Isoavone extracon from okara using water as extractant Lena Jankowiak, Nikolaos Kantzas, Remko Boom, Atze Jan van der Goot . Laboratory of Food Engineering, Wageningen University, P.O. Box 17, 6700 AA Wageningen, The Netherlands Nôi dung cần làm theo: Bài báo đặt vấn đề: okara có W hơn 80%nen khi sấy mất nhiều iso;avone,để lâu dễ hỏng (Choicharoen, Devahastin, và Soponronnarit, 2010), (Perussello, Mariani, và làm Amarante, 2012; Wachiraphansakul & Devahastin, 2007). Isoflavones thuộc về một nhóm các polyphenol được cho là một phần chịu trách nhiệm về những lợi ích sức khỏe của đậu nành (CEDERROTH & Nef, 2009; Messina, Persky, Setchell, và Barnes, 1994) các thành phần hoạt tính sinh học từ sản phẩm đã trở thành một nghiên cứu khu vực quan tâm lớn (Galanakis, 2012). Mười hai isoflavone có được phân lập từ đậu tương, có thể được xếp vào bốn chính nhóm cụ thể là aglycones (daidzein, genistein và glycitein), b-glucosides (daidzin, genistin, và glycitin), các malonyl-glucosides (malonyl-daidzin, genistin malonyl-, và malonyl-glycitin), và acetyl-glucosides (acetyl-daidzin, genistin acetyl-, và acetyl-glycitin) (Wang & Murphy, 1994). Tổng nồng độ isoflavone và các isoflavone khác nhau hình thức hiện diện trong đậu nành và các sản phẩm của họ (bao gồm cả okara) phụ thuộc vào nhiều đậu nành, canh tác của mình, quá trình và lưu trữ điều kiện (Jackson và cộng sự, 2002;. Jung, Murphy, và Sala, 2008; Kao, Lu, Hsieh, và Chen, 2004; Rickert, Meyer, ông Hồ Cẩm Đào, và Murphy, 2004).; Các yếu tổ ảnh hưởng đến nồng độ isoflavone -Những thay đổi hóa học phổ biến nhất trong các hình thức isoflavone bao gồm các phản ứng khử carboxyl của malonyl để acetyl-glucosides và thủy phân este của acetyl hoặc malonyl-glucosides để b-glucosides. Phản ứng thủy phân glucosidic dẫn để tăng lượng aglycones (Coward, Barnes, Setchell, & Barnes năm 1993; Kao et al., 2004). Ngâm thời gian và nhiệt độ áp dụng trong quá trình chế biến dẫn đến lượng tăng aglycones và glucosides trong hệ thống đậu nành theo (Kao et al, 2004;. Wang & Murphy, 1996). Lạnh mài thay vì nóng nghiền bùn trong quá trình sản xuất sữa đậu nành cũng dẫn đến tăng lượng aglycones do hoạt động b-glucosidase kéo dài (Prabhakaran & Perera, 2006). Quy trình sản xuất isoflavone thường bao gồm ít nhất hai bước khai thác và tinh chế. Các bước khai thác thường sử dụng một số lượng lớn các dung môi hữu cơ Lọc : liên quan đến nhiều cột sắc ký. Bài báo nhấn mạnh đến việc khai thác isoflavone bằng dung môi thân thiện: nước- etanol(Achouri, Boye, & Belanger, năm 2005; Chang và Chang, 2007; Rostagno, Villares, Guillamon, Garcia-Lafuente, và Martinez, 2009). Bài báo thí nghiệm trên okara với nồng độ ethanol 50-70% , nhận thấy là nồng độ etanol là cao so với các dung môi được thử nghiệm liên quan đến năng suất và độ tinh khiết của chất isoflavone trong dịch chiết (Jankowiak et al., 2014). Nhận thấy cần phải sấy kho okara để tránh làm loãng etanol Vì vây bài báo lý luận dùng nước đã được thử nghiệm như là một dung môi thay thế cho khai thác isoflavone. Trong phạm vi của màu xanh lá cây công nghệ tách biệt trong chế biến thực phẩm hiện đại, dung dịch nước nhổ được xem xét trong nhiều