Đang tải... (xem toàn văn)
các bước cơ bản trong thực hành sinh học phân tử, quy trình tách chiết DNA từ tế bào động vật, quy trình và phương pháp tinh sạch DNA , cách sử dụng máy PCR, hướng dẫn cách chuẩn bị mồi cho quá trình pcr
Bài 1: MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SHPT Ngoài một số dụng cụ thường dùng cho tác thao tác vi sinh và hóa sinh, trong kỹ thuật sinh học phân tử người ta còn sử dụng một số dụng cụ đặc trưng sau: 1. Sử dụng thiết bò: Qui đònh chung: • Không sử dụng bất kỳ một thiết bò nào khi chưa được hướng dẫn sử dụng. Chỉ khởi động những thiết bò nào sắp sử dụng dưới sự hướng dẫn của ngưới trực tiếp quản lý phòng thí nghiệm. • Bao găng tay, khẩu trang, tóc cột cao (đối với những người tóc dài) để trách làm nhiễm mẫu. • Báo cáo ngay với người quản lý phòng thí nghiệm nếu phát hiện thiết bò nào hư hỏng hoặc gặp sự cố khi vận hành. Đảm bảo các thí bò hoạt động trong tình trạng tốt nhất. • Lau chùi ngay các thiết bò khi sử dụng xong, nhất là trong trường hợp vương vãi dung dòch hay hoá chất nào đó lên thiết bò. 2. Một số thiết bò thông dung trong SHPT 2.1 Micropipette(pipet man) • Kiểm tra tình trạng hoạt động của pipetman • Chỉnh về thể tích cần sử dụng. Thao tác xoắn vặn nútnê nnhẹ nhàng, trách vặn quá nhanh hoặc vặn đi vặn lại nhiều lần làm hỏng răng của các pipette. • Chọn đầu típ thích hợp cho từng loại pipette: Cỡ nhỏ: 1 - 10µl Cỡ trung bình nhỏ: 10 - 100µl Cỡ lớn: 100 - 1000µl • Các đầu típ chỉ sử dụng một lần, sau đó phải được rữa sạch và hấp khử trùng trở lại . • n nhẹ nút vặ nđể đuổi hết không khí, cho đầu típ vào dung dòch và thả từ từ để hút đúng lượng thể tích cần dùng. 2.2 ng eppendorf: • Là ống bằng nhựa polyethylene hoặc polypropylene chứa thể tích nhỏ từ 0,2 – 2 ml. các eppendorf có thể được khử trùng ở điều kiện thông thường (1atm, 120oC, 20 phút), chòu được nhiệt độ thấp -20 oC và các dung môi hữu cơ như chloroform…. • Đánh số cẩn thận các ống cần sử dụng lên nền nhám của ống. • Sau khi cho dung dòch vào ống, kiểm tra và đậy kín. Lau chùi sạch những vết hoá chất dính bên ngoài ống. 2.3 Máy ly tâm • Máy ly tâm phải luôn được vệ sinh sạch sẽ và giữ trong điều kiện khô ráo. • Khi ly tâm phải cân bằng các ống ly tâm và đặt theo kiểu đối xứng nhau từng cặp một hoặc chia đều trong rotor. • Thể tích ống ly tâm thường chiếm ¾ thể tích của ống ly tâm. Không ly tâm dung dòch quá mức cho phép. - 1 - • Chỉnh tốc độ quay, thời gian ly tâm. Đối với máy ly tâm lạnh thì cần phải chỉnh thêm nhiệt độ về các thông số cần dùng. • Xoắn nắp thật chặt trước khi ly tâm. Máy được khở động trong tình trạng êm nhẹ, nếu máy rung mạnh là do thể tích trong ống không đều, cần điều chỉnh lại thể tích trong các ống. • Lau sạch ngay khi phát hiện có hoá chất và dung dòch vương vãi lên máy. 3. Nguyên tắc khi pha hoá chất. 3.1 Nguyên tắc chung • Hóa chất được pha chế trong tủ hút. • Đeo găng