ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Hiền Giang NGHIÊN CỨU RỐI LOẠN ENZYME α-GALACTOSIDASE A VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN GLA TRÊN BỆNH NHÂN PHÌ ĐẠI CƠ TIM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Hiền Giang NGHIÊN CỨU RỐI LOẠN ENZYME α-GALACTOSIDASE A VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN GLA TRÊN BỆNH NHÂN PHÌ ĐẠI CƠ TIM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân TS. Nguyễn Thị Quỳnh Thơ Hà Nội – 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn TS Nguyễn Thị Quỳnh Thơ, người đã tận tình hướng dẫn, ủng hộ và hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS Nguyễn Thị Hồng Vân, chủ nhiệm bộ môn Sinh học di truyền trường ĐH KHTN Hà Nội, người thầy đã trực tiếp dạy dỗ, hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em labo Y sinh học di truyền, Kỹ thuật Y học trường Đại học Y Hải Phòng đã nhiệt tình hỗ trợ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị, thầy cô trong nhóm thực hiện đề tài hợp tác quốc tế: “Nghiên cứu sàng lọc bệnh lý về tích trữ ở lysosome trên bệnh nhân gan to, lách to và phì đại cơ tim chưa rõ nguyên nhân ở Việt Nam” của trường ĐH Y Hải Phòng; Trung tâm nghiên cứu và điều trị bệnh hiếm gặp, Bệnh viện đa khoa Cựu chiến binh Đài Bắc, những người đã tận tình hướng dẫn kỹ thuật, giúp đỡ vật chất và tinh thần cho tôi thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Sinh học di truyền, trường ĐH KHTN Hà Nội, các anh chị và các bạn cao học khoá 2012 – 2014 đã nhiệt tình giúp đỡ và cổ vũ tinh thần để tôi hoàn thành đề tài của mình. Cuối cùng tôi cũng xin gửi lời cảm ơn từ đáy lòng tới gia đình, bạn bè tôi, những người luôn bên tôi, cổ vũ cho tôi trong suốt thời gian qua. Học viên Lê Hiền Giang MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tổng quan về chứng phì đại cơ tim 3 1.1.1. Lịch sử phát hiện và tần số mắc bệnh 3 1.1.2. Nguyên nhân và triệu chứng của bệnh 4 1.2. Bệnh Fabry 7 1.2.1. Lịch sử phát hiện, nguyên nhân và tần số mắc bệnh 7 1.2.2. Triệu chứng của bệnh 8 1.3. Gen GLA và Enzyme α – galactosidase A 11 1.3.1. Gen GLA 11 1.3.2. Enzyme α – galactosidase A 12 1.4. Tổng quan các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về đột biến gen GLA; bệnh Fabry và bệnh phì đại cơ tim 15 1.4.1. Đột biến gen GLA 15 1.4.2. Tổng quan về bệnh Fabry và bệnh phì đại cơ tim 18 1.5. Tổng quan về siêu âm tim 22 1.6. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme α – Gal A và phân tích trình tự gen GLA 24 1.6.1. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme 24 1.6.1.1. Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC 24 1.6.1.2. Phương pháp khối phổ hai lần (MS/MS) 24 1.6.2. Phương pháp phân tích trình tự gen GLA 26 1.6.2.1. Phương pháp PCR 26 1.6.2.2. Phương pháp điện di 26 1.6.2.3. Phương pháp xác định trình tự gen [3] 26 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 28 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 28 2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 28 2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu [68] 28 2.3. Nguyên liệu 29 2.3.1. Mẫu máu 29 2.3.2. Các loại hóa chất và trang thiết bị 30 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 31 2.4.1. Phương pháp xác đinh hoạt độ enzyme α-galactosidase A 31 2.4.1.1. Tiến hành phản ứng enzyme 31 2.4.1.2. Phương pháp sắc ký lỏng kết hợp đo khối phổ 33 2.4.2. Phân tích trình tự gen GLA 34 2.4.2.1. Khuếch đại gen GLA từ mẫu máu toàn phần 34 2.4.2.2. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 37 2.4.2.3. Tách ADN từ gel Agarose 37 2.4.2.4. Định lượng ADN trong dung dịch bằng phương pháp quang phổ kế 38 2.4.2.5. Giải trình tự gen GLA 39 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1. Kết quả xác định hoạt độ enzyme α-Gal A 41 3.1.1. Hoạt độ enzyme α-Gal A 41 3.1.2. Số lượng mẫu và hoạt độ enzyme α-Gal A theo nhóm tuổi 45 3.2. Kết quả giải trình tự gen GLA 47 3.2.1. Đặc điểm của 26 mẫu được giải trình tự 47 3.2.2. Kết quả nhân bản các phân đoạn gen GLA 49 3.2.2.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR 49 3.2.2.2. Kết quả đo OD sản phẩm tinh sạch 51 3.2.3. Phát hiện các đột biến trên gen GLA 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DBS Dry Blood Spot ERT Enzyme replacement therapy (Liệu pháp enzyme thay thế) Gb3 Globotriaosylceramide HPLC High Performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng hiệu năng cao) IS Internal standard (nội chuẩn) IVS Intervening sequence (trình tự intron) LC - MS Liquid chromatography–mass spectrometry (sắc ký lỏng khối phổ) LVMI Left Ventricular Mass Idex (khối lượng cơ thất trái) LVPWd Left Ventricular end Diastolic Post Wall (bề dày thành sau thất trái cuối thì tâm trương) MS Mass spectrometry (khối phổ) PCR Polymerase Chain Reaction S Substrate (cơ chất) UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng siêu cao) UTR Untranslated region (vùng trình tự không mã hoá axit amin) α-Gal A Enzyme α –galactosidase A DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Những dấu hiệu và triệu chứng có thể có của bệnh Fabry [38] 9 Bảng 1.2. Vị trí và độ dài exon và intron của gen GLA 11 Bảng 1.3. Kích thước của 7 exon trong gen GLA ở người và số lượng các đột biến liên quan [23]. 18 Bảng 2.1. Các thành phần có trong dung dịch phản ứng 32 Bảng 2.2. Các thông số trong phương pháp khối phổ 33 Bảng 2.3. Trình tự và nhiệt độ bắt cặp của mồi, kích thước sản phẩm PCR 36 Bảng 2.4. Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR 36 Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng nhân bản. 39 Bảng 2.6. Hàm lượng ADN khuôn cho phản ứng PCR giải trình tự 39 Bảng 2.7. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự. 40 Bảng 3.1. Đặc điểm của 26 mẫu được giải trình tự 47 Bảng 3.2. Các chỉ số LVMI, LVPWd của người bình thường và bệnh nhân phì đại cơ tim. 48 Bảng 3.3. Kết quả đo OD 260 ; OD 280 và nồng độ ADN sản phẩm PCR của mẫu FB01 51 Bảng 3.4. Kết quả giải trình tự 26 mẫu 52 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh cơ tim bình thường (A) và cơ tim bị phì đại (B) 6 Hình 1.2. Vị trí của gen GLA trên NST X 11 Hình 1.3. Cấu trúc không gian của α-galactosidase A 12 Hình 1.4. Globotriaosylceramide và vị trí cắt của enzyme α – galactosidase A 13 Hình 1.5. Gen GLA hoạt động bình thường sinh ra α-Gal A phân cắt Gb3 14 Hình 1.6. Khiếm khuyết gen GLA gây tích đọng Gb3 trong lysosome 14 Hình 1.7. Hình ảnh siêu âm tim của bệnh nhân FB64 (trên) và FB334(dưới) 23 Hình 1.8. Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết hợp đo khối phổ song song (UPLC – MS/MS) của hãng Aligent. 25 Hình 2.1. Mẫu máu trên giấy thấm DBS 30 Hình 2.2. Cơ chất, nội chuẩn và sản phẩm trong phản ứng enzyme 32 Hình 3.1. Hoạt độ enzyme α- Gal A của bệnh nhân phì đại cơ tim 41 Hình 3.2. Hoạt độ enzyme α-Gal A của nhóm đối chứng và bệnh nhân. 43 Hình 3.3. Số lượng mẫu theo nhóm tuổi 45 Hình 3.4. Hoạt độ enzyme α-Gal A theo nhóm tuổi 46 Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của mẫu FB01 49 Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR 7 exon và intron 4 của mẫu FB26, FB44; FB64; FB69 50 Hình 3.7. Đoạn trình tự exon 1 đột biến c.