trường hợp thuận lợi hơn về năng lượng và chi phí hơn so với bất kỳ chiết dung môi hữu cơ. hơn lý do để kiểm tra tiềm năng của nước làm dung môi là sự tồn tại isoflavone trong okara trong các hình thức glucosylated, có tính chất gợi ý khả năng hòa tan tốt trong nước. Tuy nhiên, 12 cấu trúc khác nhau isoflavone trong đậu nành có thể tạo ra khó khăn vì một số tương đối apolar. Tuy nhiên, nó có thể là một dung môi tốt để phục hồi hình thức hiện tại một cách tự nhiên từ okara, để lại các hình thức thay đổi trong okara. Bất lợi của dung môi nước : Các nghiên cứu trước cho thấy tiềm năng của việc sử dụng nước nóng, áp lực hoặc khai thác nước kiềm để tách chất flavonoid, nhưng những kết quả không thể được dịch trực tiếp cho đậu nành, vì phương pháp khai thác tối ưu và dung môi chủ yếu phụ thuộc vào các mục tiêu các hợp chất và ma trận xung quanh. polyphenol bao gồm hơn 4.000 flavonoid có khả năng hòa tan của họ phụ thuộc vào họ cấu trúc tự nhiên (Ignat, Volf, và Popa, 2011; Ko, Cheigh, và Chung, 2014). Trong trường hợp isoflavone từ đậu nành, nó được biết rằng một số các chất isoflavone trong đậu nành là khá bất ổn trong trạng thái tự nhiên của họ, và sẽ bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ cao, áp suất cao và dài thủ tục khai thác. Thành phần ma trận của okara như protein phức tạp khai thác nhắm mục tiêu của isoflavones, đặc biệt là khi sử dụng nước làm dung môi (Jankowiak et al., 2014). Thực tế là các dung môi khác, chẳng hạn như methanol và ethanol cho phép khai thác tốt (Rostagno et al., 2009) có thể giải thích tại sao chỉ có rất vài nghiên cứu đã được tiến hành sử dụng nước làm dung môi cho isoflavone đậu nành (Chang và Chang, 2007; Li-Hsun, Ya-Chuan, và Chieh-Ming, 2004). Vì vậy, việc điều tra có hệ thống xử lý khác nhau thông số trên isoflavones và sự cô lập của họ trong một nước môi trường là không thể thiếu cho một cơ sở mới với môi trường cách thân thiện để xử lý chất isoflavone. Việc lựa chọn các dung môi là một phần của quá trình thiết kế tổng thể, có thể được thực hiện dựa trên các phân vùng của isoflavone hơn các okara và giai đoạn khai thác, có thể được ước tính bằng thực nghiệm, bằng cách kết hợp các hệ số phân số octanol-nước (LogP) hoặc bằng cách ước tính các thông số độ hòa tan, dựa trên mô hình như mô hình UNIFAC / UNIQUAC (Galanakis, Goulas, Tsakona, Manganaris, và Gekas, 2013). Việc khai thác không chỉ phụ thuộc về độ hòa tan cân bằng giữa ma trận và các dung môi, mà còn phụ thuộc vào bản chất của sự gắn kết và khả năng tiếp cận của ma trận. Vì vậy chúng tôi kết hợp với các tiêu chuẩn hòa tan thử nghiệm khai thác thử nghiệm để tìm các tuyến đường quá trình thay thế cho sự phục hồi của isoflavone từ sản phẩm phụ okara. Độ tan của chất isoflavone trong một dung môi phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau. Có cấu trúc của chất tan của nó mà xác định cực / không phân cực tự nhiên, sợ nước và xu hướng hình thành liên kết hydro, mà còn các thông số như nhiệt độ, tỷ lệ pH và chất lỏng để rắn ảnh hưởng đến khả năng hòa tan isoflavone trong một dung môi. Hơn nữa, hành vi của isoflavone đối với các dung môi có thể khác nhau tùy thuộc vào ma trận họ có được chiết xuất từ (Malaypally & Ismail, 2010; Murphy, Barua, và Hauck, 2002). Mục tiêu của nghiên cứu là để điều tra tiềm năng của nước như khai thác dung môi cho sự phục hồi của isoflavone từ okara. Kết quả là so với một chiết xuất với 70% ethanol, và các thông số khác nhau kiểm tra để thảo luận về tác động của chúng trên năng suất và hồ sơ cá nhân của một chiết xuất isoflavone. 