tay, khẩu trang khi pha chế các dung dòch chất độc tiềm năng như acrylamide (độc dược thần kinh), ethidibromua (chất gây ung thư) hoặc các cấht gây bỏng nặng như phenol, acid – base đđ…. • Dung dòch hóa chất nào nhiễm bẩn, cần thiết phải qua lọc bằng phin lọc với đường kính lỗ lọc từ 0,2 – 0,45 µm. • Thông thạo cách thức pha các hóa chất theo các nồng độ: • Nồng độ mole • Nồng độ % • Pha loãng dung dòch từ dung dòch mẹ . • Pha chế dung dòch từ các dd gốc:EDTA (Ethylenediamintetraacetic acid) 0.5M, TE (tris – EDTA), SDS (sodium dodecyl sulfate)… 3.2 Các bước pha chế dung dòch • Chuẩn bò lọ đựng sạch, dán nhãn rõ ràng. • Cân hóa chất đúng theo lượng cần dùng. Cho vào cốc thuỷ tinh với một ít nước cất 2 lần và thanh khuấy từ. Đợi đến khi chất rắn tan hoàn toàn hoặc các pha trộn lẫn đều vào nhau thành một pha duy nhất. • Bổ sung nước cất cho đến thể tích xác đònh cuối cùng. • Trường hợp cần agar hoặc agarose thì các chất đó được cân trực tiếp trong cốc dùng cuối cùng. • Chỉnh pH về điểm cần thiết (nếu có) • Khử trùng dung dòch (nếu có) • Kiểm tra độ trong, tạp chất và độ nhiễm lần cuối trứơc khi cho vào lọ vô trùng để bảo quản hay sử dụng. Các dung dòch đệm và dung dòch chế phẩm sinh học cần được bảo quản trong điều kiện lạnh và thời gian ngắn. 3.3 Cơ đặc dung dịch • Các dung dịch DNA và ARN được cơ đặc với ethanol như sau: • Đo thể tích dung dịch DNA và điều chỉnh theo nồng độ cation đơn giản trị. Nồng độ cuối cùng phải là 2 – 2,5 M đối với amoni acetate; 0,3 M đối với natri acetate; 0,2 M đối với natrichlorua và 0,8 M đối với lithichlorua. • Ion được sử dụng thường phụ thuộc vào thể tích DNA và các ử lý tiếp theo; như ta có thể dùng natri acetate ức chế phâ nđọan Klenow, ion amoni ức chế T4 polynucleotide kinase và ion chlorua ức chế DNA polymerase phụ thuộc Rnase. • Bổ sung MgCl2 vào với nồnf độ cuố icùng 10mM giúp tủa các phân đoạn DNA nhỏ và các oligonucleotide. Tiếp theo bổ sung các cation đơn hóa trị, 2 – - 2 - 2,5 thể tích ethanol được bổ sung, hòa trộn đều và bảo quản lạnh hơặc -20 o C trong 20 phút tới 1 giờ. • Ly tâm 10 phút để thu DNA trong máy ly tâm bàn ở nhiệt độ phòng. Gạn bỏ từ từ dịch nổi đi để sao cho tủa DNA khơng văng ra (thường khơng thể nhìn thấy tủa). • Để loại muối ra, rửa tủa với 0,5 – 1,0 ml 70% EtOH, ly tâm lại lần nữa, gạn bỏ dịch nổi và làm khơ tủa. amoni acetate rất dễ hòa tan trong ethanol và được loại bỏ rất dễ dàng khi rửa với 70% EtOH. Khó loại bỏ natri acetate và natri chlorua hơn. • Để làm khơ nhanh, ly tâm ngắ ntủa trong má ycơ chân khơng. Tuy nhiên khơng nên áp dụng phương pháp cho các dịch DNA bởi vì nếu DNA q khơ thì rất khó hòa lại và cũng có xu hướng biến tính các phân đoạn DNA nhỏ. • Isopropanol cũng được dùng để tủa DNA nhưng có xu hướng tủa cùng với muối và khó bay hơi hơn. Tuy ít khi dùng để tủa DNA hơn ethanol nhưng thỉnh thoảng isopropanol vẫn được dùng để giữ tối thiểu