí 63 3.4. KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TẾ BÀO NGHỆ ĐEN 65 3.4.1. Hàm lượng tinh dầu 65 3.4.2. Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số 67 3.4.3. Hàm lượng curcumin 68 3.4.4. Xác định sesquiterpene 73 3.5. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TẾ BÀO NGHỆ ĐEN 77 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 80 NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHỤ LỤC BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT BAP : 6-benzylaminopurine BA : 6-benzyladenine CIB : centrifugal impeller bioreator cs : cộng sự DMSO : dimethyl sulfoxide ĐC : đối chứng ĐHST : điều hòa sinh trưởng HPLC : high performance liquid chromatography (sắc ký hiệu năng cao áp) IAA : indoleacetic acid IBA : indolebutyric acid Kin : kinetin L : lít L-DOPA : L-3,4 -dihydrooxyphenylamine LPS : lipopolysaccharide MS : Murashige và Skoog (1962) NAA : naphthaleneacetic acid Nxb : nhà xuất bản TNF-α : tumor necrosis factor-alpha 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 1 Bảng 3.1.Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro 44 2 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng và phát sinh hình thái của callus 46 3 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 48 4 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 50 5 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 51 6 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 52 7 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 53 8 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 54 9 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 56 10 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng của tế bào nuôi c ấy huyền phù trong bình tam giác 57 11 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 62 12 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 63 13 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 64 14 Bảng 3.14. Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L 66 15 Bảng 3.15. Hàm lượng polysaccharide của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L 67 16 Bảng 3.16. Hàm lượng curcumin của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L 69 17 Bảng 3.17. Chiều cao phổ hấp thụ (mAU) của sesquiterpene trong tế bào nuôi cấy ở hệ lên men 10 L và tế bào củ nghệ tự nhiên 74 18 Bảng 3.18. Khả n ăng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen 78 DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang 1 Hình 2.1. Cây nghệ đen nuôi cấy in vitro 37 2 Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm 38 3 Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro (A) callus trắng và xốp, (B) callus trắng và mọng nước 45 4 Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn, rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy 47 5 Hình 3.3. Dịch huyền phù tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy trong bình tam giác trên môi trường có 3% sucrose 55 6 Hình 3.4. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình tam giác trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA và 1,5 mg/L 2,4-D, lắc 120 vòng/phút 58 7 Hình 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml đặ t trên máy lắc 59 8 Hình 3.6. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L 60 9 Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5 mg/L 2,4-D ; khuấy 120 vòng/phút; sục khí 2,0 L/phút, cỡ mẫu 100 g 60 10 Hình 3.8. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 L 61 11 Hình 3.9. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hê lên men nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5 mg/L 2,4-D ; khuấy 150 vòng/phút; sục khí 2,5 L/phút, cỡ mẫu 200 g 65 12 Hình 3.10. Phổ HPLC của curcumin chuẩ n (0,5 mg/ml) 71 13 Hình 3.11. Phổ HPLC curcumin của củ nghệ đen 01 năm tuổi ngoài tự nhiên 72 14 Hình 3.12. Phổ HPLC curcumin của tế bào nghệ đen sau 2 đến 18 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít 73 15 Hình 3.13. Phổ HPLC của sesquiterpene. A: Củ nghệ đen tự nhiên; B: tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L từ 2 đến 18 ngày 76 16 Hình 3.14. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen 77 [...]