Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG CÀ CHUA LAI (F 1 ) CHỐNG CHỊU BỆNH SƯƠNG MAI (Phytophthora infestans de Bari) VÀ BỆNH XOĂN VÀNG LÁ (TYLCV) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ Trần Ngọc Hùng Viện Nghiên cứu Rau Quả SUMMARY Breeding t omato hybrids resistant to late blight (Phytophthora infestans de Bari) and tomato yellow leaf curlf virus (TYLCV) by using molecular markers Late blight and tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) are diseases devastating severely tomato grown in Vietnam. Through marker assistant selections, two groups of tomato breeding lines have been bred. The first group contained lines carrying homozygous Ph3 allele. And, the other one consisted of lines with both homozygous Ty1 and Ty3 alleles or only Ty3 allele. Hybrids by crossing Ph3 gene lines with Ty gene(s) lines showed high resistance to both diseases of late blight and TYLCV. They also produced promising yield and good horticultural characteristics. Keywor ds: Tomato, hybrids, late blight, TYLCV, breeding, molecular marker. I. ĐẶT VẤN ĐỀ * Cà chua là một trong những cây trồng đầu tiên được ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống (Rick và Fobes, 1974; Tanksley và Rick, 1980). Từ những năm 1980, chỉ thị phân tử đã được sử dụng như công cụ cơ bản trong chọn tạo giống cà chua. Đến nay khoảng 40 gen liên quan đến tính kháng bệnh chính đã được lập trên bản đồ phân tử của cà chua (Grube và cs., 2000; Chunwongse và cs., 2002; Bai và cs., 2003). Công nghệ chỉ thị phân tử DNA đã được sử dụng trong các chương trình tạo giống cà chua thương mại từ những năm 90 (Tanksley và cs., 1989). Bệnh sương mai (late blight) gây hại bởi nấm Phytophthora infestans là một trong những bệnh gây hại hủy diệt ở hầu hết các vùng cà chua và khoai tây trên toàn thế giới. Ở nước ta, vụ Đông Xuân là thời kỳ hội tụ nhiều yếu tố môi trường (nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng ) rất thuận lợi cho bệnh sương mai phát triển. Bệnh gây hại nghiêm trọng và có ảnh hưởng lớn tới năng suất (giảm 60 - 70%) và phẩm chất trên cà chua, khoai tây ở một số vùng Hà Nội, Hải Phòng, Lào Cai, Đà Lạt (Nguyễn Văn Viên, 1998). Bệnh nặng trong mùa mưa ở các vùng cao có khí hậu ôn hòa: Mộc Châu - Sơn La, Sapa - Lào Cai, Đà Lạt - Lâm Đồng Để hạn chế bệnh, kỹ thuật phổ biến nhất đang được nông dân áp dụng là phun Người phản biện: TS. Trịnh Khắc Quang. thuốc trừ bệnh với 13 - 15 lần phun/vụ cà chua. Tuy nhiên, hiệu quả phun thuốc hóa học rất hạn chế do nhiều mẫu nấm sương mai có khả năng kháng metalaxyl, hoạt chất chính trong các thuốc trị bệnh sương mai. Với đặc thù này sản xuất cà chua luôn tiềm ẩn tính thiếu ổn định và nguy cơ không an toàn vệ sinh thực phẩm cao. Virus gây bệnh xoăn lá ở cà chua (Tomato Yellow Leaf Curl Virus - TYLCV) thuộc chi Begomovirus họ Geminiviridae, lan truyền nhờ bọ phấn (Ba misia tabaci) được phát hiện lần đầu tiên ở Israel vào