các thể tích, ví dụ tinh sạch plasmid với số lượng lớn. 3.4 Bảo quản chế phẩm sinh học • Các chế phẩm DNA hoặc RNA phải được bảo quản trong chế độ rất nghiêm ngặt. • Dung dòch ethanol có thể gây hỏng AND nếu có mặt ion kim loại nặng. • Da người có Nuclease nên không tiếp xúc trực tiếp với mẫu bằng da trần. Các Rnase thường rất bền ngay cả khi đã được rữa sạch và khử trùng chúng vẫn còn bám lại trên bề mặt của các chai lọ. • 5 o C là nhiệt độ cần thiết để bảo quản các sinh phẩm. • -20 o C có thể làm gẩy các DNA. • -70 o C là nhiệt độ dùng để bảo quản lâu dài các chế phẩm với điều kiện trong môi trừơng có nồng độ muối hơn 1M, có mặt của EDTA (hơn 10mM) ở pH = 8,5: hoặc bảo quản trong dòch nổi CsCl với EtBr trong tối ở 5 o C. - 3 - BÀI 2 TÁCH CHIẾT DNA TỪ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 1. Nguyên tắc: Việc thu nhận DNA từ tế bào gan động vật được tiến hành theo 2 bước: • Bước 1: Cô lập nhân chứa DNA. Người ta thường chọn tế bào mô gan làm vật liệu thu nhận DNA vì tế bào gan tương đối đồng nhất về kích thước, thích hợp cho việc phân đoạn bằng kỹ thuật ly tâm. Tế bào được phá vỡ bằng phương pháp hoá học, cơ học hay sóng siêu âm…, trong điều kiện có dung dòch sinh lý thích hợp và nhân (chứa DNA) đựơc thu nhận dựa vào sự khác nhau về khối lượng của chúng. • Bước 2: Tách chiết DNA Tiến hành loại bỏ các tạp chất dựa trên tính hoà tan khác nhau của chúng đối với các dung môi hữu cơ. Các tác nhân thường dùng như: Phenol: chất làm biến tính mạnh protein và không hòa tan acid nucleic. Chloroform: đi kèm với phenol, cũng có tác dụng biến tính protein dù yếu hơn phenol và đồng thời loại bỏ hoàn toàn vết phenol. Isoamyalcohol: Làm giảm bọt, ổn đònh hai pha nước và chloroform sau ly tâm. Isobutanol: có tác dụng tách các phân tử hữu cơ như ethidium bromide và làm đậm đặc dung dòch nucleic acid. Để thu được tủa DNA tinh sạch từ dòch chiết trên, có thể tiến hành tủa bằng các dung môi hữu cơ dễ bay hơi (ethanol ở nồng độ muối cao trong nhiệt độ lạnh hoặc isopropanol không cần muối) kết hợp với ly tâm. Tủa DNA được hoà tan trong dung dòch TE và bảo quản ở điều kiện nhiệt độ thấp. 2. Nguyên liệu – hóa chất. • Gan bò • Dung dòch hỗn hợp 1: saccharose 0,2M + CaCl 2 0,001M, KCl 0,1M) Giữ lạnh. • Dung dịch hỗn hợp 2: saccharose 0,4M + CaCl 2 0,001M, KCl 0,1M) Giữ lạnh. • Dung dịch EDTA 0,1 M – NaCl 0,15M pH8. • Triton X – 100 • Dung dỊch SDS 10%. • Chloroform : isomylalhohol (24:1) • Dung dịch TE (Tris 0,1M - EDTA 0,001M) • Ethanol tuyệt đối . 