ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHU THỊ HƯƠNG LY NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TINH DẦU NGHỆ KẾT HỢP VỚI CHẾ PHẨM SINH HỌC NANO CHITOSAN BẢO QUẢN THANH LONG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHU THỊ HƯƠNG LY NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TINH DẦU NGHỆ KẾT HỢP VỚI CHẾ PHẨM SINH HỌC NANO CHITOSAN BẢO QUẢN THANH LONG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 40 41 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. LÊ VĂN CÁT Hà Nội – Năm 2015 1 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT. 3 DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ 4 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ 5 MỞ ĐẦU 6 Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 8 1.1. Nano chitosan 8 1.1.1. Chitosan 8 1.1.2. Phương pháp điều chế nano chitosan từ chitosan. 9 1.1.3. Hoạt tính đối kháng vi sinh vật của chitosan 12 1.1.4. Ứng dụng nano chitosan 13 1.2. Tinh dầu nghệ 15 1.2.1. Giới thiệu chung về nghệ 15 1.2.2. Thành phần hóa học 15 1.2.3. Hoạt tính sinh học của tinh dầu nghệ 18 1.3. Thanh Long 23 1.3.1. Thanh long và giá trị kinh tế 23 1.3.2. Vi sinh vật gây hỏng quả 26 1.3.3. Biện pháp bảo quản rau hoa quả tươi sau thu hoạch 28 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1. Nguyên vật liệu 32 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 32 2 1.2. Hóa chất sử dụng 32 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 33 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 34 2 2.2.1. Phương pháp đo độ đục định lượng tế bào nấm men 34 2.2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc nấm men 35 2.2.3. Phương pháp tìm nồng độ diệt tối thiểu (MBC) của hỗn hợp nano chitosan và tinh dầu nghệ cho nấm men 36 2.2.4. Phương pháp kiểm tra khả năng đối kháng nấm mốc của chế phẩm tinh dầu nghệ và nano chitosan 37 2.2.5. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính đối kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ và nano chitosan trên quả thanh long 38 2.2.6 Bảo quản thanh long trong điều kiện phòng thí nghiệm bằng NCS-TDN. 38 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1. Đánh giá khả năng đối kháng nấm men của chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ in vitro 40 3.2. Đánh giá khả năng đối kháng nấm mốc của chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ in vitro 43 3.3 Đánh giá khả năng đối kháng nấm của nano chitosan-tinh dầu nghệ in vivo trên thanh long 46 3.4. Đánh giá khả năng bảo quản thanh long bằng chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ 48 3.4.1. Bảo quản thanh long ở nhiệt độ phòng 48 3.4.2. Bảo quản thanh long ở nhiệt độ lạnh (10 ± 2 o C) 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 3 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT. ĐC: Đối chứng. Đ-d: đƣờng kính kháng khuẩn. LDL: Low – density Lipoprotein. MBC: Minimum bactericidal concentration. MTL2: Cladosporium clasdosporioides de Vries. MTL4: Cladosporium tenuisimum Cooke. NCS – TDN: Nano chitosan kết hợp với tinh dầu nghệ. OD: Optical Density. TL1: Rhodoturola sp. 4 DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 1.1: Giá trị dinh dƣỡng trong 100g quả thanh long. Bảng 2.1: Độ chuẩn Mc Farland ở bƣớc sóng 550nm. Bảng 2.2: Sơ đồ thí nghiệm xác định tính đối kháng nấm men của NCS-TDN. Bảng 3.1: Kết quả đo OD ở bƣớc sóng 