Đang tải... (xem toàn văn)
nghiên cứu triển khai, biến các chế phẩm enzym papain và amylase thành những sản phẩm thuốc có giá trị
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Môc lôc Trang ĐặT VấN Đề Đặt vấn đề Tæng quan 1.1 Đại cơng amylase papain 1.1.1 Amylase 1.1.2 Papain 1.2 Mét sè s¶n phÈm thuèc cã chøa papain vµ amylase .13 Thùc nghiệm kết 14 2.1 Nguyên liệu phơng pháp thực nghiệm 14 2.1.1 Nguyªn liƯu nghiªn cøu 14 2.1.2 Hoá chất thuốc thử 15 2.1.3 Dơng m¸y mãc .16 2.1.4 Phơng pháp nghiên cøu .17 2.2 KÕt qu¶ Thùc nghiƯm vµ nhËn xÐt .25 2.2.1 Xây dựng biểu đồ mẫu định lợng protein b»ng ph¶n øng Biuret .25 2.2.2 Xác định hoạt độ Papain hỗn hợp PP1 26 2.2.3 Xác định hoạt độ papain hỗn hỵp b»ng PP2 32 2.2.3.Xác định hoạt độ alpha amylase hỗn hợp 35 2.3 BµN LUËN 42 Kết luận đề xuất 45 3.1 KÕt luËn 45 3.2 §Ị xt 46 Tµi liƯu tham khảo 47 Đặt vấn đề Papain Amylase enzym đà đợc sử dụng từ lâu nhiều nớc giới dới dạng thực phẩm thuốc cổ truyền, chí đà trở thành huyền thoại tuyệt diƯu cđa chóng Papain cã níc Ðp cđa qu¶ ®u ®ñ xanh ®· cøu sèng mét em bÐ ngêi ấn Độ bị ngạt thở mắc nghẽn miếng thịt to họng Sự tuyệt diệu amylase chỗ cần thìa nớc ép giá đỗ xanh đà làm loÃng giảm thể tích bát bột đà nấu chín trẻ em xuống nửa, nhng giá trị dinh dỡng không thay đổi hiệu hấp thu tăng lên [14] Trong thời gian qua nhờ thành tựu phát triển khoa học đặc biệt dợc học, nghiên cứu sâu ứng dụng enzym đợc phát triển Ngoài tác dụng thuỷ phân tinh bột protein, hai enzym có tác dụng chống viêm, làm da hiệu Ngày nay, bên cạnh việc chiết tách, tinh chế, ngời ta phải đa chế phẩm enzym vào dạng bào chế thích hợp nhằm phân liều xác, ổn định hoạt chất đại hoá sản phẩm Papain amylase đà đợc phối hợp thích hợp nhằm bổ trợ tiêu hoá thành phần hoá học thức ăn mức tối u theo nhu cầu dinh dỡng số đối tợng bị rối loạn tiêu hoá, trẻ em suy dinh dỡng ngời lớn có bệnh đờng tiêu hoá Hỗn hợp đà trở thành sản phẩm thuốc đợc sư dơng ë nhiỊu níc trªn thÕ giíi, chiÕm tû trọng lớn nớc phát triển có tû lƯ trỴ em suy dinh dìng cao ViƯt Nam nớc phát triển có tỷ lệ trẻ em SDD dới tuổi cao, đến năm 2004 26,4% số ngời có bệnh đờng tiêu hoá cao, chủ yếu viêm dày, ruột Mặt khác nớc ta có khí hậu nhiệt đới, cối quanh năm xanh tốt, nguồn nguyên liệu để thu papain amylase dồi Nhng hàng năm phải nhập hàng triệu sản phẩm thuốc hỗn hợp papain amylase từ nớc Mỹ, Pháp, Hàn Quốc, Nhật Bản ấn Độ Đó thực tế, nhng điều chấp nhận đợc ngời dợc sĩ điều kiện nguồn nguyên liệu để thu sản phẩm nớc ta thuộc loại dồi dào, sẵn có Để góp phần nghiên cứu triển khai biến chế phẩm enzym papain amylase thành sản phẩm thuốc có giá trị, ổn định đại, sản xuất đ- -2- ợc Việt Nam, phục vụ số đông ngời bệnh có nhu cầu, tiến hành đề tài: Đánh giá biến đổi hoạt độ enzym hỗn hợp Papain Amylase dạng bột dạng dung dịch điều kiện lÃo hoá cấp tốc với mục tiêu: đánh giá đợc biến đổi hoạt tính enzym hỗn hợp điều kiện nhiệt độ cao, đồng thời tìm quy luật thay đổi hoạt độ enzym Từ có biện pháp cụ thể ổn định hoạt chất nâng cao độ ổn định thuốc, sớm triển khai sản xuất thuốc thành thực -3- Phần I Tổng quan 1.1 Đại cơng amylase papain 1.1.1 Amylase Amylase [EC.3.2.1] thuéc nhãm enzym hydrolase cã vai trß quan träng việc thuỷ phân tinh bột thức ăn thành thành phần đơn giản Amylase xúc tác phân giải liên kết nội phân tử polysaccarid với tham gia nớc có dịch tiêu hoá nh nớc bọt, dịch dày , đợc mô theo phơng trình sau: R-R' + H-OH RH + R'OH Amylase có nguồn gốc động vật thực vật ngời amylase đợc sinh chủ yếu hai tuyến: tuỵ nớc bọt Hiện nay, ngời ta đà biết có loại amylase, loại: -amylase, -amylase, -amylase (glucoamylase) thuỷ phân liên kết -1,4-glucosid tinh bột, glycogen polysaccharid Các amylase lại: dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6- glucanhydrolase olygodextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinase) thuỷ phân liên kết -1,6-glucosid phân tử polysaccharid Sáu enzym amylase đợc chia thành hai nhóm: endoamylase vµ exoamylase [4]: - Endoamylase: gåm cã α-amylase vµ enzym khử nhánh Nhóm enzym khử nhánh đợc chia thành hai loại: khử trực tiếp pullulanase (hay dextrin 6-glucanohydrolase); khử gián tiếp transglucosylase (hay oligo-1,6glucosidase) amylo-1,6-glucosidase Các endoamylase thuỷ phân liên kết glucosid bên chuỗi polysaccharid -4- - Exoamylase:gồm -amylase -amylase, enzym thuỷ phân tinh bột từ đầu cuối không khử chuỗi polysaccharid Đặc điểm sè amylase: α -amylase (α−1,4−glucan−4−glucanohydrolase, EC.3.2.1.1) α-amylase lµ enzym có khả thuỷ phân tinh bột, amylose amylopectin, glycogen, dextrin, endoenzym, có nớc bọt dịch tuỵ máu, tham gia thuỷ phân tiêu hoá tinh bột phần miệng, phần lớn tiêu hoá tinh bột ruột non -amylase đợc phân lập từ hầu hết động vật, hạt nảy mầm số loài nấm nh Aspergillus oryzae, từ số loại vi khuẩn không gây bệnh nh Bacillus subtilis Cơ chế tác dụng: -amylase có khả phân cắt liên kết -1,4glucosid chất cách ngẫu nhiên, tạo nên hỗn hợp gồm 70 - 90% maltose, lợng nhỏ D-glucose -dextrin giới hạn phân tử lợng thấp (gồm - phân tử glucose chứa một liên kết -1,6- glucosid) Các liên kết -1,6-glucosid chuỗi polysaccharid không bị phá vỡ enzym Các giai đoạn trình thuỷ phân tinh bột -amylase: - Giai đoạn dextrin hoá: Tinh bột -amylase dextrin phân tử lợng thấp (4-8 liên kết glucosid) - Giai đoạn đờng hoá: Dextrin -amylase Tổng quát : tetra- trimaltose α-amylase -5- di- vµ monosaccharid Amylose Maltose (di vµ monosaccharid) oligosaccharid polyglucose maltotriose maltotetrose Khả dextrin hoá -amylase cao, ngời ta gọi amylase amylase dextrin hoá hay amylase dịch hoá Tính chất: -amylase protein phức tạp có chứa Ca2+ -amylase có nguồn gốc khác nhau, thờng có thành phần acid amin không hoàn toàn giống loại α-amylase tõ mét ngn gèc cịng thêng cã mét tỉ hợp acid amin đặc hiệu riêng Thành phần chung cđa c¸c α-amylase cã chøa nhiỊu tyrosin, trytophan, acid glutamic acid aspartic Các acid amin có tính acid glutamic aspartic chiếm