3. Dụng cụ - thiết bị - 4 - • Micropipette 200µl, 1000µl và các tip tương ứng. • Eppendorf 1,5 ml, 2ml. • Que thủy tinh uốn cong, ống nghiệm thủy tinh. • Cốc đựng đá, cốc đựng tip và dung dịch thải. • Vải lược và dao cắt. • Máy nghiền và máy ly tâm. 4. Phương pháp tiến hành. • Bước 1: cô lập nhân . Thu nhận dịch đồng nhất Cắt 30 g thành từng miếng nhỏ, hco vào bình chứa giữa trong đá. Phá màng tế bào bằng phương pháp cơ học nghiền các miếng gan bằng máy xay trong 70 ml dung dịch S1 lạnh trong 2 phút. Trong lúc nghiền, bình chứa vẫn được giữ lạn htrong đá. Sau đó, dịch nghiền được lọc qua vải lọc, phần dịch đồng nhất được thu nhận lại trong bình chứa sạch, cũng được giữ trong đá. - Thu nhận phân đọan nhân Tiến hành ly tâm 1 nhằm loại bỏ trong phần dịch nổi những bào quan nhỏ và nhẹ như ti thể, không bào… Trong lần ly tâm 2, còn gọi là ly tâm trên đệm saccharose, chỉ có nhân - bào quan có tỉ trọng cao nhất là có thể di chuyển xuyên qua lớp đệm saccharose đậm đặc để lắng xuống đáy ống ly tâm trong thời gian và lực ly tâm đã tính toán. Các chất tẩy (detergent) sử dụng gồm hai loại: Chất tẩy nhẹ (triton X 100) và chất tẩy mạnh (SDS). Trước tiên, chất tẩy nhẹ phá vỡ màng hồng cầu; nêu không có công đọan này thì hồng cầu sẽ cùng lắng với nhân trong lần ly t6am 2. sau khi đã thu nhận phân đọan nhân mới dùng chất tẩy mạnh để phá màng nhân. - Quy trình Mỗi nhóm nhận 1 ml dung dịch đồng nhất trong ống eppendorf 2 ml(có ghi tên tiểu nhóm). Thêm 1 ml dung dịch S1, trộn đều bằng cách đảo ống. Ly tâm 2000 vòng / phút trong 5 phút. Hút dịch nổi bằng pipette pasteur. Huyền phù hóa phẩn cặn trong 0,9 ml dung dịch S1 + triton X 100 1% bằng cách dùng pipette pasteur hút và nhả trong khỏang 2 phút. Cho 0,9 ml dd S2 vào một ống eppendorf 2 ml sạch. Dùng pipette pasteur hút lớp cặn đã huyền phù nằm cho chảy chậm dọc theo thành ống ống eppendorl sao cho lớp cặn huyền phù nằm trên lớp S2 tạo thành hai pha không hòa lẫn nhau. Ly tâm 2000v/p trong 5 phút. Hút bỏ dịch nổi. Thu nhận phần cặn chứa phần lớn là nhân, đây là phân đọan nhân tương đối thuần khiết. • Bước 2: tách chiết DNA Huyền phù hóa phân đọan nhân trong ,9 ml dung dịch EDTA – NaCl. Thêm vào 45µl dung dịch SDS 10% để đạt nồng độ SDS cuối cùng là 0,5%. Vortex 2 phút. Dung dịch trở nên nhớt do DNA được giải phóng ra môi trường. Thêm 0,9ml chloroform: isoamylalcohol. Vortex 5 phút cho đến khi được dịch huyền phù trắng. Ly tâm 10.000v/ p trong 5 phút. Thu nhận phần dịch nổi, chuyển qua một ống nghiệm sạch. - 5 - Thêm khỏang 1,8 ml ethanol tuỵêt đối lạnh. Khi thấy các sợi DNA trắng đụt xuất hiện ở mặt phân cắt nước – ethanol thì dùng que thủy tinh đầu cong quấn lại, rút ra khỏi dung dịch và để khô tự nhiên. Nhúng đầu que có DNA vào một ống eppendorf 1,5ml có chứa 50µl dung dịch TE và xoay đều trong khỏang 5 – 10 phút để hòa tan DNA. Giữ mẫu DNA trong tủ lạnh. - 6 - Bài 3: Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của ADN bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ 1. Nguyên tắc 1.1 Đo hàm lượng ADN Tùy vào cấu trúc của mỗi chất mà chúng có một đỉnh hấp thụ nhất định. Đối với nucleic acid, do sự tương tác giữa các proton và các electron của vòng purine và pyrimine mà nó có khả năng hấp thụ lớn nhất ở bước sóng 260nm trong vùng tử ngoại và