Mục lục MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng2.1: nh hưởng của các vò thuốc bắc đến sự phát triển của nấm men và nấm mốc 7 Bảng2. 2: nh hưởng của một số acid đến hoạt động của nấm men 13 Bảng 2.3: Thành phần hóa học lúa gạo 15 Bảng 2.4: Thành phần hóa học một số loại gạo tẻ theo mức độ chế biến 16 Bảng 2.5: Thành phần hóa học một số loại gạo trên thò trường 17 Bảng 4.1: Các chủng vi khuẩn phân lập được từ bánh men rượu Bầu Đá 31 Bảng 4.2: Các chủng nấm men và nấm mốc phân lập được từ bánh men rượu Bầu Đá 32 Bảng 4.3: Đònh lượng vi sinh vật có trong bánh men rượu Bầu Đá 32 Bảng 4.4: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng vi sinh vật trong bánh men rượu Bầu Đá 33 Bảng 4.5: Nồng độ rượu trong dòch giấm khi lên men với các chủng nấm men phân lập được 35 Bảng 4.6: nh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến quá trình lên men rượu 38 Bảng 4.7: nh hưởng của tỉ lệ nước dùng đồ chín gạo đến quá trình lên men rượu. 41 Bảng 4.8: Ảnh hưởng của tỉ lệ nước dùng pha loãng dòch lên men ẩm đến quá trình lên men rượu 42 Bảng 4.9: nh hưởng của thời gian lên men ẩm đến quá trình lên men rượu 45 Bảng 4.10: nh hưởng của thời gian lên men lỏng đến quá trình lên men rượu 45 Bảng 4.11: nh hưởng của nồng độ SO 2 đến mức độ tạp 48 Bảng 4.12: nh hưởng của nồng độ SO 2 sau 2 giờ xử lý đến quá trình lên men rượu 49 Bảng 4.13: So sánh chất lượng bánh men sản xuất, bánh men thò trường và phương pháp sản xuất trực tiếp bằng chủng vi sinh vật thuần khiết 51 Luận văn tốt nghiệp Danh mục bảng biểu DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Qui trình sản xuất bánh men thuốc bắc theo phương pháp truyền thống. 5 Hình 2.2: Qui trình sản xuất rượu gạo theo phương pháp truyền thống từ bánh men thuốc bắc 9 Hình 2.3: Tế bào nấm men qua kính hiển vi 9 Hình 2.4: Nấm men Saccharomyces 20 Hình 2.5: Chủng nấm mốc Aspergilus 22 Hình 2.6: Chủng nấm mốc Mucor 23 Hình 2.7: Vi khuẩn Bacillus Subtilis 24 Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu 26 Hình 3.2: Qui trình sản xuất rượu từ bánh men thuốc bắc trong nghiên cứu 28 Hình 3.3: Buồng đếm Thoma 30 Hình 4.1: Vòng phân giải tinh bột của chủng VK1 34 Hình 4.2: Vòng phân giải tinh bột của chủng VK2 34 Hình 4.3: Vòng phân giải tinh bột của chủng M1 34 Hình 4.4: Vòng phân giải tinh bột của chủng M2 34 Hình 4.5: Vòng phân giải tinh bột của chủng NM1 34 Hình 4.6: Vòng phân giải tinh bột của chủng NM3 34 Hình 4.7: Bánh men thành phẩm, sản xuất từ các chủng giống phân lập được và từ chủng mốc phòng thí nghiệm (BM1) 37 Hình 4.8: nh hưởng của tỉ lệ bánh men đến nồng độ rượu trong dòch sau lên men ẩm và dòch sau lên men lỏng 39 Hình 4.9: nh hưởng của tỉ lệ bánh men đến hiệu suất lên men 39 Hình 4.10: nh hưởng của sự thay đổi tỉ lệ bánh men đến pH dòch sau lên men ẩm và dòch sau lên men lỏng 40 Hình 4.11: nh hưởng của tỉ lệ nước