năm 1939 (Pisco et al., 1996). Bệnh gây hại hủy diệt rất nhiều giống cà chua (Cohen và Antignus, 1994). Thiệt hại rất lớn trong sản xuất cà chua do TYLCV được ghi nhận ở các vùng nhiệt đới, á nhiệt đới, thậm chí kể cả châu Âu và nửa tây bán cầu (Pico et al., 1996). Năng suất thiệt hại trung bình từ 55 - 90% thậm chí là 100% khi cây bị nhiễm bệnh này (Reynaud et al., 2003). Một trong những biện pháp hiệu quả để phòng trừ hữu hiệu dịch hại này là dùng giống kháng bệnh, do đó hàng thập kỷ qua công tác tạo giống theo hướng này vẫn liên tục thực hiện. Tuy nhiên hiện nay số dòng, giống cà chua kháng tốt bệnh này vẫn rất hạn chế (Ji et al., 2007). Mặc dù chưa c ó thống kê đầy đủ về thiệt hại do TYLCV gây ra ở Việt Nam, nhưng hiện nay bệnh đang tàn phá nhiều r uộng cà chua, đặc biệt trong vụ sớm. Để hạn chế bệnh phần lớn nông 481 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM dân trông cậy vào thuốc hóa học để diệt m ôi giới truyền bệnh và luân canh cây trồng. Savior có thể coi là giống cà chua lai đầu tiên được Syngenta giới thiệu vào Việt Nam có khả năng chống chịu với bệnh xoăn vàng lá. Trong vụ sớm, đây là giống chủ lực ở nhiều vùng cà chua phía Bắc. Kết quả đề tài “Chọn tạo giống cà chua chống chịu bệnh sương mai (Phytophth ora infestans) bằng chỉ thị phân tử”, đã xá c định được chỉ thị phân tử và tạo được một số dòng cà chua kháng cao với bệnh sương mai. Bên cạnh đó, các dòng cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá cũng được chọn tạo. Để khai thác ưu thế lai phục vụ sản xuất, kết quả bước đầu nghiên cứu chọn tạo giống cà chua ưu thế lai (F 1 ) chống chịu bệnh sương mai (Phytophthora infestans) và bệnh xoăn vàng lá (TYLCV) bằng chỉ thị phân tử được thực hiện và trình bày trong bài này. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Dòng cà chua kháng bệnh Dòng cà chua kháng bệnh sương mai PR85 - 2 - 3, PR85 - 65, PR78 - 66 là thế hệ F 5 được chọn bằng chỉ thị phân tử LB3 từ quần thể phân ly của nguồn gen kháng bệnh sương mai L3708 (mang gen Ph3) lai với các dòng ưu tú về năng suất và chất lượng. Sử dụng mẫu g iống Gc171 và Gc173 mang gen kháng bệnh xoăn vàng lá (TYLCV) lai với các mẫu giống có đặc điểm nông sinh học tốt (năng suất, chất lượng quả, dạng quả ). Chỉ thị phân tử Ty - seminis để xác định gen Ty1 và chỉ thị FLUM25 để xác định gen Ty3 được dùng để chọn lọc các cá thể mang gen kháng bệnh đồng hợp tử ở giai đoạn vườn ươm trong từng quần thể F 2 . Các cá thể được chọn lọc tạo thành dòng ở F 3 và tiếp tục chọn lọc phả hệ (Pedigree) về các đặc điểm nông sinh học ở các thế hệ tiếp theo. Ở thế hệ F 5 , F 6 đã chọn được các dòng ưu tú AV3, AV8 và E1. Nhằm p hối hợp các gen kháng bệnh và hiệu quả của ưu thế lai, các dòng ưu tú tạo được thông qua chọn lọc bằng chỉ thị phân tử lai với nhau để tạo ra các tổ hợp lai F 1 . 