[178 C>T] ; [0], p.P60S 54 Hình 3.8. Đoạn trình tự exon 1 có đột biến 5'UTR -12 G>A 56 Hình 3.9. Đoạn trình tự exon 1 có đột biến 5'UTR -10 C>T 56 Hình 3.10. Đoạn trình tự nucleotide có đột biến IVS1+17 A>G 57 1 MỞ ĐẦU Bệnh phì đại cơ tim (Hypertrophic cardiomyopathy - HCM) là một căn bệnh trong đó cơ tim dày bất thường ở tâm thất trái, thất phải, mỏm tim hoặc toàn bộ cơ tim. Phần lớn các trường hợp đều bị phì đại vách liên thất, làm tắc nghẽn đường ra thất trái. Hầu hết bệnh nhân mắc bệnh này đều không có triệu chứng và họ có thể sống một cuộc sống bình thường như những người bình thường. Trên thực tế, bệnh chỉ hay gặp ở người trẻ tuổi và vận động viên thể thao. Triệu chứng đầu tiên và cũng là cuối cùng của bệnh phì đại cơ tim là đột tử. Tuy nhiên, ở một số ít bệnh nhân có thể có một trong các triệu chứng sau đây: đau ngực, chóng mặt và hoa mắt, nhất là trong lúc vận động mạnh hoặc khi thay đổi tư thế đột ngột, khó thở, thường xuyên mệt mỏi, hay bị ngất xỉu. Trong số các bệnh nhân phì đại cơ tim, có đến 40% chưa tìm ra nguyên nhân gây bệnh. Gần đây, một số các biến thể không điển hình của bệnh do tích đọng các chất tại lysosome đã được xác định và đã thu hút được sự chú ý của các bác sĩ, đặc biệt là kiểu hình không điển hình của bệnh Fabry, với các biểu hiện phì đại cơ tim và các triệu chứng tương tự. Bệnh Fabry là một bệnh di truyền liên quan đến gen GLA mã hóa enzyme lysosome α –galactosidase A (α – Gal A) trên NST X gây tích đọng các chất trong lysosome. Bệnh được phát hiện năm 1898 bởi hai nhà da liễu học hoạt động độc lập là Johannes Fabry người Đức, và William Anderson người Anh do đó bệnh còn được gọi là bệnh Anderson – Fabry. Khi enzyme α –galactosidase A bị thiếu một phần hoặc hoàn toàn dẫn đến việc không chuyển hóa được các glycosphingolipid mà chủ yếu là globotriaosylceramide (Gb3 hoặc GL-3). Gb3 không được chuyển hóa sẽ tích đọng tại các tế bào mạch máu, gây tắc nghẽn quá trình vận chuyển máu. Gb3 cũng tích đọng ở các tế bào thần kinh, tế bào tim, và các loại khác nhau của tế bào thận. Sự rối loạn chức năng [...]... enzyme α – galactosidase A và phân tích trình tự gen GLA trên bệnh nhân phì đại cơ tim Đề tài không chỉ mang ý ngh a khoa học mà còn có ý ngh a thực tiễn y học trong điều trị bệnh phì đại cơ tim MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1 Phân tích rối loạn enzyme α –galactosidase A ở bệnh nhân phì đại cơ tim 2 Phân tích trình tự gen GLA c a một số mẫu có hoạt độ enzyme α – galactosidase A giảm mạnh 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI... mở ra một hướng nghiên cứu mới về một trong những nguyên nhân gây bệnh phì đại cơ tim Ở Việt Nam, hiện ch a có công trình nghiên cứu nào về mối quan hệ gi a enzyme α –galactosidase A, gen GLA và bệnh phì đại cơ tim Điều này có thể gây khó khăn trong việc xác định chính xác nguyên nhân gây bệnh phì đại cơ tim và đ a ra đúng phác đồ điều trị Do đó chúng tôi đã tiến hành đề tài: Nghiên cứu rối loạn enzyme. .. phì đại cơ tim [76] Hình 1.6 Khiếm khuyết gen GLA gây tích đọng Gb3 trong lysosome [76] 14 1.4 Tổng quan các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về đột biến gen GLA; bệnh Fabry và bệnh phì đại cơ tim 1.4.1 Đột biến gen GLA Sau khi xác định gen GLA mã hoá cho enzyme α – Gal A vào năm 1986, hàng loạt các đột biến gen GLA gây nên bệnh Fabry đã được các nhà khoa học tìm ra Năm 1989, Bernstein