2. Nguyên liệu và phương pháp 2.1. Vật liệu Ethanol (Sigma Aldrich Công ty Schnelldorf, Đức) và Milli-Q nước (Q-Gard 2 lọc Pack, Millipore, Pháp) đã được sử dụng để khai thác. Methanol và acid formic để phân tích HPLC là mua từ Sigma Aldrich Công ty (Schnelldorf, Đức) và acetonitrile từ Biosolve BV (Valkenswaard, Hà Lan). Isoflavone cuẩn : daidzin, glycitin, genistin, daidzein, glycitein, genistein, acetyl-daidzin, acetyl-glycitin, acetyl-genistin, malonyldaidzin, malonyl-glycitin, và malonyl-genistin được mua từ Nacalai USA Inc (San Diego, Hoa Kỳ). Các mẫu chuẩn của isoflavone được hòa tan lớp phân tích DMSO (Sigma Aldrich Công ty Schnelldorf, Đức) với nồng độ 0,05-100 µ g / g đã được chuẩn bị bằng cách sử dụng methanol và được lưu trữ tại20 C?. Tất cả dung môi tách bằng HPLC. 2.2. Okara sản phẩm để ổn định okara ta làm theo hệ thống ASC50 (ProSoya Inc .; Ottawa, Canada): Đậu nành được ngâm trong 2 giờ tỉ lệ 7: 1 (14 lít nước: đậu nành 2 kg). Xay đậu ngâm, dịch sau xay được gia nhiệt bằng hệ thống hơi lên 3 phút ở 105 C, qua hệ thống khử mùi (loại bỏ thành phần không mong muốn) nhiệt độ còn 80oC Dùng phương pháp lọc ly tâm, có sản phẩm phụ okara từ sữa đậu nành. okara được lưu trữ ở 20 C trong bình kín cho đến khi phân tích. Công thức: Đậu nành khô(2kg)+nước (14kg)+hơi nước (7,2)=sữa đậu nành (20,2kg)+okara (3kg) Phương pháp xác định độ ẩm của okara: nung 60 phut ở 130oC Tách isoflavone từ okara ẩm, tính lại theo nồng độ isoflavone thực tế 2.4. Ethanol extrachtion (sự chiết xuất = ethanol ) tỉ lệ tính theo bã okara khô: rượu =1:20, nồng độ etanol tinh khiết cho vào sau đó phải đạt 70%(cái này tính toán hay đo đạc ???)rồi cho vào máy lăc 140 rpm 60 phút ở 20 C?. (Grant OLS200, Grant cụ Ltd .; Cambridge, Vương quốc Anh). L các mẫu sau đó được chiết trongEMD Millipore Amicon 8400 (Massachusetts, Mỹ). Một Whatman giấy lọc số 1 được đặt ở dưới cùng của Amicon thiết bị và áp suất không khí được áp dụng. Các mẫu được màng lọc dưới 3 atm cho đến khi không chiết xuất hơn thông qua các bộ lọc. sau đó, các chất chiết xuất ướt đã khô hoàn toàn sử dụng một chân không khô ở 45 C? và 0,1 atm. Tất cả nhổ răng được thực hiện trong ba lần 2.5. Water extractions as a function of solvent quantity (sự chiết xuất = nước như là 1 hàm hòa tan) Tỉ lệ tính theo bã okara khô: nước :okara=20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 and 100 : 1, cũng thực hiện lắc 140rpm, 20 _C , 60 phút 2.6. Water extractions as a function of temperature Biến thiên nhiệt độ lắc 20, 35, 50, 65, 80 and 95 _C 2.7. Water extraction as a function of pH BIến thiên pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10, sử dụng dung dịch 1 M HCl and 1 M NaOH solutions. The solvent to dry weight ratio in the tubes was kept at 20:1. The samples were placed in a 140 rpm shaking water bath for 60 min at 20 _C and treated as mentioned in the second paragraph of Section 2.4. 