... trưởng tế bào được tìm thấy trong nuôi cấy tế bào cây Gymnema sylvestre Với lượng mẫu tế bào đưa vào nuôi cấy là 60 g/L thì khả năng sinh trưởng của tế bào là cao nhất, nếu lượng mẫu đưa vào nuôi cấy là 80 hoặc 100 g/L thì sinh trưởng tế bào bị giảm rõ rệt [78] Kết quả nghiên cứu nuôi cấy ở mật độ cao tế bào của cây tía tô (Perilla frutescens ) để sản xuất anthocyanin cho thấy, lượng mẫu đưa vào nuôi cấy. .. chia và sinh trưởng của tế bào sẽ bị ức chế Khi đó, thông qua cấy chuyển hoặc thay đổi môi trường nuôi cấy sẽ kích thích sự sinh trưởng mạnh mẽ trở lại của huyền phù tế bào [12] Nhìn chung, có ba phương thức nuôi cấy huyền phù tế bào là nuôi cấy mẻ, nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng và nuôi cấy liên tục - Nuôi cấy mẻ Nuôi cấy mẻ là phương thức mà trong suốt thời gian nuôi cấy không thêm vào chất... [85] Nuôi cấy các tế bào đơn và các khối nhỏ tế bào thành công đầu tiên trong nuôi cấy tế bào cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) và cây Tagetes erecta trên máy lắc Nuôi cấy tế bào thực vật trên qui mô lớn đầu tiên thành công ở tế bào của các cây bạch quả, bắt ruồi, cỏ Lolium và hoa hồng trong hệ lên men kiểu ráy nước dạng đơn giản với dung tích 20 L [164] Những thử nghiệm đầu tiên trong nuôi cấy tế bào. .. (1994) nuôi cấy tế bào cây Taxus cuspidate và thu được dòng tế bào ổn định sinh trưởng sau 2 năm cấy chuyển [42] 1.1.2.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào Nuôi cấy huyền phù tế bào thường được khởi đầu bằng cách chuyển các khối callus vào nuôi cấy trong môi trường lỏng được khuấy bởi máy lắc, quay hoặc màng lọc xoay Mô callus nuôi cấy nên là loại mô dễ vỡ vụn để có thể thiết lập được dịch huyền phù tế bào với... lập ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật Trong bài viết nổi tiếng với tiêu đề “Những thử nghiệm nuôi cấy các tế bào thực vật tách rời”, ông đã mô tả những nổ lực trong thiết lập có hệ thống nuôi cấy các tế bào thịt lá, biểu bì và lông hút Mặc dù không thành công trong nuôi cấy phân chia tế bào, nhưng ông dự đoán sẽ có khả năng đạt được sự phân chia tế bào trong nuôi cấy các tế bào riêng rẽ, điều... hơn so với tinh dầu chiết rút từ củ nghệ đen 01 năm tuổi ngoài tự nhiên 5 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT 1.1.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy vô trùng các tế bào, mô, cơ quan và các bộ phận của chúng dưới các điều kiện về vật lý và hóa học in vitro [93] Thử nghiệm đầu tiên về nuôi cấy tế bào bên ngoài một cơ thể thực vật... công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật như một con đường tiềm năng để cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược phẩm [106] 2 Nuôi cấy tế bào thực vật đã được quan tâm nghiên cứu từ những năm 1950 Nhiều nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy tế bào thực vật là một phương thức có hiệu quả trong sản xuất các hợp chất có hoạt chất sinh học hoặc các chất chuyển hóa của chúng [132] Ưu điểm của nuôi cấy tế bào thực... sinh học quý của cây nghệ đen sử dụng trong bào chế dược phẩm Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng” 2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp để sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời... chuyển hóa) để giữ cho thể tích bình nuôi không thay đổi, và điều kiện nuôi cấy của hệ thống luôn ổn định [138] 10 Nhìn chung, các phương thức nuôi cấy có tính truyền thống như nuôi cấy mẻ, nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng và nuôi cấy liên tục trong nuôi cấy vi sinh vật có thể được dùng trong nuôi cấy tế bào thực vật Về cơ bản, thiết lập một phương thức nuôi cấy tế bào phụ thuộc bởi (1) mối quan hệ... thì tế bào thường không sinh trưởng được [78] Matsubara và cs (1989) trong nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây Coptis japonica đã nhận thấy, khi lượng mẫu đưa vào nuôi cấy cao thì sinh khối tế bào và berberine thu được cũng cao Lượng mẫu đưa vào nuôi cấy thích hợp nhất cho sinh trưởng và tích lũy berberine của tế bào là 8 g/L, đạt 55 g/L sinh khối và 3,5 g/L berberine sau nuôi cấy [97] Lượng mẫu nuôi cấy . 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml đặ t trên máy lắc 59 8 Hình 3.6. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L 60 9 Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong. trong nuôi cấy huyề n phù tế bào cây nghệ đen. - Đã khảo sát được khả năng kháng khuẩn của tinh dầu chiết rút từ tế bào cây nghệ đen nuôi cấy in vitro và nhận thấy, tinh dầu của tế bào có. và cs (1994) nuôi cấy tế bào cây Taxus cuspidate và thu được dòng tế bào ổn định sinh trưởng sau 2 năm cấy chuyển [42]. 1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào Nuôi cấy huyền phù tế bào thường được