khoảng 1/4 lợng acid amin phân tử enzym, nhng ngợc lại, -amylase có methionin có 10 gốc cystein Các αamylase cã ngn gèc kh¸c cịng cã KLPT rÊt khác nhau: -amylase từ tuỵ động vật có KLPT 4500 Da, ®ã α-amylase tõ Bacillus subtilis cã tác dụng giống -amylase từ tuỵ động vật mà KLPT lại gấp đến lần 9900 Da [4], [6] Nhìn chung, -amylase có số đặc tính nh: + Protein cđa α-amylase cã tÝnh acid u; dƠ tan nớc, dung dịch muối cồn thấp độ + Điểm đẳng điện -amylase nằm vùng pH 4,2 - 5,7 [3] + -amylase metaloenzym, phân tử -amylase có chứa 130 nguyên tử gam Ca/mol, nhng không 1-6 nguyên tử gam Ca/mol Ca tham gia vào hình thành ổn định cấu trúc bậc ba enzym, trì hoạt động enzym [4] + Hoạt động -amylase đợc hoạt hoá ion Cl-, bị kìm hÃm kim loại nặng nh Cu2+, Ag+, Hg2+ pH tối thích 6,9 (-amylase động vật); 4,7 -6- - 5,4 (-amylase thùc vËt – mÇm lóa); 5,0 - 6,0 (α-amylase vi khuẩn Bacillus subtilis) [3] + Độ bền nhiệt -amylase nguồn gốc khác không giống nhau, -amylase nấm men vi khuẩn bền với nhiệt -amylase động vật thực vật [4] -amylase (1,4glucanmaltohydrolase, EC.3.2.1.2) -amylase enzym thuỷ phân tinh bột, diện phổ biến thực vật, đặc biệt hạt nảy mầm -amylase xúc tác thuỷ phân cắt phân tử maltose khỏi đầu không khử chuỗi polysaccarid cách phân cắt liên kết -1,4glucosid KLPT -amylase 152.000 Da 215.000 Da, bị ức chế iodoazobenzoat, iodoacetamid, ascorbat, kim loại nặng nh Ag+, Hg2+, Cu2+, c¸c thc thư cã chøa nhãm –SH pH tèi thÝch 4,0 – 5,0 [4] β-amylase chÞu nhiƯt -amylase nhng bền với acid hơn, bị bất hoạt nhiệt độ 70 oC [4] -amylase (glucoamylase, 1,4glucan4glucanohydrolase, EC.3.2.1.3) -amylase enzym có khả thuỷ phân liên kết -1,4 lẫn -1,6 glucosid Khi thuỷ phân liên kết -1,4-glucosid chuỗi polysaccharid, glucoamylase tách lần lợt phân tử glucose khỏi đầu không khử mạch polysaccharid Ngoài liên kết -1,4 -1,6 glucosid, glucoamylase có khả thuỷ phân liên kết -1,2 -1,3 glucosid Do đó, glucoamylase có khả thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin, dextrin, maltose thành glucose mà không cần có tham gia loại amylase khác [4] -7- pH tối thÝch cđa glucoamylase n»m vïng acid nhĐ lµ 4,0-5,0 có loại glucoamylase có pH tối thích nằm vïng trung tÝnh kho¶ng 6,0-7,5 [4] øng dơng: Với vai trò enzym có tác dụng thuỷ phân polysaccharid, amylase đà đợc ứng dụng rộng rÃi nhiỊu lÜnh vùc: c«ng nghiƯp thùc phÈm, c«ng nghiƯp dƯt may, y tế nhiều lĩnh vực kinh tế khác Trong công nghiệp thực phẩm để làm lỏng tinh bột, nấu rợu bia, chế tạo bánh kẹo Trong Y Dợc, dùng để chế tạo glucose, dextrin uống tiêm truyền, dùng làm thuốc chữa rối loạn tiêu hoá, bổ trợ tiêu hoá cho nhiều đối tợng khác Đặc biệt, gần ngời ta dùng amylase để hoá lỏng thức ăn nhằm tăng đậm độ dinh dỡng thể tích thức ăn cho trẻ em SDD Ngoài ra, ®· cã nh÷ng ý tëng sư dơng amylase nh»m mơc đích chống viêm phù nề ý tởng phải đợc chứng minh thực tế 1.1.2 Papain Papain [EC.3.4.1.21] enzym thuỷ phân protein có nguồn gốc thực vật đợc nghiên cứu nhiều tính chất chế hoạt động Papain chủ yếu đợc tách chiết từ nhựa đu ®đ xanh cđa c©y ®u ®đ Carica papaya L (Caricaceae) a- Cấu tạo hoá học: Papain endoprotease có chứa 16,1%N 1,2%S [4] Phân tử enzym có 212 acid amin không chứa methionin, khối lợng phân tử 23400 Da Mạch polypeptid Papain có đầu tận amin isoleucin, đầu tận carboxyl asparagin, phân tử có liên kết disulfua (SS) đợc tạo gèc cystein vµ mét -8- nhãm –SH (sulfhydryl) tù vị trí 25, liên kết chức sinh học, làm tăng tính bền vững cấu trúc [4] Thành phần papain cha hoạt hoá hỗn hợp protein cystein disulfid Khi hoạt hoá papain KCN giải phóng nhóm thiol phân tử enzym -thiocyanatalanin tơng tác cyanid cystein Sau đó, -thiocyanatalanin khép vòng tạo thành -iminothiazolidin Khi có không khí, chế xảy theo chiều ngợc lại tạo thành sản phẩm không hoạt hoá Quá trình hoạt hoá papain không làm thay ®ỉi cÊu tróc kh«ng gian cđa nã [4] N+H3 papa in C≡N papa in SSCH2CH SH + S COO− N+H3 CH2CH CN hoạt hoá Papain hoạt động COO thiocyanatalanin O2 HCNH2 S H2C NH CH COO iminothiazolidin Hình1: Sơ đồ chế hoạt hoá papain cyanid b- Cấu trúc không gian papain: Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thớc trục cấu o trúc không gian chiều là: 36ì48ì36 A , mạch polypeptid bị gấp khúc thành hai phần riêng biệt tạo nên hốc đặc biệt Trung tâm hoạt động nằm -9- bề mặt khe này, nhóm sulfhydryl hoạt động cystein 25 nằm bên trái khe nhóm histidin 159 nằm bên phải khe Phần có cấu trúc xoắn chiếm khoảng 20% toàn acid amin có phân tử [4] c- Hoạt tính enzym chế tác dụng: Đặc điểm quan trọng papain khả thuỷ phân protein đến tận acid amin Papain thuỷ phân protein thành polypeptid acid amin, đóng vai trò vừa nh endopetidase vừa nh exopeptidase [4] Các endopeptidase thuỷ phân proein chđ u thµnh peptid: R R R (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH) R (-NH-CH-COOH)i + (H2N-CH-CO-)k i+k=n Các exopeptidase thuỷ phân peptid thµnh amino acid: R R R (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH) R (NH2-CH-COOH)n' + (H2N-CH-CO-)k' n' + k' = n So với protease có nguồn gốc động vật vi sinh vật khác, papain có khả thuỷ phân sâu hơn, đợc dùng để thuỷ phân tiếp liên kết peptid lại sau đà thuỷ phân pepsin, trypsin hay chymotrysin Tính đặc hiệu chất papain rộng, papain có khả phân huỷ hầu hết liên kết peptid trừ liên kết với prolin với acid glutamic có nhóm carboxyl tự d- Sự hoạt hoá papain: Papain cần có nhóm sulfhydryl tự để thể hoạt tính xúc tác Do trung tâm hoạt động papain có nhãm cystein 25 vµ nitrogen bËc cđa histidin 159 có tính khử nên chất đóng vai trò hoạt hoá papain chất có tính khử yếu nh: cystein, glutathion acid, hydrocyanid, hydrosulfid, natrithiosulfat ®ã cystein thờng đợc dùng nhiều Khi có mặt chất hoạt hoá nhóm -SH trung tâm hoạt động papain đợc phục hồi làm tăng hoạt tính papain Sự hoạt hoá đợc tăng cờng -10- Hình 3: Sự biến đổi HđP hỗn hợp dạng bột theo thời gian Hình 4: Tốc độ biến đổi HđP hỗn hợp bột -28- Các số liệu bảng 1, hình cho thấy