2.8. phân tích protein Hàm lượng protein của mẫu được phân tích bởi Dumas. các hàm lượng nitơ của các mẫu được xác định bằng FlashEA 1112 NC phân tích (Thermo Fisher Scientific Inc, MA, USA). mỗi mẫu được đo trong ba lần và một số chuyển đổi của 6.25 đã được sử dụng để tính toán hàm lượng protein. 2.9. phân tích isoflavone Để loại trừ bất kỳ sự khác biệt do sự đo lường phân tích, và để có được nồng độ isoflavone phù hợp trong dịch chiết cho phân tích, chiết xuất đã được sấy khô trước khi phân tích (Wang & Murphy, 1994). Máy sấy chân không (T <45 C?) Được sử dụng để có thể xử lý nhiều mẫu cùng một lúc. Chất chiết xuất đã được sấy khô hoàn toàn, và trọng lượng của các chất chiết xuất khô đã được ghi lại một cách chính xác cho tính độ tinh khiết. Sau khi kiểm tra sơ bộ với các dung môi khác nhau, 50% methanol đã được lựa chọn để hòa tan các chất chiết xuất để biết thêm Phân tích HPLC, kể từ khi hỗn hợp này hòa tan các chất chiết xuất tốt, và tiêu chuẩn isoflavone cũng được pha loãng trong methanol. Một tỷ lệ nhất định (50%) của nước là cần thiết để hòa tan chiết xuất toàn bộ. Trước khi phân tích HPLC, các chất chiết xuất hòa tan được lọc thông qua một bộ lọc Whatman Spartan 13 0.20 lm ống tiêm. Một Dionex 3000 cuối cùng hệ thống với một photodiode cơ bản tự động HPLC dò mảng (PDA) của Thermo Scientific (Massachusetts, Hoa Kỳ) đã được sử dụng để xác định nội dung của isoflavone chuẩn bị HPLC mẫu. Nhiệt độ của mẫu tự động và lò cột đã được thiết lập đến 10 và 40 ° C, tương ứng. cột được sử dụng là 2,1? 150 mm, 3 lm, dC18 Atlantis cột thu được từ Waters Corporation (Massachusetts, Mỹ). Một gradient là bao gồm hai eluents sau: 0,1% axit formic trong Nước Milli-Q và 0,1% axit formic trong acetonitrile. tiêm khối lượng là 3 ll và tốc độ dòng chảy đã được duy trì ở mức 0,3 ml / phút. Dung dịch chuẩn chứa tất cả 12 isoflavone ở dạng tinh khiết là được sử dụng để hiệu chuẩn và xác định. Các khu vực đỉnh cao của các giải pháp tiêu chuẩn và các chất chiết xuất được đo bằng Dionex Hệ thống dữ liệu Chromeleon 7 sắc ký, Thermo Scientific (Massachusetts, Mỹ), ở bước sóng 254 nm. Độ tinh khiết của chất isoflavone trong chiết xuất được thể hiện qua các Tỷ lệ khối lượng của chất isoflavone với khối lượng của tổng chiết xuất khô. 2.10. phân tích thống kê Dữ liệu được phân tích bởi phân tích phương sai (ANOVA) sử dụng IBM SPSS phiên bản 20 (SPSS Inc, Chicago, Mỹ). Sự khác biệt trong nhóm được xác định bằng cách sử dụng khác biệt đáng kể nhất (LSD) nhiều phân tích so sánh. Chênh lệch giá trị p <0,05 được là đáng kể. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. So sánh ethanol và khai thác nước dựa Độ ẩm của okara là 79 ± 1%, trong đó đã được thực hiện vào tài khoản cho các nước và 70% ethanol dung môi Các chất lỏng để rắn tỷ lệ đã được điều chỉnh đến 20: 1 (dựa trên 1 g chất rắn khô) cho cả dung môi để có được kết quả tương đương. các tổng nồng độ isoflavone do đó thu được là 479 ± 83 lg / g trong chiết xuất nước, và 1018 ± 43 trong dung dịch ethanol 70% trích xuất (Bảng 1). Hầu hết các giống đậu tương có