550nm của mẫu TL1. Bảng 3.2: Khả năng ức chế sinh trƣởng nấm men của NCS-TDN. Bảng 3.3: Hoạt tính đối kháng nấm mốc của NCS-TDN. Bảng 3.4: Khả năng ức chế nấm của NCS-TDN trên thanh long. Bảng 3.5: Kết quả thanh long đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng. Bảng 3.6: Kết quả thanh long bảo quản lạnh 10±2 0 C. Bảng 3.7: Kết quả phân tích hàm lƣợng dinh dƣỡng của thanh long sau khi bảo quản lạnh 30 ngày. Sơ đồ 2.1: Nghiên cứu khả năng bảo quản thanh long sau thu hoạch của chế phẩm NCS-TDN. 5 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của chitosan đƣợc điều chế từ chitin. Hình 1.2: Hình thái cây nghệ Hình 1.3: Cấu trúc của các hợp chất curcumin trong tinh dầu nghệ. Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất trong tinh dầu nghệ. Hình 1.5: Vị trí và các cơ chế trong tế bào vi khuẩn đƣợc cho là điểm hoạt tính của tinh dầu. Hình 1.6: Các giống quả thanh long. Hình 1.7: Cladosporium cladospotioides. Hình 1.8: Cladosporium tenuisimum cooke. Hình 1.9: Rhodoturola sp. Hình 2.1: Pha loãng mẫu theo dãy thập phân. Hình 2.2: Cấy trải mẫu vào môi trƣờng Hansen cứng trên đĩa peptri. Hình 3.1: Đánh giá hoạt tính đối kháng nấm men TL1 của NCS-TDN. Hình 3.2: Hoạt tính đối kháng của NCS-TDN đối với MTL2. Hình 3.3: Thử hoạt tính kháng của NCS-TDN với MTL4. Hình 3.4: Thanh long bị hỏng do nhiễm nấm. Hình 3.5: Thanh long đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng. Hình 3.6: Thanh long bảo quản sau 7 ngày ở nhiệt độ phòng. Hình 3.7: Thanh long đƣợc bảo quản sau 15 ngày ở nhiệt độ phòng. Hình 3.8: Thanh long đƣợc bảo quản lạnh 10±2 o C. Hình 3.9: Thanh long đƣợc bảo lạnh sau 15 ngày. Hình 3.10: Thanh long đƣợc bảo lạnh sau 30 ngày. 6 MỞ ĐẦU Tinh dầu nghệ đƣợc biết đến nhƣ là một chất có khả năng chống oxy hóa và có tính đối kháng vi sinh vật tốt, nhất là ức chế các vi sinh vật có khả năng gây hỏng quả. Trong khi chitosan là một loại polymer carbohydrate tự nhiên đƣợc tạo ra bằng cách deacetyl hóa chitin, có thể tìm thấy trong nhiều loài động vật giáp xác, côn trùng và một vài loại nấm. Với nhiều tính năng nhƣ tính tƣơng thích sinh học, phân hủy sinh học, bám dính màng và không độc hại nên hiện nay nó trở thành nguyên liệu cho nhiều ứng dụng trong dƣợc sinh học và thực phẩm chức năng. Vì những tính chất ƣu việt của nó mà trong những năm gần đây, chitosan đã đƣợc nghiên cứu sử dụng để tạo ra các hạt nano chitosan. Cùng với tinh dầu nghệ, nano chitosan là chất có khả năng kháng nấm và vi khuẩn mạnh. Quả tƣơi và rau rất dễ bị hỏng và mẫn cảm đối với các bệnh sau thu hoạch, hạn chế thời gian bảo quản và đƣa chúng ra thị trƣờng. Ngoài ra, hƣ hỏng sau thu hoạch gây thất thu kinh tế đáng kể trên toàn thế giới. Nhƣ đã biết, các loại thuốc diệt nấm tổng hợp đƣợc sử dụng từ lâu nhƣ phƣơng thức chính để kiểm soát các bệnh sau thu hoạch. Nhƣng hiện ngƣời ta lo ngại về ảnh hƣởng của các chất này đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng cũng nhƣ sự xuất hiện của các nguồn bệnh kháng thuốc. Vì vậy cần có các biện pháp thay thế để kiểm soát nguồn bệnh sau thu hoạch có hiệu quả, dƣ lƣợng thấp, ít độc hoặc không độc đối với cơ thể không đích. Trong sản phẩm rau hoa quả của Việt Nam, quả Thanh Long đang chiếm vị trí quan trọng trong xuất khẩu, mang lại hiệu quả kinh tế cao. Vì vậy việc sử dụng các chất hoạt tính sinh học tự nhiên để bảo quản quả Thanh Long không những có ý nghĩa kinh tế, mà còn mở ra phƣơng pháp mới trong ngành bảo quản sau thu hoạch ở nƣớc ta. 7 Với đề tài nghiên cứu “ Nghiên cứu ứng dụng tinh dầu nghệ kết hợp chế phẩm sinh học nano chitosan bảo quản Thanh long” sẽ đóng góp thêm một phƣơng pháp bảo quản rau hoa quả an toàn và hiệu quả. Mục tiêu của đề tài:  Thử nghiệm in vitro chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ với vi sinh vật gây hỏng quả Thanh Long để tìm nồng độ ức chế vi sinh vật tối thiểu MBC.  