dùng đồ chín gạo đến hiệu suất lên men 41 Hình 4.12: Ảnh hưởng của tỉ lệ nước pha vào dòch lên me n ẩm đến hiệu suất lên men 42 Hình 4.13: Ảnh hưởng của thời gian lên men ẩm và thời gian lên men lỏng đến độ rượu 46 Hình 4.14: Ảnh hưởng của thời gian lên men ẩm đến hàm lượng tinh bột sót và đường sót 47 Hình 4.15: Ảnh hưởng của thời gian lên men lỏng đến hàm lượng tinh bột sót và đường sót 47 Hình 4.16: nh hưởng của nồng độ SO 2 đến quá trình hiệu suất lên men 49 Luận văn tốt nghiệp Danh mục bảng biểu Hình 4.17: So sánh hiệu suất lên men của 3 mẫu M1, M2 và M2 51 Hình 4.18: Qui trình sản xuất rượu gạo dùng bánh men thuốc bắc 52 CHƯƠNG 1 - MỞ ĐẦU Cồn rượu là một trong những sản phẩm thực phẩm xuất hiện sớm nhất và được con người sử dụng rộng rãi nhất. Công nghệ sản xuất cồn đã xuất hiện từ khoảng 6000 – 8000 năm trước công nguyên. Tuy nhiên, mãi đến thế kỷ XII – XIII người ta mới tiến hành sản xuất theo qui mô công nghiệp. Ban đầu, để sản xuất cồn từ tinh bột, ở châu Á, người ta thường dùng các loại bánh men truyền thống; còn ở châu u và châu Mỹ, người ta dùng chế phẩm enzym thu nhận được từ malt để đường hóa. Theo thời gian, công nghệ sản xuất cồn rượu ngày càng được hoàn thiện. Từ bánh men thuốc bắc, thuốc nam của người châu Á, các nhà khoa học đã phân lập được các giống VSV thuần khiết có khả năng đường hóa cao và ứng dụng thành công trong công nghiệp như: nấm Rhizopus và Mucor (trong phương pháp amylose) hay loài nấm sợi Aspergillus trong phương pháp mycomalt. Ngày nay, thay vì công đoạn nuôi cấy mốc, người ta sử dụng trực tiếp chế phẩm enzym công nghiệp trong công đoạn đường hóa, làm tăng hiệu suất lên đường hóa cũng như hiệu suất lên men rất nhiều. Các phương pháp sản xuất rượu theo qui mô công nghiệp trên có một nhược điểm là yêu cầu điều kiện vô trùng nghiêm ngặt. Trong khi đó, việc sản xuất rượu gạo theo phương pháp truyền thống bằng chế phẩm bánh men thuốc bắc không đòi hỏi điều kiện nghiêm ngặt về vi sinh, lại thu được rượu có hương vò thơm ngon. Do đó, những nghiên cứu gần đây có xu hướng quay lại công nghệ lên men rượu truyền thống. Hầu hết các nghiên cứu đều nhằm nâng cao và ổn đònh hiệu suất của lên men truyền thống: nghiên cứu phân lập, ứng dụng những chủng giống đặc hiệu vào lên men rượu truyền thống ở Nhật Bản, Philipines, Trung Quốc… Trong nước, hiện đã có nhiều nghiên cứu về những đặc tính của những chủng giống nấm men, nấm mốc phân lập từ bánh men thuốc bắc; nghiên cứu ứng dụng loại bánh men có bổ sung hỗn hợp nấm mốc trong lên men rượu gạo có kiểm soát; nghiên cứu ảnh hưởng của các vò thuốc lên hệ vi sinh vật trong bánh men… Trong nghiên cứu này, chúng tôi muốn khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình sản xuất rượu gạo từ bánh men thuốc bắc (do chúng tôi sản xuất) theo phương pháp truyền thống; Chọn ra qui trình sản xuất để thu được rượu có nồng độ cồn cao, hương vò tốt. Kết quả thành công có thể ứng dụng để sản xuất rượu trong thực tiễn. Luận văn tốt nghiệp Danh mục bảng biểu Luận văn tốt nghiệp Chương 2 Tổng quan tài liệu CHƯƠNG 2 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ RƯU VÀ RƯU GẠO CỔ TRUYỀN 2.1.1 Rượu etylic và ứng dụng [10, 12, 14] Rượu etylic (ethanol) là một chất lỏng không màu, trong suốt, có vò nóng gắt và mùi đặc trưng. Công thức phân tử là C 2 H 5 OH, tỉ trọng d 20 = 0.7894, nhiệt độ sôi ở 760mmHg là 78 0 C, bốc cháy ở 12 0 C, hòa tan trong nước theo bất kỳ tỉ lệ nào. Từ xa xưa, loài người đã biết sản xuất ra rượu etylic (cồn) làm đồ uống và cho đến ngày nay, nghề làm rượu – cồn vẫn đang phát triển mạnh.[12] Rượu etylic (cồn etylic) ngoài công dụng làm đồ uống, còn được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau: để pha chế thức uống, làm dung môi cho công nghiệp sản xuất nước hoa; trong dược để trích ly các hoạt chất sinh học; nguyên liệu cho các ngành công nghiệp khác như trong công nghiệp sản xuất acid acetic, andehyt acetic, etyl acetat và các este có mùi thơm khác; trong sản xuất giấm ăn; trong công nghiệp sản xuất cao su tổng hợp… ; làm nhiên liệu (chất đốt)… [12, 14] Tùy tình hình phát triển ở mỗi nước, tỷ lệ cồn dùng trong các ngành rất khác nhau. Tuy nhiên, cồn đưa vào sản xuất đồ uống hầu như luôn chiếm tỷ lệ lớn nhất – 40-60% lượng cồn sản xuất được. Cồn được dùng để tăng thêm nồng độ rượu của rượu vang, dùng pha chế các loại rượu mạnh, rượu uống cao độ như Whisky, Martin, Brandy, Napoleon, Rhum…[14] Cồn còn là nguyên liệu trong sản xuất các thức uống pha chế có cồn như rượu Vodka, rượu mùi…[10] Ở một số nước châu Á như Việt Nam và Trung Quốc, có dòng rượu ngâm thuốc được xem là có tác dụng tốt đối với cơ thể: tăng sự sảng khoái, ăn và ngủ tốt hơn, tăng sức khỏe…[14] 2.1.2 Phân loại rượu [12, 14, 18] Trước đây, rượu là tên gọi chung chỉ những hợp chất hữu cơ có nhóm chức hydroxyt (–OH) đính trực tiếp vào gốc ankyl. Tuy nhiên, ngày nay rượu thường dùng để chỉ những thức uống có chứa cồn etylic (ethanol). Ethanol dùng trong sản xuất các loại thức uống phải là cồn sản xuất bằng phương pháp lên men. Hay nói cách khác, tất cả những ngành công nghiệp sản xuất thức uống có cồn đều dựa trên quá trình sản xuất ethanol bằng con đường lên men – sử dụng các giống nấm men để lên men dòch chiết trái cây, rau củ hoặc lên men ngũ cốc để chuyển hóa đường thành rượu. [18] Có nhiều khóa phân loại rượu khác nhau; nhưng thường phân loại theo nồng độ ethanol thành 3 loại chính: rượu uống cao độ (rượu mạnh) có nồng độ rượu trên 30%V, rượu thường có nồng độ rượu từ 15-30%V và rượu uống thấp độ (rượu nhẹ) có nồng độ dưới 15%V. [14] Chương 2 Tổng quan tài liệu Ngoài ra có thể phân loại theo sự khác nhau trong qui trình sản xuất – rượu uống qua chưng cất và không qua chưng cất…rượu có qua lên men và rượu không