Đang tải... (xem toàn văn)
slide Thiết kế khung bê tông cốt thép nhà dân dụng tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn...
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM THỊ NHÀN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG VIỆC PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA E.COLI GÂY TIÊU CHẢY Ở NGƯỜI ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN Người hướng dẫn khoa học: ThS. NGUYỄN PHÚ HÙNG THÁI NGUYÊN - 2010 NỘI DUNG BÁO CÁO 1. Mở đầu 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3. Kết quả và thảo luận 3. Kết quả và thảo luận 4. Kết luận và kiến nghị 4. Kết luận và kiến nghị MỞ ĐẦU MỞ ĐẦU Tiêu chảy là một vấn đề sức khỏe toàn cầu. Một trong những Tiêu chảy là một vấn đề sức khỏe toàn cầu. Một trong những nguyên nhân phổ biến gây tiêu chảy ở trẻ em là do vi khuẩn nguyên nhân phổ biến gây tiêu chảy ở trẻ em là do vi khuẩn E.coli. E.coli. Việc xác định nhanh các nhóm Việc xác định nhanh các nhóm E.coli E.coli bằng các kỹ thuật có độ bằng các kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao sẽ có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nhạy và độ đặc hiệu cao sẽ có ý nghĩa rất quan trọng trong việc lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân. lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân. Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định E.coli E.coli gây tiêu gây tiêu chảy. Trong đó, PCR là phương pháp được sử dụng hữu hiệu chảy. Trong đó, PCR là phương pháp được sử dụng hữu hiệu nhất. nhất. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài đề tài “ “ Ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện các Ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện các gen độc lực của gen độc lực của E.coli E.coli gây tiêu chảy ở người”. gây tiêu chảy ở người”. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu nhằm phát hiện các gen độc lực của 5 nhóm E.coli gây bệnh tiêu chảy ở người, làm tiền đề cho việc tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán các nhóm E.coli gây tiêu chảy. MỞ ĐẦU MỞ ĐẦU NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Tách DNA tổng số từ khuẩn lạc E.coli Khuếch đại các gen độc lực đặc trưng của 5 nhóm E.coli MỞ ĐẦU MỞ ĐẦU ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Các chủng Các chủng E.coli E.coli chuẩn Quốc tế do Phòng chuẩn Quốc tế do Phòng Vi khuẩn đường ruột - Viện Vệ sinh dịch tễ Vi khuẩn đường ruột - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, gồm có: EPEC, EHEC1, Trung ương cung cấp, gồm có: EPEC, EHEC1, EHEC2, EIEC, ETEC, EAEC và EC (chủng đối EHEC2, EIEC, ETEC, EAEC và EC (chủng đối chứng không có gen độc lực). chứng không có gen độc lực). 2. PH NG PHÁP NGHIÊN C UƯƠ Ứ 2. PH NG PHÁP NGHIÊN C UƯƠ Ứ ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose Các chủng E.coli chuẩn Quốc tế Các chủng E.coli chuẩn Quốc tế Nuôi cấy qua đêm trên môi trường MPA đặc, thu khuẩn lạc Nuôi cấy qua đêm trên môi trường MPA đặc, thu khuẩn lạc Tách DNA trực tiếp từ khuẩn lạc Tách DNA trực tiếp từ khuẩn lạc Khuếch đại gen bằng phản ứng PCR Khuếch đại gen bằng phản ứng PCR Hình 2.1. Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu Bảng 2.1. Các trình tự mồi được sử dụng trong các phản ứng PCR Gen độc lực Cặp mồi (primer) Trình tự primer (5’ → 3’) Kích thước sản phẩm PCR (bp) vt2 VT2 - F VT2 - R ACCGTTTTTCAGATTTTGCACATA TACACAGGAGCAGTTTCAGACAGT 298 vt1 VT1 - F VT1 - R GAAGAGTCCGTGGGATTACG AGCGATGCAGCTATTAATAA 130 elt LT - F LT - R TCTCTATGTGCATACGGAGC CCATACTGATTGCCGCAAT 322 eae eae - F eae - R CACACGAATAAACTGACTAAAATG AAAAACGCTGACCCGCACCTAAAT 376 IpaH IpaH - F IpaH - R GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCC GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC 620 EAST1 EA - F EA - R CTGGCGAAAGACTGTATCAT CAATGTATAGAAATCCGCTGTT 630 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước khử ion 12,5 2 PCR Buffer (10X) 2,5 3 dNTPs (25mM) 2 4 MgCl 2 (25mM) 2,5 5 Mồi xuôi (10pM/mồi) 1 6 Mồi ngược (10pM/mồi) 1 7 DNA khuôn 3 8 Taq DNA polymerase (5 unit/µl) 0,5 Tổng thể tích 25 Các bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Tác dụng 1 94 0 C 3 phút 1 Biến tính 2 94 0 C 52 0 C 72 0 C 1 phút 1 phút 1 phút 30 Biến tính Gắn mồi Tổng hợp chuỗi 3 72 0 C 10 phút 1 Tổng hợp chuỗi 4 4 0 C ∞ Ổn định mẫu Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR [...]... 7 EC Tóm tắt kết quả khuếch đại các gen độc lực của 5 nhóm E.coli Bảng 3.1 Kết quả khuếch đại các gen độc lực của 5 nhóm E.coli Nhóm EPEC EHEC1 Gen EHEC2 EAEC EIEC ETEC EC eae + + + - - - - vt1 - + - - - - - vt2 - - + - - - - IpaH - - - - + - - EAST1 - - - + - - - elt - - - - - + - Ghi chú: EHEC1 và EHEC2 là hai phân nhóm của nhóm EHEC + : Dương tính - : Âm tính KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1 KẾT LUẬN Đã tách... 603 bp 270 bp 376 bp Hình 3.1 Kết quả khuếch đại gen eae M Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 ETEC; 3 EHEC1; 4 EAEC; 5 EHEC2; 6 EIEC; 7 EC 2.2 Gen độc lực vt1 M 1 2 3 4 5 6 7 130 bp Hình 3.2 Kết quả khuếch đại gen vt1 M Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1 EHEC1; 2 EC; 3 III EAEC; 4 EPEC; 5 EHEC2; 6 EIEC; 7 ETEC 2.3 Gen độc lực vt2 M 1 2 3 4 5 6 7 298 bp Hình 3.3 Kết quả khuếch đại gen vt2 M Marker... 3 4 5 6 7 322 bp Hình 3.4 Kết quả khuếch đại gen elt M Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 EHEC1; III 3 EHEC2; 4 ETEC; 5 EAEA; 6 EIEC; 7 EC 2.5 Gen độc lực IpaH M 1 2 3 4 5 6 7 620 bp Hình 3.5 Kết quả khuếch đại gen IpaH M Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 III EIEC; 3 EHEC1; 4 EHEC2; 5 ETEC; 6 EAEC; 7 EC 2.6 Gen độc lực EAST1 M 1 2 3 4 5 6 7 630 bp Hình 3.6 Kết quả khuếch đại gen EAST1...KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1 KẾT QUẢ TÁCH DNA TRỰC TIẾP TỪ KHUẨN LẠC DNA được tách chiết trực tiếp từ khuẩn lạc E.coli bằng phương pháp của Cebula và cộng sự (1995) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm Ưu điểm: - Tổng thời gian tách DNA là 25 phút - Không phải tiêu tốn nhiều hóa chất - Lượng DNA thu được là rất nhỏ, nên có thể sử dụng trực tiếp để làm khuôn cho... phương pháp tách DNA trực tiếp từ khuẩn lạc, tiết kiệm được nhiều thời gian và hoá chất nghiên cứu Khuếch đại thành công các gen độc lực đặc trưng của 5 nhóm E.coli là: eae, vt1, vt2, IpaH, elt, EAST1 Kết quả nghiên cứu này là tiền đề cho nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi để tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán tác nhân gây bệnh là E.coli 2 KIẾN NGHỊ Tiếp tục phát triển nghiên cứu và phát triển thành kĩ thuật . phương pháp nghiên cứu 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3. Kết quả và thảo luận 3. Kết quả và thảo luận 4. Kết luận và kiến nghị 4. Kết luận và kiến nghị MỞ ĐẦU MỞ ĐẦU Tiêu chảy là một vấn đề. nhiều phương pháp được sử dụng để xác định Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định E.coli E.coli gây tiêu gây tiêu chảy. Trong đó, PCR là phương pháp được sử dụng hữu hiệu chảy. Trong. nhóm của nhóm EHEC + : Dương tính - : Âm tính Tóm tắt kết quả khuếch đại các gen độc lực của 5 nhóm E.coli Gen Nhóm KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 2. KIẾN NGHỊ Tiếp tục phát triển