2.2. Chỉ thị ph ân tử DNA của nguồn mẫu giống nghiên cứu được ly trích từ lá non (cây 3 - 4 lá thật) sử dụng phương pháp của Dorokhov và Klocke (1998) có điều chỉnh hoặc sử dụng Dneasy Plant kit của Quiagen. Chất lượng DNA được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose và mật độ quang (OD, A260/A280). Chọn lọc cá thể m ang gen Ph3 bằng chỉ thị LB3 với enzym cắt hạn chế MvaI, gen Ty1 bằng chỉ thị Ty - seminis với enzym cắt hạn chế TaqI và gen Ty3 bằng chỉ thị FLUM25. Sản phẩm của PCR và cắt hạn chế được điện di trên agarose gel 1,5%. 2.3. Nấm bệnh sương mai và đánh giá tính kháng bệnh Mẫu lá cà chua bị bệnh sương mai điển hình được thu thập tại Hà Nội và phân lập trên môi trường Pea agar, V8 agar và PDA để dùng làm nguồn lây bệnh nhân tạo. Tính kháng bệnh sương mai được đánh giá thông qua 2 phương pháp là lây nhiễm n hân tạo trên lá tách rời và lây nhiễm nhân tạo trên toàn cây: + Phương ph áp lá tách rời: Đặt úp lá cà chua lên môi trường thạch nước (Water agar: 18g agar + 1000ml H 2 O, Autoclaved 121 o C, 17 min.) trong đĩa petri sau đó dùng Micropipet nhỏ vào giữa mỗi lá chét 30µl dung dịch bào tử (5000 sporangia/ml) nấm sương mai.Với mỗi mẫu giống lây bệnh được lại lại 3 lần. Sau khi lây nhiễm, hộp petri được đậy kín lại, giữ trong tủ định ôn 17 o C. Đánh giá bệnh được thực hiện sau 7 ngày với 2 phương pháp: xác định số bào tử hình thành và chỉ số bệnh theo thang đánh giá như sau: Điểm 1: Lá không xuất hiện vết bệnh; Điểm 2 : Xuất hiện các chấm nhỏ trên lá (~1mm); Điểm 3: Khoảng 25% diện tích lá bị bệnh; Điểm 4:26 ~ 50% diện tích lá bệnh; Điểm 5:51 ~ 75% diện tích lá bệnh; Điểm 6: >75% diện tích lá bị bệnh. Các lá lây nhiễm sau khi đọc chỉ số bệnh sẽ được xác định số bào tử hình thành bằng kỹ thuật đếm bào tử dưới kính hiển vi. + Phương p háp lây bệnh nhân tạo trên cây con: Phun đẫm dung dịch bào tử (10 4 sporangia/ml) lên cây cà chua 4 tuần tuổi sau đó dùng nylon trắng bọc kín cả khay cây giống để tạo ẩm độ bão hòa (100%). Cây lây bệnh được đặt trong buồng sinh trưởng (17 - 18 o C) trong 48 h, rồi chuyển ra ngoài với nhiệt độ 22 - 25 o C, ẩm độ 80% - 90%. Đánh giá tính kháng của các mẫu giống được thực hiện sau khi lây 7 ngày bằng 482 Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 483 cách cho điểm từng cây rồi tính giá trị trung bình theo thang dưới đây: Điểm 0: ~ Không vết bệnh; Điểm 1: ~1 - 10% diện tích lá bị bệnh; Điểm 2: ~11 - 20% diện tích lá bị bệnh; Điểm 3: ~ 21 - 40% diện tích lá bị bệnh (và 1 - 10% vùng thân bị bệnh); Điểm 4:~ 41 - 70% diện tích lá bị bệnh (và 11 - 50% vùng thân bị bệnh); Điểm 5: ~71 - 90% diện tích lá bị bệnh (và 51 - 100% vùng thân bị bệnh); Điểm 6: ~ 91 - 100% diện tích lá bị bệnh, cây chết. 2.3. Virus xoăn vàng lá và đánh giá tính kháng bệnh Sử dụng cấu trúc xâm nhiễm ToLCHnV (mã GenBank HQ162269) gây bệnh xoăn vàng lá trên cà chua tại Việt Nam (Hà Viết Cường et al., 2011) để lây nhiễm nhân tạo bằng vi khuẩn Agrobacterum tumerfaciens. Vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm với nồng độ 10 9 CFU/ml được tiêm với lượng 10 µl vào nách lá cây 5 - 6 lá thật. Tính kháng bệnh được đánh giá sau lây nhiễm 30 ngày theo thang điểm: 0 - không xuất hiện bệnh, 1 - vàng nhẹ ở mép lá, 2 - vàng và quăn nhẹ ở cuối lá chét, 3 - vàng, quăn thể hiện rõ, lá co lại nhưng cây vẫn sinh trưởng, 4 - cây vàng, xoăn, ngừng sinh trưởng. 