và cộng... đoán phì đại cơ tim 3 Phì đại cơ tim là căn bệnh di truyền về tim khá phổ biến với tỉ lệ 1/500 dân và có thể xảy ra ở cả nam và nữ, ở mọi l a tuổi và sắc tộc [12, 13] Bệnh phì đại cơ tim là bệnh phổ biến thứ hai trong nhóm bệnh về cơ tim, chiếm 35 – 40% bệnh tim mạch ở trẻ em Bệnh phì đại cơ tim ảnh hưởng đến 500000 người ở Mỹ, trong đó trẻ em dưới 12 tuổi chiếm 10% Các khiếm khuyết về gen gây bệnh. .. đột biến gen GLA ở bệnh nhân Fabry có thể chiếm tới 5% số bệnh nhân phì đại cơ tim [8] Chẩn đoán phân biệt gi a phì đại cơ tim do đột biến protein cơ tim với các dạng đột biến khác là rất quan trọng trong điều trị Ví dụ chẩn đoán đúng bệnh Fabry sẽ đ a ra được liệu pháp điều trị hiệu quả như bổ sung enzyme tái tổ hợp αgalactosidase A, điều này có thể làm giảm bớt hiện tượng phì đại cơ tim và cải thiện... đoán c a nhiều bệnh, từ đó đem đến những phác đồ điều trị mới cho một số bệnh tim mạch Các rối loạn tim mạch đầu tiên được xác định cơ sở di truyền là bệnh phì đại cơ tim [49] Bệnh phì đại cơ tim do Lord Brock lần đầu tiên phát hiện ra vào năm 1957 [36, 37] Năm 1958, Donald Teare đã lần đầu tiên mô tả lâm sàng và bệnh lý c a 9 bệnh nhân phì đại cơ tim bị chết đột tử Ngay từ đầu, phì đại cơ tim được gắn... 270 297 1.3.2 Enzyme α – galactosidase A Enzyme α – galactosidase A (hay còn được gọi là α – Gal A; GLA và α – GAL) được mã h a bởi gen GLA Enzyme α- Gal A là một glycoprotein homodimer bao gồm hai tiểu đơn vị khoảng 50-kDa Mỗi monomer có hai miền, một miền ch a vị trí hoạt động và một miền đầu C ch a 8 sợi β đối song (hình 1.3) [61] Các phân tích cấu trúc cho thấy, một phần đầu N c a glycoprotein... năng c a các enzyme dẫn đến tích tụ các chất trong mô Các triệu chứng bệnh cụ thể phụ thuộc vào số lượng, hoạt động c a các enzyme [65] Enzyme α – galactosidase A cũng là một lysosome enzyme Hoạt động bình thường c a gen GLA và enzyme α – Gal A trong tế bào được nêu trong hình 1.5 13 Hình 1.5 Gen GLA hoạt động bình thường sinh ra α-Gal A phân cắt Gb3 [76] Sự thay đổi trong gen GLA tạo ra những enzyme. .. khi bệnh nhân đã lớn tuổi (sống được thời gian dài) [23] Một trong những triệu chứng thường thấy nhất ở những bệnh nhân Fabry thể không điển hình là chứng phì đại cơ tim Ở những bệnh nhân Fabry có những biểu hiện phì đại cơ thất trái giống như biểu hiện phì đại cơ tim Bệnh cơ tim c a bệnh nhân Fabry được báo cáo là đến 6% nam giới và 12 % nữ giới có hiện tượng phì đại cơ tim khởi phát muộn Đặc biệt, tim. .. protein cơ tim gây nên hay là do những gen khác Những bệnh về tim liên quan đến sự trao đổi chất ở cơ tim thường được chẩn đoán lâm sàng sai Ví dụ một loại rối loạn tích đọng lysosome do gen trội liên kết với NST X, lysosome liên quan đến protein màng (LAMP2- bệnh Danon); bệnh Fabry, một bệnh do đột biến lặn ở gen GLA nằm trên NST X, gen này mã hoá cho enzyme α-galactosidase A Sự thiếu hụt enzyme này . bệnh phì đại cơ tim. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1. Phân tích rối loạn enzyme α –galactosidase A ở bệnh nhân phì đại cơ tim. 2. Phân tích trình tự gen GLA c a một số mẫu có hoạt độ enzyme α – galactosidase. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Hiền Giang NGHIÊN CỨU RỐI LOẠN ENZYME α-GALACTOSIDASE A VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN GLA TRÊN BỆNH NHÂN PHÌ ĐẠI CƠ TIM. hành đề tài: Nghiên cứu rối loạn enzyme α – galactosidase A và phân tích trình tự gen GLA trên bệnh nhân phì đại cơ tim Đề tài không chỉ mang ý ngh a khoa học mà còn có ý ngh a thực tiễn y