chứa tự nhiên rất ít hoặc không có aglycones (Wang & Murphy, 1994). Nhưng khi qua chế biến nung nóng, nghiền, hoặc ngâm thường tăng lượng aglycones. Sự gia tăng này của aglycones thường có thể là do quá trình thủy phân của các hình thức khác như: malonyl-glucosides và glucosides để aglycones của mình (Jackson và cộng sự, 2002;. Jung et al, 2008;. Kao et al, 2004;. Rickert et al, 2004. Shimoni, 2004). Các okara được sử dụng trong nghiên cứu này chứa một số tiền cao aglycones, mà có thể do các coldgrinding bước dẫn đến tăng hoạt động b-glucosidase, mà còn nấu ăn tiếp theo của bùn ở 105 ° C trong vài phút. Trong thực tế, các nghiên cứu mà một số tiền cao aglycones được phát hiện trong các okara thường được sử dụng okara sản xuất trên quy mô phòng thí nghiệm. Okara sản xuất trên quy mô công nghiệp, chứa đựng một hồ sơ tự nhiên hơn isoflavones (chủ yếu là của malonyl-glucosides và b-glucosides) gần với trong đậu nành, (Rinaldi và cộng sự năm 2000,;. Surel & Hai câu, 2005), có thể do nhiệt độ thấp hơn và ngắn hơn liên lạc. Một lý do bổ sung cho nồng độ cao của aglycones trong okara được phân cực của họ thấp hơn so với người khác hình thức, mà làm cho họ ở lại dư lượng trong sữa đậu nành khai thác và phân vùng ít vào chiết xuất nước (sữa đậu nành) (Murphy et al., 2002). Sự vắng mặt hoặc nồng độ thấp của acetyl-glucosides tìm thấy trong okara (Bảng 1) là phù hợp với văn học (Jackson và cộng sự, 2002; Rinaldi và cộng sự, 2000; Surel & cặp, năm 2005; Wang & Murphy, 1996). Acetyl-daidzin và acetyl-glycitin không được xác định ở tất cả trong các mẫu, không phải bằng nước cũng không với dung dịch ethanol. Sự tập trung của acetyl-genistin là thấp hơn so với nồng độ của phần còn lại của isoflavone. Do đó, nhóm acetyl-glucosides được theo dõi, nhưng không phân tích thêm. Hình. 1 tóm tắt từng hiện nhóm isoflavone trong dung dịch nước và chiết xuất dung dịch ethanol từ okara. Trong chiết xuất ethanol, aglycones chiếm 38% tổng isoflavones, b-glucosides 35% và malonyl-glucosides 26%. Trong nước trích theo tỷ lệ cùng dung môi (Hình. 1A), các aglycones chiếm7% tổng isoflavones, b- glucosides 41% và malonyl-glucosides 51%. Các malonyl và b-glucosides nói chung là hòa tan tốt trong nước (Hinh. 1). Tuy nhiên, cũng cho glucosides không phải là toàn bộ sản lượng đã đạt được, mà mỗi chỉ độ bão hòa của glucosides trong nước hoặc tương tác của những thành phần với ma trận. Trình tự rửa giải của isoflavones như thể hiện trong Bảng 1 trùng với báo cáo của Wang và Murphy (1994). Theo họ Để rửa giải trong phân tích HPLC, các glucosides dự kiến được thậm chí còn ít hơn so với kỵ malonyl-glucosides, vì nó cũng được dự đoán bởi Murphy et al. (2002). Dựa trên những sợ nước và phân cực của hai nhóm isoflavone, nước có thể thực hiện bằng hoặc tốt hơn so với ethanol để tách các b-glucosides. Tuy nhiên, ethanol đã được chứng minh là một khai thác cao dung môi so với nước cho b-glucosides (Hình. 1A). protein đã được nghi ngờ có sự tương tác mạnh mẽ với isoflavones (Barbosa, Lajolo, và Genovese năm 2006;. Rickert và cộng sự, 2004; Speroni, Milesi, và Anon, 2010), và người ta có thể hy vọng rằng isoflavone sẽ tương tác mạnh với protein trong