2.4. Đánh gi á đặc điểm nông sinh học Đánh giá đặc điểm nông sinh học (năng suất, dạng quả, chất lượng quả, dạng hì nh sinh trưởng ) của các dòng từ F 2 đến F 4 được bố trí theo phương pháp tuần tự, không lặp lại. Mỗi mẫu dòng, giống trồng 12 cây. Các thế hệ sau F 5 và các tổ hợp lai được bố trí thí nghiệm ở các vùng Hà Nội theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (RCBD), 3 lần lặp lại. Khoảng cách trồng: Cây  hàng = 40cm  70cm, phân bón (ha) N: P 2 O 5 :K 2 O = 200:150:200 và 25 tấn phân chuồng. Số liệu thu thập được sử lý thống kê theo chương trình SAS. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Chọn tạo dòng mang gen Ph3 kháng bệnh sương mai Tính kháng bệnh sương mai ở cà chua do một số gen quy định. Tuy nhiên các nghiên cứu trước đã xác định gen Ph3 nằm trên nhiễm sắc thể số 9 kháng với nhiều mẫu nấm sương mai phân lập tại Việt Nam. Trong khi đó gen Ph1, Ph2 không thể hiện tính kháng với nấm bệnh này (Trịnh Khắc Quang, Trần Ngọc Hùng, 2012). Bằng chỉ thị phân tử đã chọn đư ợc các cá thể đồng hợp tử gen Ph3 trong quần thể phân ly (F 2 , BC n F 2 ) của các tổ hợp lai giữa các mẫu giống ưu tú về năng suất nhưng nhiễm bệnh sương mai với mẫu giống mang gen Ph3 kháng bệnh sương mai. Các cá thể này tạo thành dòng và tiếp tục chọn lọc phả hệ (Pedigree) theo các tính trạng nông học khác. Đến thế hệ F 5 các cá thể trong từng dòng khá đồng nhất. Qua khảo sát trên 100 dòng đã chọn được 3 dòng ưu tú PR85 - 2 - 3, PR78 - 66, PR85 - 65. Với chỉ thị phân tử LB3, các dòng này đều xuất hiện 1 band 249bp điều đó chứng tỏ chúng đã được cố định gen Ph3 (h1). Biểu hiện tính kháng của gen này trong các dòng mới chọn tạo tương đương mẫu giống gốc L3708. Số bào tử tạo ra và chỉ số bệnh của các dòng PR thấp hơn rõ rệt so với giống Savior (không mang gen kháng) và không sai khác với L3708 (bảng 1). Sau lây bệnh nhân tạo 7 ngày, nấm sương mai phủ hầu hết lá giống Savior, trái lại nấm bệnh không thể phát triển trên lá của các dòng kháng (hình 2). Bảng 1. Tính kháng bệnh sương mai của các dòng cà chua PR Dòng Phả hệ/ nguồn gốc LB3 (bp) Số bào tử (10 4 ) Chỉ số bệnh PR85 - 2 - 3 08TP85 - 2 - 3 - 5 - 1 - 1 249 0,67b 1,33b PR85 - 65 (08TP85  08TP65)2 - 1 - 9 - 1 - 2 249 1,17b 1,33b PR78 - 66 (08TP78 X 08TP66)2 - 5 - 3 - 3 - 1 249 0,83b 1,67b L3708 AVRDC(Solanum pimpinellifolium) 249 0,50b 1,33b Savior Hybrid F 1 (Syngenta) 482 21,67a 4,67a VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Hình 1. Ảnh điện di xác định gen Ph3 bằng chỉ thị phân tử LB3 (1 - thang chuẩn 100bp, 2 - PR85 - 2 - 3, 3 - PR85 - 65, 4 - PR78 - 66, 5 - L3708, 6 - Savior) Hình 2. Ảnh đánh giá tính kháng