BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN THỊ CÚC NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP ENZYM CELLULASE TỪ CHỦNG Bacillus subtilis PHÂN LẬP TỪ ðẤT VƯỜN Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. LƯƠNG ðỨC PHẨM TS. NGUYỄN VĂN GIANG HÀ NỘI - 2014 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc. Học viên Nguyễn Thị Cúc Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN Luận văn này ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. ðể hoàn thành ñược luận văn này tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự ñộng viên, giúp ñỡ của nhiều cá nhân và tập thể. Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới PGS.TS. Lương ðức Phẩm và TS. Nguyễn Văn Giang người ñã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ks. Phạm Thị Hải, ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học, Ban Quản lý ðào tạo sau ñại học, các Thầy Cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, ñã tạo mọi ñiều kiện và giúp ñỡ tôi về kiến thức cũng như chuyên môn trong suốt 2 năm học tập và làm luận văn. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc ñến gia ñình, bạn bè, những người thân ñã luôn bên tôi, ñộng viên và khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Học viên Nguyễn Thị Cúc Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp iii Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích của đề tài 2 1.3. Nội dung đề tài 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis 3 2.1.1. Đặc điểm chung vi khuẩn Bacillus 3 2.1.2. Vi khuẩn Bacillus subtilis 4 2.1.3. Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên 9 2.2. Giới thiệu chung về cellulose và enzym cellulase 11 2.2.1. Cellulose 11 2.2.2. Lignocellulose 13 2.2.3. Enzym cellulase 16 2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase ở vi sinh vật 23 2.2.5. Một số ứng dụng của enzym cellulase 25 2.2.6. Thu nhận và tinh sạch enzym cellulase từ môi trường nuôi cấy 26 2.3. Tình hình nghiên cứu enzym cellulase 27 2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 27 2.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 28 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 29 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 29 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp v 3.1.2. Thiết bị và dụng cụ 29 3.1.3. Hóa chất 30 3.2. Các phương pháp nghiên cứu 31 3.2.1. Phương pháp giữ giống 31 3.2.2. Xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào 31 3.2.3. Phương pháp xác định chủng vi khuẩn có hoạt tính enzym cellulase (phương pháp định tính) 31 3.2.5. Xác định sự sinh trưởng theo mật độ quang 35 3.2.6. Phương pháp xác định hoạt độ enzym cellulase - CMCase (phương pháp định lượng) (Ghose TK, 1987) 36 3.2.7. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase 37 3.2.8. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt độ CMCase 39 3.2.9. Phương pháp tách và thu nhận enzym CMCase bằng dung môi hữu cơ (ethanol 96 0 và aceton) 40 3.2.10. Xác định độ bền nhiệt độ của CMCase 41 3.2.11. Xác định độ bền pH của CMCase 41 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 4.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính enzym CMCase 42 4.1.1. Kết quả tuyển chọn 42 4.1.2. Lựa chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính enzym CMCase 43 4.2. Phân loại 44 4.2.2. Xác định một số các phản ứng sinh hóa của chủng Bs4 44 4.3. Đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis Bs4 45 4.4. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase 46 4.4.1. Lựa chọn chất cảm ứng thích hợp 46 4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng CMC 48 4.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường 49 4.4.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu 49 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp vi 4.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ CaCO 3 50 4.4.6. Ảnh hưởng của độ thông khí 51 4.4.7. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase 52 4.5. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt độ CMCase 54 4.5.1. Nhiệt độ phản ứng thích hợp 54 4.5.2. pH phản ứng thích hợp 55 4.6. Nghiên cứu tách enzym CMCase từ dịch môi trường 57 4.7. Xác định độ bền nhiệt của CMCase 58 4.8. Xác định độ bền pH của CMCase 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 Kết luận 61 Kiến nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 66 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Một số phản ứng sinh hoá của B. Subtilis 5 Bảng 2.2. Thành phần hóa học của một số loại phế thải nông nghiệp 14 Bảng 3.1. Các thiết bị sử dụng trong đề tài 29 Bảng 3.2. Các hoá chất sử dụng trong đề tài 30 Bảng 3.3. Phương pháp xác định hoạt tính một số enzym ngoạ i bào của Bacillus subtilis 35 Bảng 3.4. Lượng các chất cho vào trong quá trình thí nghiệm xác định đường chuẩn glucose 36 Bảng 3.5. Lượng các chất cho vào trong quá trình thí nghiệm xác định hoạt độ cellulase 37 Bảng 4.1. Đường kính VPG cơ chất CMC của 4 chủng Bs 43 Bảng 4.2. Kết quả xác định một số các phản ứng sinh hóa của chủng Bs4 44 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của chất cảm ứng tới khả năng sinh tổng hợp CMCase của chủng Bs4 47 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng CMC đến khả năng sinh CMCase của chủng Bs4 48 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh enzym CMCase 50 Bảng 4.6. Khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase của chủng Bs4 trong môi trường có CaCO 3 51 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase của chủng Bs4 52 Bảng 4.8. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase của chủng Bs4 53 Bảng 4.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng thích hợp đến hoạt độ CMCase của chủng Bs4 54 Bảng 4.10. Ảnh hưởng của pH phản ứng thích hợp đến hoạt độ CMCase của chủng Bs4 56 Bảng 4.11. Thu nhận enzym bằng các dung môi hữu cơ 57 Bảng 4.12. Kết quả đo hoạt độ CMCase theo các dung môi hữu cơ 57 Bảng 4.13. Độ bền nhiệt của CMCase 58 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp viii Bảng 4.14. Độ bền pH của CMCase 59 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp ix DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis 4 Hình 2.2. Cấu tạo phân tử cellulose 12 Hình 2.3. Cấu trúc của CMC 13 Hình 2.4. Cấu trúc của lignocellulose 14 Hình 2.5. Cấu tạo phân tử lignin 16 Hình 2.6. Cơ chế hoạt động của endoglucanase (EG) 19 Hình 2.7. Cơ chế hoạt động của exoglucanase (CBH) 20 Hình 2.8. Cơ chế hoạt động của β - glucozidase 20 Hình 2.9. Sơ đồ tác động phân giải của hệ cellulase lên phân tử cellulose (Has G.Schlegel, 1993) 21 Hình 2.10. Mô hình phân hủy cellulose của Lutzen 22 Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào các chủng Bs có hoạt tính enzym ngoại bào 43 Hình 4.2. Khả năng thủy phân cơ chất CMC của chủng vi khuẩn Bs4 43 Hình 4.3. Đường cong sinh trưởng của chủng vi khuẩn Bs4 ở 30 0 C 45 Hình 4.4. Ảnh hưởng của chất cảm ứng tới khả năng sinh tổng hợp CMCase của chủng Bs4 47 Hình 4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến khả năng sinh enzym CMCase 49 Hình 4.6. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase của chủng Bs4 53 [...]... tình nghiên c u t i Vi t Nam, chúng tôi ñã ti n hành th c hi n ñ tài: ‘ Nghiên c u sinh t ng h p enzym cellulase t ch ng Bacillus subtilis phân l p t ñ t vư n’’ 1.2 M c ñích c a ñ tài 1 Ch n ñư c m t ch ng vi khu n có kh năng sinh ra cellulase 2 Thu ñư c m t ch ph m cellulase quy mô phòng thí nghi m 1.3 N i dung ñ tài 1 Tuy n ch n m t ch ng vi khu n Bacillus có kh năng sinh enzym cellulase 2 Nghiên. .. Cellulose là cơ ch t c a enzym cellulase Cellulose là m t polysaccharide phong phú nh t trong t nhiên Vi c phân h y sinh h c cellulose b i vi sinh v t là m t trong nh ng bư c chính c a chu trình carbon trên trái ñ t 2.2.3.3 Phân lo i enzym cellulase Tên g i cellulase dùng ñ ch chung cho các enzym tham gia phân c t h p ch t cellulose T t c các enzym