hoạt độ papain hai hỗn hợp bột giảm dần theo thời gian, độ giảm HđP tơng đơng tuần gần nh có giảm HđP cách tuyến tính trình nghiên cứu Sau hai tháng (70 ngày) nghiên cứu điều kiện LHCT, hoạt độ papain PA B1 lại 24,5%, PA B2 lại 32,6% so với ban đầu Kết đo HđP đợt kiểm tra hai hỗn hợp PA B1 PA B2 có khác nhng ý nghĩa thống kê (p < 0.05) Thêm nữa, qua so sánh thống kê v B1 v B2 thấy pv1-v2 < 0.05, suy v B1 v B2 khác biệt rõ rệt Điều chứng tỏ tốc độ biến đổi hoạt độ papain hai hỗn hợp bột tơng đơng Hình cho thấy tốc độ biến đổi HđP hai hỗn hợp tăng cao tuần đầu, sau giảm Sự biến đổi HđP xảy mạnh mẽ PA B1 tuần thứ (đạt đỉnh v 0.38 nK/tuần) tuần PA B2 (đạt đỉnh v 0.25 nK/tuần) Đỉnh v PA B1 cao đỉnh v PA B2, nh HđP PA B1 biến đổi nhanh HđP PA B2 2.2.2.2 Hoạt độ papain hỗn hợp dạng dung dịch Các hỗn hợp dung dịch PA D1 PA D2 đợc đặt điều kiện nh trên, hàng tuần đợc lấy khỏi buồng thí nghiệm để kiểm tra Kết kiểm tra đợc trình bày bảng 2, biến dổi HđP hỗn hợp dạng dung dịch đợc biểu diễn phần trăm (%) HđP lại sau tuần hình tốc độ biến đổi v (nK/tuần) đợc biểu diễn hình nh sau: -29- Bảng 2: Hoạt độ papain hỗn hợp dạng dung dịch HđP hỗn hợp dạng dung dịch PA D1 Thời gian (tuần) HđP (nK) HđP (nK) 100 vi (nK/tuần) HđP lại (%) PA D2 vi (nK/tuần ) 1.82 0.03 1.94 ± 0.07 1.84 ± 0.05 0.10 94.89 1.80 ± 0.05 1.77 ± 0.06 0.07 91.25 1.62 ± 0.03 0.15 1.33 ± 0.07 HđP lại (%) P1-2 100 P < 0.05 0.02 98.90 P < 0.05 1.73 ± 0.02 0.07 95.05 P < 0.05 83.33 1.67 ± 0.02 0.06 91.76 P < 0.05 0.29 77.12 1.54 ± 0.07 0.13 84.62 P < 0.05 1.19 ± 0.05 0.14 61.26 1.31 ± 0.06 0.23 71.98 P < 0.05 0.94 ± 0.05 0.25 48.41 1.17 ± 0.05 0.14 64.29 P < 0.05 0.82 ± 0.02 0.12 42.20 0.92 ± 0.02 0.25 50.55 P < 0.05 0.66 ± 0.06 0.16 33.84 0.79 ± 0.04 0.13 43.41 P < 0.05 0.47 ± 0.08 0.19 24.42 0.65 ± 0.03 0.14 35.71 P < 0.05 10 0.40 ± 0.04 0.07 20.56 0.57 ± 0.04 0.08 31.32 P < 0.05 v D1 = 0.15 ± 0.07 v D2 = 0.13 ± 0.07 pv1-v2 > 0.05 Ghi chú: v1 tốc độ biến đổi HđP qua tuần: vi = HđPn HđPn+1 (n = 0ữ10 tuần) P < 0.05 kết so sánh hoạt độ PA D1 PA D2 thời điểm -30- Hình 5: Sự biến đổi HđP hỗn hợp dạng dung dịch theo thời gian Hình 6: Tốc độ biến đổi HđP hỗn hợp dạng dung dịch -31- Bảng 2, hình cho thấy tơng tự hỗn hợp dạng bột, hoạt độ papain hai hỗn hợp dạng dung dịch giảm dần gần nh tuyến tính theo thời gian Kết đo HđP đợt kiểm tra hai hỗn hợp PA D1 PA D2 có khác nhng không cã ý nghÜa thèng kª (p < 0.05) Sau 70 ngày đặt điều kiện LHCT, so với ban đầu HđP PA D1 lại 20,6% PA D2 lại 31,32% Mặt khác, pv1-v2 > 0.05 suy v D1 ≠ v D2 cã ý nghĩa thống kê, chứng tỏ tốc độ biến đổi HđP PA D1 PA D2 có khác rõ rệt: giảm HđP PA D2 chậm PA D1 Điều số thay đổi công thức pha chế hai hỗn hợp nh có mặt chất bảo quản (nipazin, nipazon) công thức pha chế PA D1 khác hàm lợng tinh dầu, chất làm Theo dõi biến thiên tốc độ biến đổi HđP hỗn hợp dạng dung dịch hình cho thấy tốc độ biến đổi HđP không tuần hai hỗn hợp dung dịch, nhng nhìn chung tăng dần Tốc độ biến đổi HđP đạt