Thử nghiệm chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ trên quả để kéo dài thời gian bảo quản thanh long, đảm bảo thanh long còn tƣơi, không bị vi sinh vật làm hỏng quả. Nội dung nghiên cứu:  Xác định hoạt tính đối kháng nấm của chế phẩm nano chitosan kết hợp với tinh dầu nghệ.  Nghiên cứu thăm dò ứng dụng nano chitosan kết hợp với tinh dầu nghệ trong bảo quản quả thanh long. 8 Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 1.1. Nano chitosan 1.1.1. Chitosan Chitosan, đƣợc phát hiện bởi Rouget năm 1859 [55], là một loại polymer polysaccharide sinh học quan trọng. Về mặt hóa học, đó là một phân tử có trọng lƣợng phân tử cao, polycationic gồm hai monosaccharide, N-acetyl-D-glucosamine và D- glucosamine, liên kết với nhau bởi cầu nối β-(1 → 4) glycosidic (Hình 1.1). Hàm lƣợng tƣơng đối của hai monosaccharide trong chitosan có thể khác nhau, mỗi mẫu ở các mức độ khác nhau phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa (75-95%), khối lƣợng phân tử (50- 2.000 kDa), độ nhớt, giá trị pKa, v.v [27]. Do đó, chitosan không thể đƣợc định nghĩa là một hợp chất duy nhất, nó chỉ đơn thuần là họ của các copolymer với các phân số khác nhau của các đơn vị acetyl. Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của chitosan đƣợc điều chế từ chitin. Chitosan liên kết (1→4) 2- amino-2-deoxy-β-D-glucan, đƣợc điều chế từ chitin qua quá trình thủy phân bằng kiềm nhóm N-acetyl. [...]... 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng nấm mốc và nấm men gây hỏng quả thanh long đƣợc phân lập tại phòng Công nghệ sinh học – Viện Hóa sinh biển Chế phẩm tinh dầu nghệ vàng kết hợp với nano chitosan đƣợc điều chế tại Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Quả thanh long Bình Thuận đƣợc thí nghiệm tƣơi, đạt độ chín kỹ thuật, không có thuốc trừ sâu và chất bảo quản 2 1.2 Hóa chất sử dụng Hóa chất... Sử dụng màng Chitosan Đây là sản phẩm và quy trình công nghệ do các cán bộ khoa học của Viện nghiên cứu cây ăn quả miền Nam và Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh 30 học (Trƣờng Đại học Cần Thơ) nghiên cứu thành công trong việc bảo quản các loại quả tƣơi sau thu hoạch [58] Màng bao – BQE 15 Viện Cơ điện nông nghiệp và công nghệ sau thu hoạch Việt Nam, đã triển khai đề tài "Nghiên cứu ứng dụng. .. gói, bảo quản trong nhà mát phƣơng pháp này thƣờng dùng cho quả tƣơi sau thu hoạch Ngoài ra còn sử dụng các tác nhân hóa học khác nhƣ chất bảo quản, lý học nhƣ tia cực tím, phóng xạ để bảo quản Trong những năm gần đây các cơ quan nghiên cứu khoa học Nông nghiệp ở nƣớc ta đã nghiên cứu ra một số chế phẩm bảo quản rau quả tƣơi đƣợc ứng dụng trong thực tiễn đã mang lại hiệu quả cao trong ngành bảo quản. .. lý và khả năng mang thuốc, đƣợc ứng dụng trong sinh y, cụ thể là ứng 13 dụng dẫn thuốc còn hầu nhƣ chƣa đƣợc nghiên cứu cho những ứng dụng khác (ngoại trừ nghiên cứu về axit glutamic ứng dụng cho mục đích làm