cellulase ñ u có tác d ng phân c t liên k t -1,4 gi... th y phân cellulose b i enzym cellulase t vi sinh v t Trong thiên nhiên cũng t n t i nh ng loài VSV ch có kh năng sinh t ng h p m t lo i enzym trong h enzym cellulase Ho t tính enzym này thư ng m nh hơn các lo i enzym còn l i Chính vì th , trong ñi u ki n t nhiên, m t loài VSV không th tham gia th y phân tri t ñ cellulose ñư c (Lương ñ c ph m, 2009) T nh ng nghiên c u riêng r t ng lo i enzym ñ n nghiên. .. nư c qu và ñư c ng d ng r ng rãi trong y h c Enzym cellulase Cellulase là m t ph c h enzym ph c t p xúc tác cho s th y phân cellulose thành cellobiose, r i sau ñó ti p t c th y phân t i glucose cellulase Cellulose cellobiase cellobiose glucose Vi c nghiên c u quá trình th y phân cellulose ñ n glucose b ng enzym, cũng như vi c nghiên c u s n xu t ra ch ph m cellulase có ho t tính cao là m t công vi c... thành, t bào sinh dư ng t phân gi i và bào t ñư c gi i phóng kh i t bào m Khi g p ñi u ki n thu n l i, bào t s n y m m và phát tri n thành m t t bào m i có s c s ng m nh m hơn (Nguy n Lân Dũng, 1989) 2.1.2.7 Kh năng sinh enzym c a Bacilus subtilis B subtilis có kh năng s n sinh ra nhi u lo i enzym ngo i bào có ho t tính cao như: amylase, protease và cellulase Khái ni m v enzym ngo i bào Enzym ngo i... Nghiên c u m t s ñ c ñi m sinh h c c a ch ng tuy n ch n 3 Kh o sát các ñi u ki n nuôi c y t i ưu cho sinh t ng h p cellulase 4 Nghiên c u phương pháp tách chi t và thu nh n ch ph m cellulase có ho t tính cao H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n văn th c s Khoa h c Nông nghi p 2 PH N 2 T NG QUAN TÀI LI U 2.1 Vi khu n Bacillus subtilis 2.1.1 ð c ñi m chung vi khu n Bacillus Bacillus phân b r ng rãi trong... nguyên li u ñ s n xu t enzyme cellulase là r t phong phú Vì th , vi c nghiên c u s n xu t ra các enzym t vi sinh v t phân l p t i Vi t Nam hi n nay ñang là m t ñòi h i c p thi t Vi c tuy n ch n các vi sinh v t có kh năng s n xu t enzym nh t là cellulase t t nhiên không nh ng giúp t n d ng các ngu n gen quý hi m có s n t t nhiên mà còn góp ph n b o t n gen, c i t o các ch ng vi sinh v t công nghi p ñã... enzym ngo i bào Enzym ngo i bào là nh ng enzym ñư c t o ra trong t bào vi sinh v t, sau ñó ti t vào môi trư ng xung quanh ñ phân h y các cơ ch t có c u t o cao phân t , bi n các cơ ch t này thành nh ng ch t có phân t th p, mà vi sinh v t có th ñ ng hóa ñư c (Lương ð c Ph m, 1979) Enzym protease Protease là nhóm enzym th y phân các liên k t peptit (- CO-NH -) trong phân t protein ho c các polypeptit Protease... phát tri n y u Chính vì th , vi c th y phân cellulose trong t nhiên thư ng ti n hành không ñ ng b , x y ra r t ch m H vi sinh v t th y phân xác th c v t ch y u là cellulose khá phong phú, g m có vi khu n, x khu n và n m m c Chúng có kh năng ti t vào môi trư ng enzym th y phân là các cellulase Cellulase g m hai enzym exo- và endoglucanase ðây là hai enzym tác d ng vào phân t cellulose (glucan) các v trí... u có kh năng sinh ra nhi u amylase và protease ki m, có m t s ch ng sinh ra cellulase Bacillus là vi khu n Gram dương (+), hình que có kích thư c khác nhau (0,5-2,5) x (l,2-10) m Bacillus có chùm tiêm mao giúp chúng có kh năng di ñ ng Chúng s ng hi u khí hay k khí tùy ti n Bacillus là vi khu n d dư ng hóa năng, ho i sinh thu năng lư ng nh oxi hóa các h p ch t h u cơ Bacillus có kh năng sinh bào t Bào . Xuất phát từ lý do trên và tình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: ‘ Nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase từ chủng Bacillus subtilis phân lập từ ñất vườn ’ NỘI NGUYỄN THỊ CÚC NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP ENZYM CELLULASE TỪ CHỦNG Bacillus subtilis PHÂN LẬP TỪ ðẤT VƯỜN Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60.42.02.01 NGƯỜI. có khả năng sinh enzym cellulase. 2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn. 3. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh tổng hợp cellulase 4. Nghiên cứu phương pháp