đến đỉnh tuần thứ t hỗn hợp D1 tuần thứ bảy hỗn hợp D2, sau giảm dần Điều thời gian đầu hàm lợng protein enzym lớn mật độ tiếp xúc protein enzym với nhiệt lớn giai đoạn sau, số lợng protein enzym lại mức thấp Đỉnh tốc độ biến đổi HđP D1 cao D2 cịng chøng tá sù biÕn ®ỉi H®P ë D1 nhanh so với D2 2.2.3 Xác định hoạt độ papain hỗn hợp PP2 Các hỗn hợp PA B1, PA B2, PA D1 PA D2 đợc đặt tủ ấm nhiệt độ 50oC liên tục suốt thời gian nghiên cứu, khoảng tuần lần xác định hoạt độ papain theo phơng pháp 2, tiến hành với chất dung dịch casein 4%, thời gian phản ứng 30 phút, nhiệt độ 60 oC Kết phần trăm hoạt độ -32- papain lại so với ban đầu hỗn hợp đợc trình bày bảng &4 Các kết giá trị trung bình lần thí nghiệm điều kiện a - Xác định hoạt độ papain hỗn hợp dạng bột Bảng 3: Hoạt độ papain hỗn hợp dạng bột (pp2) Thời gian HđP lại hỗn hợp (%) P1-2 (ngày) PA B1 PA B2 100 100 P < 0.05 28 52.40 57.39 P < 0.05 49 39.20 45.63 P < 0.05 70 37.40 43.05 P < 0.05 Ghi chó: P < 0.05 kết so sánh hoạt độ PA B1 PA B2 thời điểm Sự biến đổi HđP hỗn hợp dạng bột đợc thể hình 7: Hình 7: Sự biến đổi HđP hỗn hợp dạng bột theo thời gian Kết bảng hình cho thấy hoạt độ papain hai hỗn hợp bột bị giảm nhanh giai đoạn đầu, sau giảm chậm, gần nh không biến đổi Sau 70 ngày đặt điều kiện LHCT, hoạt độ papain hỗn hợp PA B1 37,4%, hỗn hợp PA B2 43% so với ban đầu P < 0,05 chứng tỏ khác hoạt độ papain hỗn hợp đợt kiểm tra ý nghĩa thống -33- kê Nh thấy kết đo HđP theo PP2 tơng đối phù hợp với kết đo theo PP1 b - Xác định hoạt độ papain hỗn hợp dạng dung dịch Bảng 4: Sự biến đổi hoạt độ papain hỗn hợp dạng dung dịch Thời gian HđP lại hỗn hợp (%) P1-2 (ngµy) PA D1 PA D2 100 100 P < 0.05 28 63.72 69.81 P < 0.05 49 42.27 48.40 P < 0.05 70 27.79 35.25 P < 0.05 Ghi chú: P < 0.05 kết so sánh hoạt độ PA D1 PA D2 cïng thêi ®iĨm Sù biÕn ®ỉi H®P cđa PA D1 PA D2 đợc biểu diễn hình : Hình 8: Sự biến đổi HđP hỗn hợp dạng dung dịch theo thời gian Kết bảng hình cho thấy hoạt độ papain hai hỗn hợp dạng dung dịch điều kiện cấp tốc bị giảm theo thời gian Mức độ giảm HđP -34- PA D1 nhanh mức độ giảm HđP PA D2 Sau 70 ngày đặt điều kiện LHCT, hoạt độ P PA D1 đà giảm 72%, hoạt ®é P cđa PA D2 ®· gi¶m 65% Nh vËy thấy kết đo HđP hỗn hợp dạng dung dịch theo PP2 tơng đối phù hợp với kết đo HđP theo PP1 2.2.3.Xác định hoạt độ alpha amylase hỗn hợp Cũng giống nh xác định hoạt độ papain, việc theo dõi biến đổi hoạt độ amylase đợc tiến hành điều kiện LHCT: hỗn hợp PA B1, PA B2, PA D1 PA D2 đợc đặt tủ ấm nhiệt độ 50oC suốt thời gian thực nghiệm, cách tuần (7 ngày) lần đem xác định hoạt độ AM, tiến hành theo phơng pháp IP 96 với chất dung dịch tinh bột 1, thời gian 60 phút, nhiệt độ 40oC Kết kiểm tra giá trị trung bình lần thí nghiệm điều kiện, đợc trình bày nh sau: 2.2.3.1 Hoạt độ alpha amylase hỗn hợp dạng bột Hoạt độ amylase hỗn hợp PA B1, PA B2 đợc xác định song song, kết đợc trình bày bảng Sự biến đổi HđA hai hỗn hợp đợc biểu diễn hình theo phần trăm (%) HđA lại so