qua lên men (rượu pha chế như rượu Vodka, rượu mùi); theo nguồn nguyên liệu – từ trái cây, ngũ cốc, rỉ đường… [12] 2.1.3 Rượu gạo cổ truyền Việt Nam [5, 6, 7, 8, 12, 14, 15, 17, 20] Việt Nam, giống như hầu hết các nước Đông Nam Á khác, tuy nằm trong vùng nhiệt đới rất đa dạng các loại trái cây, nhưng hầu như không thấy dòng sản phẩm rượu cổ truyền từ trái cây. Ngoại trừ một số rất ít sản phẩm rượu từ trái cây như rượu Tà vạt của người C’Tu, Quảng Nam… thì dòng rượu cổ truyền Việt Nam, và hầu hết các nước Đông Nam Á khác, là rượu gạo, có qua chưng cất hoặc không. Phương pháp chung để sản xuất rượu gạo là: sử dụng những canh trường vi sinh vật dạng bột trộn với gạo đã đồ chín, để lên men tạo đường (saccharifying proccess) trong vại miệng rộng và sau đó chuyển sang vại miệng hẹp hơn để lên men tạo ethanol (alcohol fermentation). Những canh trường vi sinh vật dạng bột sẽ khác nhau tùy vùng (Việt Nam: bánh men, Thái Lan: loogpang, Indonesia và Malaysia: ragi, Lào: bubod, Myanma: mochikouji, Trung Quốc: laochao…), nhưng nhìn chung phương pháp sản xuất cơ bản giống nhau: bột gạo trộn với các loại lá, rau mùi, thảo dược, hoặc gừng… và bánh men giống, đònh hình dạng viên, ủ, hong khô và để dành dùng dần. [8, 17, 20] Rượu cổ truyền Việt Nam rất đa dạng. Mỗi vùng, miền đều có những sản phẩm đặc trưng riêng và đều rất nổi tiếng: rượu đế Làng Vân – Hà Bắc, rượu Bầu Đá – Bình Đònh, rượu Gò Đen – Long An (các sản phẩm qua chưng cất); rượu cần Tây Bắc, Tây Nguyên, rượu nếp than ở miền Nam (các sản phẩm không qua chưng cất)… [8, 12, 15] Chế phẩm bánh men dùng sản xuất rượu cũng rất đa dạng và độc đáo, phân thành hai loại chính men lá và men thuốc bắc. Tùy mỗi đòa phương có thể dùng những bài lá, bài thuốc bắc khác nhau. Mùi vò rượu thành phẩm phụ thuộc rất nhiều vào các loại lá, các vò thuốc và số lượng dùng trong bánh men. Men thuốc bắc có thể dùng bài 6 vò, 8 vò hay 10 vò… Men lá ở vùng Tây Nghệ An dùng nhiều loại lá: lá mít, lá mía, lá nhân trần, lá quế… Trong khi men lá ở Tây Nguyên dùng chỉ một, hai hoặc ba thứ lá: cây ‘đoòng’, cây ‘me-khà-zút’ (tên các loại cây của người Tây Nguyên)…, dùng cả thân cây và lá cây. [12] Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi chỉ tiến hành nghiên cứu với dòng rượu qua chưng cất rất phổ biến trong dân gian, còn gọi là rượu đế hay rượu trắng, sử dụng chế phẩm bánh men thuốc bắc để lên men từ gạo. Chương 2 Tổng quan tài liệu 2.1.3.1 Giới thiệu bánh men thuốc bắc và qui trình sản xuất bánh men thuốc bắc theo phương pháp truyền thống [5, 6, 7, 8, 14, 17] Bánh men thuốc bắc là một loại men rượu được sản xuất thủ công tại Việt Nam. Mỗi đòa phương và mỗi dân tộc có phương pháp sản xuất riêng. Trong chế phẩm bánh men thuốc bắc chứa nhiều giống vi sinh vật thuộc vi khuẩn, nấm men và nấm mốc (nấm sợi). Thực chất, men thuốc bắc là canh trường không thuần khiết