hấp thụ cực tiểu ở bước sóng từ 230nm-240nm và không hấp thụ ở vùng có bước sóng lớn hơn 310nm. Dựa vào tính chất này mà người ta có thể xác định được hàm lượng các nucleic acid bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm. Độ hấp thụ này còn phụ thuộc vào các nhân tố như là: pH, nhiệt độ, cường độ ion. độ hấp thụ tăng lên khi ở trong môi trường acid hoặc kiềm. Trong thí nghiệm này pha loãng ADN trong dung môi là nước và ở nhiệt độ phòng. Công thức tính hàm lượng và độ tinh sạch của ADN. Hàm lượng ADN (ng/µl) =50×HSPL×OD 260 (1) Công thức (1) được áp dụng tính hàm lượng của ADN sợi đôi. Đối với ADN biến tính sợi đơn hay ARN, oligonucleotid thì độ hấp thụ ở bước sóng 260nm tăng lên và được tính bởi công thức sau: Hàm Lượng ARN hay ADN sợi đơn (ng/µl) = 40× HSPL×OD 260 (2) Hàm lượng oligonucleotid (ng/µl) = 20× HSPL×OD 260 (3) Trong đó HSPL : hệ số pha loãng OD 260 : chỉ số đo được ở bước sóng 260nm OD 280 : chỉ số đo được ở bước sóng 260nm 1.2 Đo độ tinh sạch của ADN Trong mẫu ADN thường có lẫn phenol và protein. Những tạp chất này làm tăng độ hấp thụ ở bước sóng 280nm vùng tử ngoại. Vì vậy độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid được đánh giá bằng tỉ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng ở hai bước sóng 260nm và 280nm.Được tính bằng công thức sau: Độ sạch nucleic acid = OD260/OD280 (4) Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 đến 2 thì dung dịch ADN được xem là tinh sạch. Tỉ lệ này thấp hơn 1,8 chứng tỏ mẫu có lẫn tạp chất. Đối với dung dịch ADN sợi đôi, nếu tỉ lệ quá lớn thì chứng tỏ ADN có chứa trong mẫu bị biến tính hay bị phân hủy. 1.3 Hiệu ứng siêu sắc (hyporchromic effect) Hiệu ứng siêu sắc là độ hấp thụ ở bước sóng của ADN tăng lên khi ADN biến tính tức là hai sợi đơn tách rời khỏi nhau. ADN không bền đối với nhiệt. Khi tăng nhiệt độ của ADN lên quá nhiệt độ Tm (Điểm nóng chảy) thì mạch đôi sẽ tách ra do sự phá vỡ của các liên kết Hidro. Nểu để nhiệt độ giảm từ từ thì hai sợi đơn lại bắt cặp với nhau nhưng chúng không có khả năng bắt cặp lại khi làm lạnh đột ngột sau khi biến tính. 2. Dụng cụ và hóa chất Mẫu ADN: mẫu được tách ra từ lá mía ở bài trước Nước cất tuyệt trùng Đá lạnh - 7 - Eppendorf 1.5ml Micropipette 20, 200, 1000µl Máy soi màu Máy lắc Vortex Bếp 3. Các bước thí nghiệm Biến tính ADN - Hút 5µl ADN mẫu cho vào 2 eppendorf loại 1.5ml. Chú ý trước khi hút mẫu cần phải vortex để trộn đều mẫu. 1 Đun cách thủy mẫu ADN trong vòng 10 phút . 