với HđA ban đầu sau tuần Tốc độ biến đổi HđA đợc biểu diễn hình 10 -35- Bảng 5: Hoạt độ amylase hỗn hợp dạng bột HđA hỗn hợp bột Thời PA B1 gian vi HđA /g (HA/t) (tuần) PA B2 HđA lại (%) vi HđA /g (HđA/t) 74.48 102.04 ± 0.15 83.00 ± 0.09 9.69 63.93 51.27 ± 0.23 7.44 44.54 ± 0.15 91.84 ± 0.07 68.40 ± 0.10 23.44 58.71 ± 0.05 P1-2 100 P < 0.05 19.03 81.35 P < 0.05 68.45 ± 0.21 14.55 67.08 P < 0.05 55.83 60.02 ± 0.14 8.43 58.82 P < 0.05 6.73 48.50 56.73 ± 0.04 3.29 55.60 P < 0.05 38.75 ± 0.38 5.79 42.19 53.32 ± 0.07 3.41 52.25 P < 0.05 34.78 ± 0.28 3.97 37.87 48.92 ± 0.08 4.40 47.94 P < 0.05 33.12 ± 0.73 1.66 36.06 43.57 ± 0.21 5.35 42.70 P < 0.05 30.05 ± 0.47 3.07 32.72 39.91 ± 0.24 3.66 39.11 P < 0.05 29.47 ± 0.31 0.58 32.09 38.86 ± 0.13 1.05 38.08 P < 0.05 10 28.04 ± 0.48 1.43 30.53 36.69 ± 0.07 2.17 35.96 P < 0.05 v B1 100 HđA lại (%) = 6.38 ± 6.91 v B2 = 6.53 ± 6.54 pv1-v2 < 0.05 Ghi chú: v1 tốc độ biến đổi HđP qua tuần: vi = HđAn HđAn+1 (n = 0ữ10 tuần) P < 0.05 kết so sánh hoạt độ PA B1 PA B2 thời điểm -36- Hình 9: Sự biến đổi HđA hỗn hợp dạng bột theo thời gian Hình 10: Tốc độ biến đổi HđA hỗn hợp bột -37- Kết bảng hình cho thấy hoạt độ amylase PA B1 PA B2 bị giảm theo thời gian giai đoạn đầu HđA hai hỗn hợp giảm nhanh, sau giảm chậm gần nh tiến tới ổn định Trong đợt kiểm tra, so sánh HđA PA B1 PA B2 cho thấy HđA hai hỗn hợp khác ý nghĩa thống kê, chứng tỏ biến đổi HđA hai hỗn hợp tơng đơng Sau 70 ngày điều kiện LHCT, hoạt độ amylase PA B1 30,5%, PA B2 36% Mặt khác, xét tốc độ biến đổi HđA PA B1 PA B2 hình 10 cho thấy tốc độ biến đổi HđA hai hỗn hợp tơng đơng, cao tuàn sau giảm ổn định So sánh v B1 v B2 cho thấy pv1-v2 < 0.05 suy khác biệt v B1 v B2 ý nghĩa thống kê Tuy nhiên thấy HđA PA B2 giảm chậm HđA PA B1 Điều thay đổi số thành phần công thức pha chÕ cđa B1 so víi B2 nh viƯc sư dông calci tribasic phosphat thay cho lactose cã tÝnh chÊt hút ẩm alpha amylase (fungal) có nguồn gốc từ nấm có khả bền với nhiệt 2.2.3.2 Hoạt độ alpha amylase hỗn hợp dạng dung dịch Hoạt độ amylase hai hỗn hợp PA D1, PA D2 đợc tiến hành song song đợt kiểm tra Kết xác định HđA dung dịch đợc trình bày bảng 6, biến thiên theo phần trăm HđA lại so với ban đầu đợc biểu diễn hình 11 tốc độ biến đổi HđA đợc biểu diễn hình 12 nh sau: -38- Bảng 6: Hoạt độ amylase hỗn hợp dạng dung dịch HđA hỗn hợp dạng dung dịch Thời PA D1 gian v1 HđA /ml HđA /ml 100 (HA/t) (tuần) PA D2 HđA lại (%) 32.59 ± 0.09 vi (HđA/t) 31.56 ± 0.18 28.06 ± 0.09 3.51 88.90 29.10 ± 0.32 25.25 ± 0.15 2.81 80.01 21.04 ± 0.12 4.21 19.42 0.27 HđA lại (%) P1-2 100 P < 0.05 3.49 92.12 P < 0.05 27.87 ± 0.13 1.23 88.22 P < 0.05 66.67 23.17 ± 0.21 4.7 73.35 P < 0.05 1.62 61.54 20.27 ± 0.27 2.9 64.17 P < 0.05 14.85 ± 0.05 4.57 47.06 17.78 ± 0.06 2.49 56.28 P < 0.05 14.03 ± 0.21 0.83 44.45 16.09 ± 0.19 1.69 50.93 P < 0.05 12.02 ± 0.23 2.00 38.10 14.52 ± 0.20 1.57 45.96 P < 0.05 10.52 ± 0.07 1.50 33.34 14.00 ± 0.04 0.52 44.32 P < 0.05 10.10 ± 0.19 0.42 32.00 