bệnh sương mai (theo chiều từ trái qua phải, từ trên xuống dưới: PR85 - 2 - 3, PR85 - 65, PR78 - 66, L3708, Savior) Mẫu giống L3708 là dạng cà chua dại được dùng làm nguồn cho gen kháng bệnh sương mai. Nhưng qua lai và chọn lọc đã tạo được các dòng cà chua kháng bệnh có đặc điểm nông sinh học của dạng cà chua trồng trọt. Các dòng PR đều có quả kích thước trung bình, đỏ, oval, thịt quả dày nên quả cứng, chịu vận chuyển. Riêng dòng PR78 - 66 ra hoa rất sớm, các chùm hoa ra liên tiếp, thân chính sớm kết thúc bằng chùm hoa nên thuộc nhóm sinh trưởng hữu hạn. Dòng này đậu quả rất cao n hưng bộ thân lá kém phát triển, quả nhỏ nên năng suất thấp. Các dòng khác ra hoa muộn, thân lá phát triển mạnh, thuộc nhóm sinh trưởng vô hạn. Bảng 2. Đặc điểm quả của các dòng cà chua ưu tú kháng bệnh sương mai Dòng Cao q uả (cm) (H) Đường kính quả (cm) (D) Chỉ số hìn h dạng quả (I=H/D) Dạng quả Độ dầy thịt quả (cm) Brix (%) Màu quả PR85 - 2 - 3 6,30 5,33 1,18 oval 0,70 5,00 Đỏ PR85 - 65 5,93 5,63 1,05 oval 0,67 4,33 Đỏ PR78 - 66 6,03 4,20 1,44 oval 0,63 5,00 Đỏ L3708 1,73 1,77 0,98 tròn 0,17 3,17 Đỏ 500bp 1 2 3 4 5 6 484 Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất Bảng 3. Đặc điểm hình th ái cây của các dòng cà chua ưu tú kháng bệnh sương mai Dòng Số lá đến chùm hoa đầu Số lá giữa chù m hoa 2 - 3 Số lá đến chù m hoa 4 Chiều cao cây đến chùm hoa 4 (cm) Dài lá (cm) Rộng lá (cm) Dạng hình sinh trưởng PR85 - 2 - 3 6,67 3,33 16,33 111,00 37,00 24,67 Vô hạn PR85 - 65 9,33 3,33 18,00 111,33 38,67 28,00 Vô hạn PR78 - 66 4,33 1,67 10,00 47,33 31,00 24,00 Hữu hạn Bảng 4. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng cà chua ưu tú kháng bệnh sương mai trong vụ Đông Xuân Dòng Số quả/cây Khối lượng quả (g) Năng suất (tấn/ha) PR85 - 2 - 3 13,7 113,33 54,21 PR85 - 65 14,3 122,33 61,37 PR78 - 66 15,7 65,67 36,00 3.2. Chọn tạo dòng kháng bệnh xoăn vàng lá (TYLCV) Mẫu g iống Gc171 và Gc173 tạo ra từ chương trình giống phối hợp giữa đại học Wisconsin, Đại học Florida (USA) và đại học San Carlos (Guatemala) được dùng để tạo ra các dòng kháng cao với bệnh xoăn vàng lá. Chỉ thị Ty - seminis và FLUM25 cho thấy dòng AV3 đồng hợp tử cả 2 gen Ty1 và Ty3, các dòng khác chỉ đồng hợp tử gen Ty3 (bảng 5, hình 3, hình 4). Không biểu hiện bất kỳ dấu hiệu bệnh trên các cá thể của dòng đồng thời mang 2 gen kháng. Một số cá thể của dòng mang 1 gen Ty3 đồng hợp tử xuất hiện vết vàng nhẹ ở mép lá non, cây vẫn sinh trưởng bình thường. Giống Anna không mang gen kháng, toàn bộ cây không sinh trưởng, lá xoăn vàng, biến dạng. Bảng 5. Tính kháng bệnh xoăn vàng lá của các dòng cà chua mới chọn tạo T y - seminis (Ty1) Dòng (bp ) FLUM2 5 (Ty3) (bp) Chỉ số bệnh Đánh giá tính kháng AV3 303 641 0,0 Kháng AV8 398 641 0,2 Chống chịu E1 398 641 0,3 Chống chịu Gc171 398 641 0,2 Chống chịu Gc173 303 641 0,0 Kháng ANNA 398 475 3,5 Nhiễm Hình 3. Ảnh điện di xác định gen Ty1 bằng chỉ thị phân tử Ty - seminis (M - 100 bp