của hệ vi sinh vật có khả năng sinh trưởng tổng hợp hệ enzym đường hóa và lên men rượu. Nguyên liệu chính để sản xuất bánh men thuốc bắc là: bột gạo, men giống và các vò thuốc bắc. Qui trình sản xuất theo phương pháp truyền thống như sau: Hình 2.1: Qui trình sản xuất bánh men thuốc bắc theo phương pháp truyền thống Nước Tạo hình Gạo Làm sạch Làm ẩm Ngâm nước Để ráo Trộn men Xay thành bột Nghiền mòn Bánh men giống Nước Nghiền mòn Thuốc bắc Ủ Bánh men rượu Hong khô Chương 2 Tổng quan tài liệu  Thuyết minh quy trình Nguyên liệu làm bánh men thuốc bắc Bánh men sử dụng trong sản xuất rượu truyền thống là bột gạo ẩm trộn với bánh men giống giã nhỏ. Để tránh sự nhiễm các VSV lạ không mong muốn, khi làm bánh men, người ta bổ sung các vò thuốc bắc thu được men thuốc bắc. Men thuốc bắc: bột thuốc bắc nghiền nhỏ trộn với bột gạo ẩm và bột bánh men giống nghiền nhỏ. Làm bánh men Gạo sau khi xay thành bột được nhào trộn đều với bột thuốc bắc và men giống đã được nghiền nhuyễn, theo tỉ lệ nhất đònh. Sau đó đònh hình thành dạng viên, đặt vào các khay có lót trấu và ủ trong thời gian thích hợp để hệ vi sinh vật trong bánh men phát triển và nở xốp. Khi bánh men nở xốp, nấm mốc mọc đều và bắt đầu có mùi rượu thì tiến hành hong khô. Bánh men thành phẩm được bảo quản để dùng dần. Lưu ý hỗn hợp bột trước khi tạo hình nên có độ ẩm vừa phải, không khô quá cũng không nhão quá, thích hợp nhất là khoảng 50-55%. Nhiệt độ ủ khoảng 30- 35 o C là tốt. Nhiệt độ hong không quá 35 o C. Việc sản xuất bánh men theo phương pháp cổ truyền có những ưu và nhược điểm nhất đònh. Ưu điểm: không cần giống vi sinh vật thuần khiết, không đòi hỏi kó thuật cao, và không cần nhiều vốn đầu tư. Tuy nhiên chất lượng bánh men kém vì có nhiều tạp khuẩn dẫn đến chất lượng bánh men cũng không ổn đònh và hiệu suất lên men không cao. Ngày nay, cùng với những tiến bộ trong phân lập, nhân giống, kỹ thuật sản xuất bánh men có thay đổi: thay vì sử dụng bánh men gốc để sản xuất bánh men, người ta dùng trực tiếp chủng vi sinh vật thuần khiết để sản xuất bánh men; hoặc vẫn dùng bánh men gốc nhưng bổ sung thêm những giống thuần khiết, có hoạt lực cao để tăng chất lượng của bánh men thành phẩm.  nh hưởng của các vò thuốc bắc đến chất lượng bánh men thành phẩm [5, 6, 8, 14] Mỗi vò thuốc bắc đều chứa nhiều chất khác nhau. Đến nay ngành đông y vẫn chưa xác đònh hết các chất này, nhưng có thể tạm chia thành 3 nhóm: Nhóm chất có giá trò dinh dưỡng đối với các vi sinh vật gồm: protein, glucid, lipid, vitamin, chất khoáng và các chất kích thích sinh trưởng; Nhóm chất có tác dụng dược lý sát trùng: các tinh chất nhựa, alcaloid và các glucozid. Chính nhóm chất này giúp hạn chế nhiễm các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài trong quá trình Chương 2 Tổng quan tài liệu lên men; và nhóm chất xơ, chất màu, … không có tác dụng sát trùng cũng không có