chất mang thuốc paclitaxel củaViện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) [3] Trên thế giới đã có nhiều công bố ứng dụng hạt nano trong y học Hạt có kích cỡ nano có thể đƣợc tiêm tĩnh mạch... ràng, các cơ chế hoạt động không loại trừ lẫn nhau, kể từ lúc chitosan ức chế hoạt động của vi sinh vật, và cuối cùng có thể dẫn đến một quá trình giết hại 1.1.4 Ứng dụng nano chitosan Các hạt nano chitosan chủ yếu đƣợc ứng dụng trong y học nhƣ chất mang và phân phối thuốc Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu tạo hạt nano trên cơ sở polysacarit, đặc biệt là chitosan Nói chung, những hạt nano này mới... nhau Đối với vi khuẩn đƣờng ruột, sinh trƣởng của lactobacili bị ức chế bởi tinh dầu nghệ ở nồng độ 4,5-90μl/100 ml, Dịch chiết alcohol cũng có hiệu quả ức chế (10–200 mg/ml) nhƣng không bằng tinh dầu Một số tác giả đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn của dầu nghệ Jayaprakasha và cs (2002) báo cáo hoạt tính kháng khuẩn của dầu nghệ đƣợc 19 tách từ dịch mẹ sau khi đã tách lấy curcumin [30] Dầu nghệ đƣợc... giảm tấn công của vi sinh vật Vì vậy, rất cần nghiên cứu và phát triển các chất không độc có thể giảm tốc độ hƣ hại, kéo dài thời gian bảo quản Dung dịch nanochitosan – tinh dầu nghệ có thể là chất thay thế có tiềm năng cho các loại hóa chất độc hại diệt nấm hiện đang đƣợc lƣu hành trong bảo quản sau thu hoạch rau quả tƣơi hiện nay ở nƣớc ta 31 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật... còn có tác dụng chống nôn, thuốc đánh rắm và chống co thắt và làm giảm táo bón Phương thức kháng khuẩn của tinh dầu Mặc dù có rất nhiều nghiên cứu về thành phần và hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu thực vật, nhƣng cơ chế hoạt tính của chúng chƣa đƣợc nghiên cứu tỉ mỉ Do tinh dầu có rất nhiều nhóm các hợp chất hóa học khác nhau, nên có lẽ hoạt tính kháng khuẩn của chúng không do một cơ chế đặc biệt... ở thanh long và xoài, các loài thuộc chi Cladosporium gặp ở xoài ít hơn ở thanh long, ngƣợc lại các loài thuộc chi Mucor gặp ở xoài nhiều hơn so với ở thanh long [4] Các chủng nấm thƣờng gặp ở xoài và thanh long là Fusarium dimerum Penzig, Aspergillus nidulans Wint, Aspergillus fumigatus Fresenius và Aspergillus japonicus Saito[4] Phòng Công nghệ sinh học – Viện Hóa sinh biển đã phân lập từ vỏ quả Thanh. .. monoterpene của lá và các loại dầu thân rễ tƣơi tƣơng ứng là 92,9 và 16,3% Dầu thân rễ của C longa nguồn gốc Trung Quốc đƣợc phân tích bằng GC-MS [54] Dầu này đƣợc cho là chứa 17 thành phần hóa học, trong đó turmerone (24%), ar-turmerone (18%) và germacrone (11%) là các hợp chất chính 1.2.3 Hoạt tính sinh học của tinh dầu nghệ Hoạt tính chống viêm: Tinh dầu của Curcuma longa có hiệu quả chống viêm và . NHIÊN CHU THỊ HƯƠNG LY NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TINH DẦU NGHỆ KẾT HỢP VỚI CHẾ PHẨM SINH HỌC NANO CHITOSAN BẢO QUẢN THANH LONG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 40 41 . kháng nấm của nano chitosan -tinh dầu nghệ in vivo trên thanh long 46 3.4. Đánh giá khả năng bảo quản thanh long bằng chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ 48 3.4.1. Bảo quản thanh long ở nhiệt. vitro chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ với vi sinh vật gây hỏng quả Thanh Long để tìm nồng độ ức chế vi sinh vật tối thiểu MBC.  Thử nghiệm chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ trên