2 Làm lạnh đột ngột một ống bằng cách đặt trên đá đang tan trong 10 phút. Ống còn lại thì làm nguội ở nhiệt độ phòng. Chuẩn bị mẫu - Pha loãng 100 lần mẫu ADN bằng nước cất tuyệt trùng (5µl ADN + 495µl nước cất tuyệt trùng). - Pipetting hoặc Vortex chộn đều dung dịch pha Đo độ hấp thụ trên máy soi màu 1 Rửa sạch cuvet thạch anh rồi tráng bằng nước cất để khô ráo. 2 Nước cất tuyệt trùng (nước dùng pha loãng ADN) để làm chuẩn chuẩn chỉnh cân bằng máy. 3 Lắc đều dung dịch mẫu đo trước khi tiến hành đo mẫu. 4 Đo ở bước sóng 260nm và 280nm. Kết quả Kết quả đo OD260 và OD280 của các mẫu ADN Bước sóng ADN không biến tính ADN biến tính ADN phục hồi sau biến tính 260nm 280nm - 8 - Bài 4 TÁCH CHIẾT TÒAN PHẦN RNA CỦA VI KHUẨN 1. Nguyên tắc: Việc tách chiết RND cũng bao gồm các bước cơ bản như đối với DNA. Nhưng do RNA dễ bị thủy giải bới Rnase, khó đảm bảo nguyên vẹn trong quá trình tách chiết nên trong thao tác cầ ntuân thủ một số nguyên tắc chung. Sử dụng các chất có khả năng biến tính mạnh protein như guanidium thiocyanate để ức chế Rnase. Sử dụng nước đã qua xử lý với DEPC (Diethypyrocarbonate) để loại RNase. Sử dụng phenol pH = 4 để ức chế Rnase, loại protein và DNA. Thao tác trong điều kiện nghiêm ngặt tối đa: lạnh, mang găng tay, thao tác trong tủ cây vô trùng. Chất lượng của RNA tòan phẩn tách chiết sẽ được đánh giá sơ bộ qua điện di trên gel agarose. 2. Vật liệu hóa chất • Vi khuẩn Escherichia coli • Trizol (phenol pH4, guanidium thiocyanate, glycerol, sodium acetate) • Chloroform : isoamylacohol • Isopropanol • Ethanol 70% • Nước đã xử lý với DEPC 3. Dụng cụ - thiết bị • Pipetman 1000µl, 200µl, 10µl và các tip tương ứng • Eppendorf 1,5µl • Máy ly tâm • Máy vortex 4. Quy trình: • Mỗi nhóm được nhận 1 ống eppendorf 1,5ml chứa 100µl dung dịch vi khuẩn E.coli. • Thêm vào 900µl dung dịch trizol + 200µl chloroform:isoamyalcohol, vortex kỹ trong 5 phút. • Ly tâm 13.000v/p trong 10 phút. • Thu dịch nổi có chứa RNA vào một ống eppendorf 1,5ml khác. • Thêm một thêm tích isopropanol lạnh và để ở -20 0 C trong 1 giờ. • Ly tâm với tốc độ 13.000v/p trong 10 phút. Lọai bỏ dịch nổi (hút từ từ phần nước bên trên trách hút nhầm cặn RNA ở phía dưới). • Thêm vào 1 ml ethanol 70%. • Ly tâm ở tốc độ 13.000v/p trong 5 phút, lọai bỏ dịch nổi (thao tác giống ơ trên). • Hòa cặn RNA trong 10µl H 2 O (đã qua xử lý DEPC), giữ ở nhiệt độ -20 o C. - 9 - Bài 5 KỸ THUẬT ĐIỆN DI 1. Nguyên tắc Người ta dùng kỹ thuật điện di để tách các phần tử ra khỏi hỗn hợp nào đó dựa trên cơ sở: trong một điện trường, các phân tử nằm trong pha lỏng sẽ di chuyển với vận tốc tùy thuộc tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng của chúng. Nếu hai phân tử có cùng khối lượng, phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngược dấu nhanh hơn. Thông thường người ta dùng hai loại gel là gel agarose và gel polyacrylamid. Gel agarose cho phép phân tách các phân tử ADN sợi đôi có kích thước từ 100 đến 10.000 cặp Nu. Còn gel polyacrylamid cho phép phân tách các phân tử ADN sợi đơn có kích thước nhỏ dưới 500 nucleotid và còn có thể tách riêng từng phân tử ADN có kích thước khác nhau một nucleotid. Tùy theo kích thước đối tượng ADN muốn tách mà ta có thể pha gel với các nồng độ khác nhau. Nồng độ Agarose Kích thước phân tử ADN cần phân li (bp) 0.6% 1000 - 20000 0.7% 800 - 10000 1% 500 - 7000 1,2% 400 - 6000 1,5% 200 - 3000 2,0% 100 - 2000 Gel polyacrylamide cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đọan DNA sợi đơn có kích thước dưới 500 bp, hiệu quả phân tách có thể đạt 1 Nu. Sau khi phân tích điện di xong, tiến hành nhuộm ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát hùynh quang dưới tia tử ngọai. Điều này cho phép phát hiện vị trí các đọan DNA trên gel với việc sử dụng thang mẫu DNA chuẩn(DNA LADDER). Các thang mẫu thường sử dụng như λ - Hind III hay φX 174-Hae III. Vật liệu – hóa chất • DNA bộ gan động vật • DNA plasmid pGEM3 • Thang DNA chuẩn λ-hind III • Agarose • Dung dịch điện di TAE 1X (pha lõang từ TAE 50X) Đệm điện di TAE 1× - Tris base 0,4M 44,8g - Acetic acid 0,2M 11,4g - EDTA 0,01M 20,0ml Định mức đến 1000ml • Dung dịch nạp mẫu 6X: - Glycerol 30% - Brommophenol Blue 0,25% - Tris 200mM - Na 2 EDTA 20mM • Ethidium bromide (10mg/ml) 2. Dụng cụ - thiết bị • Bộ nguồn và buồng điện di ngang: Thiết bị gồm có các bộ phận chính sau: - Nắp: là phần trên của thiết bị có thể tháo rời. - 10 - [...]... mang mầm mống bệnh hay các chủng vi sinh vật có trong môi trường Đem nhân dòng bằng phương pháp PCR một gen đặc hiệu của một chủng vi sinh vật nào đó, nếu đoạn gen đó được nhân lên thì chứng tỏ chủng vi sinh vật đó có chứa trong mẫu cần kiểm tra Ở đây chúng ta sử dụng đầu mồi của gen rnhA có trong chủng E Coli để kiểm tra sự hiện diện của chủng E.coli trong mẫu cần phân tích Một thí nghiệm để phát hiện... Một thí nghiệm để phát hiện khuẩn mang mầm mống bệnh gồm các bước sau: - Tăng sinh: Tăng số lượng vi khuẩn có trong mẫu trước khi đem tiến hành nhân dòng bằng cách nuôi cấy vi sinh vật trong dịch nuôi - Xử lí mẫu: Thu vi sinh vật sau khi nuôi cấy và phá bỏ màng tế bào để thu ADN - Phản ứng PCR: nhân dòng bằng phương pháp PCR - Phân tích sản phẩm sau khi nhân dòng bằng phương pháp điện di ADN 1.1 Nguyên... ta thường điện di với thang ADN chuẩn hay λHinIII digest còn gọi là maker để dựa vào đó mà ta có thể xác định được mẫu bp ADN đem đi điện di Trong bài thí nghiệm này chúng ta sử dụng λ23130 HinIII, các phân tử ADN của phase λ sau khi được cắt bởi enzyme cắt hạn chế HinIII Kích thước của các phần tử có trong thang được 9416 biểu diễn ở hình bên • Pipetteman 10µl 6557 • Eppendorf 1,5 ml; 2,0 ml • Bàn đèn . thông dung trong SHPT 2.1 Micropipette(pipet man) • Kiểm tra tình trạng hoạt động của pipetman • Chỉnh về thể tích cần sử dụng. Thao tác xoắn vặn nútnê nnhẹ nhàng, trách vặn quá nhanh hoặc vặn. Bài 1: MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SHPT Ngoài một số dụng cụ thường dùng cho tác thao tác vi sinh và hóa sinh, trong kỹ thuật sinh. ràng. • Cân hóa chất đúng theo lượng cần dùng. Cho vào cốc thuỷ tinh với một ít nước cất 2 lần và thanh khuấy từ. Đợi đến khi chất rắn tan hoàn toàn hoặc các pha trộn lẫn đều vào nhau thành một