giá trò dinh dưỡng. [6, 14] nh hưởng cụ thể của các vò thuốc bắc đến sự phát triển của nấm men, nấm mốc cũng đã được một số nhà khoa học nghiên cứu. Kết quả như sau:[5] Bảng2.1: nh hưởng của các vò thuốc bắc đến sự phát triển của nấm men và nấm mốc Tên vò thuốc S. cerevisiae Nấm mốc Tế bào (x10 6 ) K (*) mg K (*) Đối chứng Nhục đậu khấu Nhục quế Bạch truật Thảo quả Cam thảo Bạc hà Tế tân Uất kim Khung cùng Tiểu hồi Phòng phong Thạch cao Tân lang Mộc hương Đinh hương Thiến niên kiện Trần bì Bạch chỉ Hoàng bá Hoàng liên 76 139.5 138.1 130.5 125.5 125.5 125.5 125.0 114.5 114.5 114.5 108.0 108.0 107.5 107.0 105.5 101.2 101.0 74.5 70.0 65.0 1.0 1.85 1.80 1.70 1.60 1.60 1.60 1.60 1.50 1.50 1.50 1.40 1.40 1.40 1.35 1.32 1.30 1.25 0.95 0.90 0.80 9.4 14.6 14.6 14.6 14.1 12.3 11.5 13.0 14.6 13.0 13.0 12.3 12.3 12.2 10.1 13.0 10.1 11.5 8.80 9.50 8.50 1.0 1.50 1.50 1.50 1.45 1.30 1.20 1.40 1.50 1.40 1.40 1.30 1.30 1.30 1.10 1.40 1.10 1.20 0.90 1.00 0.90 (*) Đại lượng K là tỉ số giữa số lượng tế bào nấm men trong bình thí nghiệm có dòch chiết vò thuốc với số lượng tế bào nấm men trong bình đối chứng (bình không có dòch chiết của các vò thuốc). Nếu K > 1: vò thuốc có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của vi sinh vật. K = 1: vò thuốc không có tác dụng kích thích hay ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật. K < 1: vò thuốc có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật. Chương 2 Tổng quan tài liệu Do đó các vò thuốc bắc vừa có tính kháng khuẩn, giúp giảm sự tạp nhiễm các loài vi sinh vật không mong muốn trong sản xuất, đồng thời còn có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của các hệ vi sinh vật chính trong bánh men. Ngoài ra, đa số các vò thuốc bắc đều có mùi thơm. Các hợp chất thơm này có thể phản ứng với nhau và với những hợp chất khác, tạo ra những hợp chất mới. Kết quả tạo ra mùi vò rất đặc trưng cho rượu cổ truyền. [6, 14] Thực tế, trong sản xuất người ta thường dùng kết hợp nhiều vò thuốc khác nhau. Người ta có thể dùng các bài thuốc bắc đầy đủ gồm 24 vò, nhưng thường chỉ sử dụng 8 – 10 vò.[8] Hầu hết các bài thuốc bắc trong thí nghiệm đều được xây dựng từ kết quả của bài nghiên cứu trên. Ví dụ về một số bài thuốc bắc được sử dụng trong sản xuất chế phẩm bánh men thuốc bắc như sau:[5, 8] + Bài 10 vò Bắc: 1-Nhục đậu khấu 3g 6-Bạc hà 2g 2-Bạch truật 2g 7-Tế tân 3g 3-Nhục quế 2g 8-Uất kim 2g 4-Thảo quả 2g 9-Tiểu hồi 2g 5-Cam thảo 2g 10-Khung cùng 2g + Bài 8 vò Bắc: 1-Nhục đậu khấu 3g 5-Cam thảo 3g 2-Bạch truật 2g 6-Bạc hà 2g 3-Nhục quế 2g 7-Tế tân 3g 4-Thảo quả 3g 8-Tiểu hồi 3g + Bài 6 vò Bắc: 1-Nhục đậu khấu 5g 4-Cam thảo 3g 2-Nhục quế 3g 5-Tế tân 3g 3-Thảo quả 3g 6-Tiểu hồi 3g Theo chứng minh ở các đề tài trước, bài thuốc bắc 8 vò là thích hợp nhất để sàn xuất bánh men thuốc bắc. Tỷ lệ thuốc bắc và bột gạo thường là 1:10, có thể thay đổi.