12.50 ± 0.07 1.5 39.57 P < 0.05 10 9.71 ± 0.03 0.39 30.77 12.50 ± 0.05 39.57 P < 0.05 v D1 = 2.19 ± 1.56 v D2 = 2.01 ± 1.49 pv1-v2 < 0.05 Ghi chú: v1 tốc độ biến đổi HđP qua tuần: vi = HđAn HđAn+1 (n = 0ữ10 tuần) P < 0.05 kết so sánh hoạt độ PA D1 PA D2 thời điểm -39- Hình 11: Sự biến đổi HđA hỗn hợp dạng dung dịch theo thời gian Hình 12: Tốc độ biến đổi HđA hỗn hợp dạng dung dịch -40- Tơng tự nh hỗn hợp dạng bột, kết bảng hình 11 cho thấy hoạt độ amylase hai hỗn hợp PA D1, PA D2 giảm theo thời gian Trong đợt kiểm tra, khác kết xác định HđA hai hỗn hợp ý nghĩa (p < 0.05) Tuy nhiên, khác với hỗn hợp dạng bột, hình 12 cho thấy tốc độ biến đổi HđA hỗn hợp dạng dung dịch không đạt đỉnh từ tuần đầu mà tăng dần, đạt đỉnh tuần thứ D1 tuần thứ D2, sau tiếp tục giảm Thêm nữa, so sánh v D1 v D2 cho thÊy pv1-v2 < 0.05 suy v1 ≠ v ý nghĩa thống kê, chứng tỏ độ giảm HđA hai hỗn hợp t- ơng đơng HđA D2 giảm chậm D1 Sau 70 ngày đặt điều kiện LHCT, hoạt độ amylase PA D1 lại 30.8%, PA D2 lại 40% -41- 2.3 BàN LUậN Về tốc độ biến đổi hoạt độ papain amylase hỗn hợp chế phẩm nghiên cứu Các kết đà cho thấy thực tế enzym amylase nh papain bị biến đổi hoạt tính nhanh điều kiện LHCT so với điều kiện thờng (30oC ± 2, ®é Èm 70 - 80%) Trong thÝ nghiệm tiến hành với điều kiện nhiệt độ cao 50oC (cao nhiệt độ thờng khoảng 20oC), sau gần 2,5 tháng hoạt tính enzym hỗn hợp chế phẩm đà giảm nhiều so với hoạt tính ban đầu (100%): hoạt độ papain khoảng 25%, hoạt độ amylase khoảng 35% Nh nhiệt độ có ảnh hởng lớn đến tốc độ biến đổi chế phẩm enzym Từ biến đổi hoạt độ enzym điều kiện LHCT sơ lợc đánh giá đợc độ bền hoạt tính enzym papain amylase hỗn hợp chế phẩm dạng bột dạng dung dịch Bằng cách quy đổi thời gian biến ®ỉi tõ ®iỊu kiƯn LHCT sang ®iỊu kiƯn thêng (ë Việt Nam 30oC 2) nhận thấy để hoạt tính enzym hỗn hợp giảm > 60% cần thời gian là: khoảng 590 ngày hỗn hợp bột, khoảng 610 ngày hỗn hợp dung dịch Nh cách nâng nhiệt độ thêm 20oC rút ngắn thời gian theo dõi hoạt độ enzym chế phẩm enzym khoảng 10 lần (từ khoảng 710 ngày xuống 70 ngày) Không thế, kết ban đầu theo dõi biến đổi hoạt độ papain amylase dạng hỗn hợp (bột dung dịch) cho thấy hỗn hợp B2 D2 có tốc độ biến đổi hoạt độ enzym nhìn chung chậm so với hỗn hợp B1 D1 Điều thay đổi công thức pha chế chế phẩm dạng khẳng định khả ổn định hoạt chất chế phẩm enzym sản xuất Việt Nam, đóng góp phần -42- ... giá biến đổi hoạt độ enzym hỗn hợp Papain Amylase dạng bột dạng dung dịch điều kiện lÃo hoá cấp tốc với mục tiêu: đánh giá đợc biến đổi hoạt tính enzym hỗn hợp điều kiện nhiệt độ cao, đồng thời... đầu theo dõi biến đổi hoạt độ papain amylase dạng hỗn hợp (bột dung dịch) cho thấy hỗn hợp B2 D2 có tốc độ biến đổi hoạt độ enzym nhìn chung chậm so với hỗn hợp B1 D1 Điều thay đổi công thức... hoạt độ amylase khoảng 35% Nh nhiệt độ có ảnh hởng lớn đến tốc độ biến đổi chế phẩm enzym Từ biến đổi hoạt độ enzym điều kiện LHCT sơ lợc đánh giá đợc độ bền hoạt tính enzym papain amylase hỗn hợp