nước, thay vì trong ethanol (Lê Bourvellec & Renard, 2012). Trong quá trình sản xuất sữa đậu nành, các protein và isoflavone được tiếp xúc với nhau, và có thể tạo ra các phức hay uẩn. Isoflavones được cho là tương tác với các protein đậu nành bằng cách nối kỵ nước. protein đậu nành khoảng 90% hình cầu, với nội thất kỵ nước và một bề mặt ưa nước (Kinsella, 1979). Do đó, liên quan isoflavone sẽ được che dấu từ pha nước (Rawel, Kroll, và Hohl, 2001). Điều này có thể mạnh mẽ hơn cho các protein trong okara, vì họ không được khai thác trong giai đoạn dịch nước trong sản xuất sữa đậu nành, và do đó phải có nhiều hơn kỵ nước những người được trích xuất. Nói chung, một tan trong nước nhiều hơn thành phần là, ít bị nó là để tương tác với các protein, và polyphenol giải thể trong một dung môi có nhiều thuận lợi hơn so với phức với các protein (Lê Bourvellec & Renard, 2012). Do đó, b-glucosides và thậm chí nhiều hơn các aglycones với ái lực thấp hơn nước so với malonyl-glucosides có thể kết hợp nhiều mạnh với protein khi hòa tan trong nước. Bảng 1 cho thấy tỷ lệ phần trăm của từng isoflavone solubilised trong nước so với số lượng solubilised trong ethanol 70%. các phân tử genistin của từng hình thức (genistein, genistin, malonyl-genistin), với nhóm hydroxyl thêm nó vào một trong những thơm nhẫn, luôn luôn phát hiện với số lượng thấp hơn trong dung dịch nước chiết xuất hơn daidzin tương ứng hoặc glycitin. Một điều khá khác nhau hành vi của genistein và các dẫn xuất của nó đã được quan sát bởi một số tác giả (Barbosa và cộng sự, 2006;. Coward et al, 1993;. Gugger & Grabiel, 2003), và chứng minh sự phức tạp của polyphenolic các hợp chất hóa học lập thể phức tạp của họ, và những khó khăn dự đoán hành vi của họ trong các hệ thống khác nhau, ngay cả trong một nhóm các phân tử liên quan chặt chẽ như mười hai isoflavone xảy ra trong đậu nành. Nói chung, độ hòa tan tăng với số nhóm hydroxyl (Harjo, Wibowo, & Ng, 2004), nhưng nhóm hydroxyl bổ sung của loạt genistin cũng ảnh hưởng đến mức độ của ion hóa ở pH nhất định mà sẽ thay đổi kỵ nước của phân tử, và, do đó, khả năng hòa tan trong nước. Trong khi nồng độ isoflavone tổng thể trong một dung môi (Hình. 1) một thông số quan trọng, độ tinh khiết của chất isoflavone trong dịch chiết cũng quan trọng. Tỷ lệ isoflavone trong dịch chiết nước là 0,6% và trong ethanol trích 1,9% trên cơ sở khô vấn đề của các chiết xuất. Chọn lọc của nước isoflavone là, Vì vậy, ba lần ít hơn so với ethanol, có thể là do tăng khai thác các thành phần khác, chẳng hạn như protein. Do đó, sử dụng nước có thể đòi hỏi phải tinh chế thêm của chiết xuất. . Isoavone extracon from okara using water as extractant Lena Jankowiak, Nikolaos Kantzas, Remko Boom, Atze Jan van der Goot . Laboratory of Food Engineering,. hiện lắc 140rpm, 20 _C , 60 phút 2.6. Water extractions as a function of temperature Biến thiên nhiệt độ lắc 20, 35, 50, 65, 80 and 95 _C 2.7. Water extraction as a function of pH BIến thiên pH 2,. được thực hiện trong ba lần 2.5. Water extractions as a function of solvent quantity (sự chiết xuất = nước như là 1 hàm hòa tan) Tỉ lệ tính theo bã okara khô: nước :okara= 20, 30, 40, 50, 60, 70,