ladder marker, 1 - AV3, 2 - AV8, 3 - E1, 4 - Gc171, 5 - Gc173, 6 - Anna) 500bp M 1 2 3 4 5 6 485 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Hình 4. Ảnh điện di xác định gen Ty3 bằng chỉ thị phân tử FLUM25 (M - 100 bp ladder marker, 1 - AV3, 2 - AV8, 3 - E1, 4 - Gc171, 5 - Gc173, 6 - Anna) Các dòng kháng bệnh xoăn vàng lá mới chọn tạo đều thuộc nhóm sinh trưởng hữu hạn, khối lượng quả trung bình. Dòng AV3 và AV8 dạng quả tròn, dòng E1 dạng quả oval. Mặc dù các dòng đã được cải tiến về năng suất so với giống gốc nhưng chỉ đạt dưới 35 tấn/ha. Bảng 6. Đặc điểm nông sinh học của các dòng cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá Dòng Dạng sinh trưởng Khối lượng quả Dạng quả Brix (%) Năng suất (tấn/ha) AV3 Hữu hạn 85,7 Tròn 4,53 24,21 AV8 Hữu hạn 92,67 Tròn 4,67 21,70 E1 Hữu hạn 63,67 Oval 5,00 35,42 Gc171 Hữu hạn 19,00 Oval 5,00 7,74 Gc173 Hữu hạn 105,00 Oval 4,67 11,05 3.3. Tạo tổ hợp lai kháng bệnh sương mai và bệnh xoăn vàng lá Với mục tiêu tạo các tổ hợp lai F 1 nhằm phối hợp các gen kháng bệnh từ các dòng bố mẹ vào giống lai và khai thác hiệu quả của ưu thế lai, dòng kháng bệnh sương mai được lai với dòng kháng bệnh xoăn vàng lá. Gene Ty1 ở dạng dị hợp tử chỉ xuất hiện ở 2 tổ hợp lai dùng dòng AV3, tương tự kiểu gen của Savior (bảng 7, hình 5). Với đặc điểm mang gen Ty1 nên giống Savior thể hiện tính kháng bệnh xoăn vàng lá, đó là cơ sở để giống này được trồng phổ biến ở các tỉnh phía Bắc trong nhiều năm qua. Các tổ hợp lai khác chỉ mang gen Ty3 dị hợp tử (hình 6) nhưng tính kháng bệnh xoăn vàng lá không sai khác rõ rệt với tổ hợp mang cả 2 gen Ty1 và Ty3. Các tổ hợp lai thể hiện tính kháng bệnh TYLCV khác biệt so với giống không mang gen kháng (hình 7). Tất cả các tổ hợp lai đều mang gen Ph3 dị hợp tử và thể hiện tính kháng bệnh sương mai cao. Sau khi lây bệnh nhân tạo trên toàn cây, thân lá của giống Savior và Anna bị hại toàn bộ. Trái lại, chấm nhỏ vết bệnh được cô lập trên lá của các tổ hợp lai. Bảng 7. Tính kháng bệnh sương mai và bệnh xoăn vàng lá của các tổ hợp lai Bệnh xoăn vàng lá Bệnh sương mai Tổ hợp lai Ty1( bp) Ty3(bp) Chỉ số bệnh Ph3(bp) Chỉ số bệnh PR85 - 2 - 3  AV8 398 475/641 0,67b 249/482 1,30b PR85 - 2 - 3  AV3 303/398 475/641 0,33b 249/482 1,40b AV3  PR85 - 65 303/398 475/641 0,00b 249/482 1,40b PR78 - 66  E1 398 475/641 0,33b 249/482 1,67b Savior (F 1 Syngenta) 303/398 641 0,67b 482 5,33a Anna (F 1 Seminis) 398 641 3,33a 482 5,00a 500bp M 1 2 3 4 5 6 486 Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 500bp M 1 2 3 4 5 6 Hình 5. Ảnh điện di xác định gen Ty1 bằng chỉ thị phân tử Ty - seminis của các tổ hợp lai (M - 100 bp ladder marker, 1 - PR85 - 2 - 3  AV8, 2 - PR85 - 2 - 3  AV3, 3 - AV3  PR85 - 65, 4 - PR78 - 66  E1, 5 - Savior, 6 - Anna) 500bp M 1 2 3 4 5 6 Hình 6. Ảnh điện di xác định gen Ty3 bằng chỉ thị phân tử FLUM25 của các tổ hợp lai (M - 100 bp ladder marker, 1 - PR85 - 2 - 3  AV8, 2 - PR85 - 2 - 3  AV3, 3 - AV3  PR85 - 65, 4 - PR78 - 66  E1, 5 - Savior, 6 - Anna) 1 2 3 4 Hình 7. Biểu hiện tính kháng bệnh xoăn vàng lá (TYLCV) của các tổ hợp lai (1 - Anna, 2 - PR85 - 2 - 3  AV8, 3 - AV3  PR85 - 65, 4 - PR78 - 66  E1) 487 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 500bp M 1 2 3 4 5 6 Hình 8. Ảnh điện di xác định gen Ph3 bằng chỉ thị phân tử LB3 của các tổ hợp lai (M - 100 bp ladder marker, 1 - PR85 - 2 - 3  AV8, 2 - PR85 - 2 - 3  AV3, 3 - AV3  PR85 - 65, 4 - PR78 - 66  E1, 5 - Savior, 6 - Anna) 2 1 Hình 9. Biểu hiện tính kháng bệnh sương mai của các tổ hợp lai 1 - Anna 2 - PR85 - 2 - 3  AV8 3 - AV3  PR85 - 65) 3 Xét tổng thể, ưu thế lai về năng suất, khối lượng quả thể hiện rõ nhất ở tổ hợp lai PR78 - 66  E1, trong tổ hợp này không những phối hợp được cả 2 gen kháng bệnh mà còn tăng được khối lượng quả và năng suất so với cả 2 dòng bố mẹ. Tuy nhiên, do sinh trưởng hữu hạn nên tổ hợp năng suất của tổ hợp này thấp hơn các tổ hợp khác. Các dòng PR85 - 2 - 3, PR85 - 65 sinh trưởng vô hạn nên tổ hợp lai tương ứng của chúng cũng có dạng hình sinh trưởng này. Năng suất của các tổ hợp lai với dòng PR85 - 2 - 3, PR85 - 65 không thể hiện ưu thế lai rõ, nhưng các tổ hợp này đã phối hợp được các nguồn gen kháng bệnh chính. Một số tổ hợp có năng suất tương đương giống đối chứng (Savior). 488 Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất Bảng 8. Đặc điểm quả và năng suất các tổ hợp lai kháng bệnh xoăn vàng lá và sương mai (vụ Đông Xuân) Tổ hợp lai Khối lượng quả (g) Brix (%) Dạng quả Năng suất (tấn/ha) PR85 - 2 - 3  AV8 100,3 5,3 oval 53,83c PR85 - 2 - 3  AV3 110,3 5,3 oval 62,73a AV3  PR85 - 65 125,0 5,0 oval 58,40b PR78 - 66  E1 80,7 4,7 oval 53,53c Savior (F 1 Syngenta) 92,7 4,3 oval 57,80b IV. KẾT LUẬN Bằng chỉ thị phân tử đã chọn tạo được 4 tổ hợp lai F 1 cà chua mang đồng thời cả gen kháng bệnh sương mai và bệnh xoăn vàng lá. Thông qua lây bệnh nhân tạo, các tổ hợp lai đều thể hiện tính kháng bệnh cao với 2 bệnh sương mai và xoăn vàng lá. Các tổ hợp lai đều có chất lượng quả tốt (màu đỏ, khối lượng trung bình, dạng oval, Brix ~5%), năng suất trên 50 tấn/ha. Chúng cần được tiếp tục khảo nghiệm để giới thiệu cho sản xuất. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bai Y., C - C. Huang, R. Van der Hulst, F. Meijer - Dekens, G. Bonnena, P. Lindhout (2003). QTLs for tomato powdery mildew resistance (Oidium lycopersici) in Lycopersicon parviflorum G1.1601 colocalize with two qualitative powdery mildew resistance genes. Mol Plant Microbe interact 16:169 - 176. 2. Chunwongse, J., Chunwongse, C., Black, L. L., and Hanson, P. (2002). Molecular mapping of the Ph - 3 gene for late blight resistance in tomato. J. Hortic. Sci. Biotechnol. 77:281 - 286. 3. Fry, W.E., S.B Goodwin, J.M. Matuazak, L.J. Spielman, and M.G. Milgroom (1992). Population genetic and international migrations of Phytophthora infestans. Ann. Rev. Phytopathol. 30, 107 - 129 4. Goodwin, S.B., J.L. Spielman, J.M. Matuszak, S.N. Bergeron, and W.E. Fry (1992). Clonal diversity and genetic differentiation of Phytophthora infestans population in Northern and Central Mexico. Phytopathol. 82, 955 - 961. 5. Grube, R.C., E.R. Radwanski, M. Jahn (2000). Comparative genetics of disease resistance within the solanaceae genetics 155:873 - 887. 6. Ha Viet Cuong, Le Van Hai, Tran Ngoc Tiep and Ngo Bich Hao (2011). Molecular characterization of Tomato leaf curl Hainan virus and Tomato leaf curl Hanoi virus in Vietnam. J. ISSAAS. Vol. 17, No. 2:70 - 82. 7. Ji, Y., D.J. Schuster, and J.W. Scott (2007). Ty - 3, a begomovirus resistance locus near the Tomato yellow leaf curl virus resistance locus Ty - 1 on chromosome 6 of tomato. Mol. Breed. 20:271 - 284. 8. Nguyễn Văn Viên (1998). Bệnh mốc sương cà chua ở vùng Hà Nội và hiệu lực phòng chống của một số thuốc trừ bệnh.Tạp chí BVTV, số 160, trang 11 - 14. 9. Pico, B., M.J. Diez, and F. Nuez (1996). Viral diseases causing the greatest economic losses to the tomato crop. II. The tomato yellow leaf curl virus: A review. Sci. Hortic. 67:151 - 196. 10. Rick, C.M., J.F. Fobes (1974). Association of an allozyme with nematode resistance. Tomato Genet Coop Rep 24:25. 11. Rubin, E., A. Baider & Y. Cohen (2001). Phytophthora infestans produces oospores in fruits and seeds of tomato. Phytopathology 91:1074 - 1080. 12. Stevens M. A. and C. M. Rick (1986). “Genetics and breeding,” in The Tomato Crop: A Scientific Basis for Improvement, J. G. Atherton and J. Rudich, Eds., pp. 35 - 109, Chapman and Hall, New York, NY, USA. 13. Tanksley, S.D., C.M. Rick (1980). Isozymic gene linkage map of the tomato: applications in genetics and breeding. Theor Appl Gene t 57:161 - 170. 14. Tanksley, S.D., N.D. Young, A.H. Paterson, M.W.Bonierbale (1989). RFLP mapping in plant breeding: New tools for an oldscience. Biotechnology 7: 257 - 264. 15. Tigchelaar E. C. (1986). “Tomato breeding,” in Breeding for Vegetable Crops, M. J. Bassett, Ed., pp. 135 - 171, AVI, Westport, Conn, USA. 16. Trịnh Khắc Quang, Trần Ngọc Hùng (2012). Xác định nguồn gen thích hợp phục vụ tạo giống cà chua chống chịu bệnh sương mai (Phytophthora infestans) tại Việt Nam.Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. ISSN 1859 - 4581. 16/2012. 59 - 65. 489 . nhất NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG CÀ CHUA LAI (F 1 ) CHỐNG CHỊU BỆNH SƯƠNG MAI (Phytophthora infestans de Bari) VÀ BỆNH XOĂN VÀNG LÁ (TYLCV) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ Trần Ngọc Hùng Viện Nghiên cứu. đầu nghiên cứu chọn tạo giống cà chua ưu thế lai (F 1 ) chống chịu bệnh sương mai (Phytophthora infestans) và bệnh xoăn vàng lá (TYLCV) bằng chỉ thị phân tử được thực hiện và trình bày trong. nhiều vùng cà chua phía Bắc. Kết quả đề tài Chọn tạo giống cà chua chống chịu bệnh sương mai (Phytophth ora infestans) bằng chỉ thị phân tử , đã xá c định được chỉ thị phân tử và tạo được