trờng đạI học nông nghiệp hà nội Khoa Công nghệ sinh häc -*** - Khoá luận tốt nghiệp đề tµi: “Lai chuyển gen chọn lọc gen kháng bệnh bạc hữu hiệu xa-5, Xa-7, Xa-21 vào số giống lúa tốt thị phân tử DNA” Ngêi hớng dẫn : pgs.ts phan hữu tôn KS Tống văn hải Bộ môn: Công nghệ sinh học ứng dụng Khoa Công nghệ sinh học - Trờng ĐHNN Ngời thùc hiƯn : NGUN THÞ HI£N Líp : CNSH – K3 hồng đức hà nội - 2009 Lời cảm ơn! Trong trình học tập thực đề tài tốt nghiệp, nỗ lực cố gắng thân, đà nhận đợc giúp đỡ quý báu nhiều thầy cô, gia đình bạn bè Trớc tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phan Hữu Tôn, thầy đà trực tiêp hớng dẫn, nhiệt tình bảo truyền đạt cho phơng pháp, học quý báu công việc nh sống Tôi xin chân thành cảm ơn K.S Tống Văn Hải, ngời đà trực tiếp hớng dẫn, dìu dắt thời gian thực tập trờng Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo cung cấp cho kiến thức bổ ích trình thực tập Cuối xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ngời thân gia đình bạn bè đà giúp đỡ, động viên suốt trình học tập thực đề tài Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2009 Sinh viên Nguyễn Thị Hiên i MC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 2.1 Tổng quan bệnh bạc lúa 2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh bạc lúa 2.1.2 Nguyên nhân, triệu chứng tác hại bệnh bạc 2.1.3 Quy luật phát sinh, phát triển yếu tố ảnh hưởng tới phát sinh phát triển bệnh bạc .9 2.2 Cơ sở khoa học chọn giống kháng bệnh bạc phương pháp thị phân tử DNA 12 2.2.1 Cơ sở sinh hoá sinh thái 12 2.2.2 Cơ sở phân tử 13 2.2.3 Di truyền tính kháng bệnh bạc .15 2.4 Ứng dụng thị phân tử DNA chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc 16 2.4.1 Giới thiệu thị phân tử DNA 16 2.4.2 Chỉ thị phân tử liên quan số gen kháng bệnh bạc lúa 19 2.4.3 Kỹ thuật PCR chọn tạo giống lúa kháng bệnh 20 2.5 Các phương pháp chuyển gen kháng bệnh bạc 23 2.5.1 Phương pháp chuyển gen súng bắn gen 24 2.5.2 Phương pháp lai hữu tính kết hợp với việc sử dụng thị phân tử .24 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Vật liệu, địa điểm, thời gian nghiên cứu 26 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 26 3.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 26 3.2 Nội dung nghiên cứu 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu .27 3.3.1 Thí nghiệm ngồi đồng ruộng khảo sát tập đồn 27 3.3.2 Thí nghiệm phịng 31 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Đặc điểm nông sinh học giống 36 ii 4.1.1 Thời gian qua giai đoạn sinh trưởng 36 4.1.2 Một số đặc điểm nông sinh học giống bố, mẹ sử dụng để lai Backcross 40 4.1.3 Năng suất yếu tố cấu thành suất 41 4.2 Phản ứng giống bố, mẹ tổ hợp lai F1 với chủng vi khuẩn gây bệnh bạc .44 4.3 Kết tiến hành phản ứng PCR .47 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 5.1 Kết luận 52 5.2 Đề nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Kí hiệu tổ hợp lai F1 dùng làm mẹ để lai lại với giống cần chuyển gen 26 Bảng 2: Thời gian qua giai đoạn sinh trưởng giống bố, mẹ sử dụng lai Backross 37 Bảng 3: Một số đặc điểm nông sinh học giống sử dụng làm bố, mẹ để lai Backcross 40 Bảng 4: Năng suất yếu tố cấu thành suất .41 Bảng 5: Phản ứng giống bố, mẹ tổ hợp lai F1 với chủng vi khuẩn số 10 .44 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Hình ảnh lây nhiễm nhân tạo chủng 10 gen Xa-7 tổ hợp lai F1 (T23xIRBB7) 46 Hình 2: Hình ảnh lây nhiễm nhân tạo chủng 10 gen Xa-21 tổ hợp lai F1 (IR64xIRBB21) 46 Hình 3: Ảnh điện di sản phẩm gen xa-5 sau tiến hành phản ứng PCR tổ hợp lai (N91xIRBB5) 48 Hình 4: Ảnh điện di sản phẩm gen xa-5 sau ủ Enzyme DraI tổ hợp lai (N91xIRBB5) 49 Hình 5: Ảnh điện di sản phẩm Xa-7 sau tiến hành phản ứng PCR tổ hợp lai (T23xIRBB7) 50 Hình 6: Ảnh điện di sản phẩm gen Xa-21 sau tiến hành phản ứng PCR tổ hợp lai (IR64xIRBB21) 51 iv PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Bệnh bạc lúa vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzae gây bệnh hại nguy hiểm cho ngành sản xuất lúa nhiều quốc gia giới, đặc biệt vùng nhiệt đới có trình độ thâm canh cao Trong năm gần đây, miền Bắc Việt Nam bệnh trở nên nghiêm trọng gây hại hai vụ Tác hại chủ yếu bệnh làm cho đặc biệt địng xơ xác, sớm tàn nhanh chóng khơ chết ảnh hưởng tới cường độ quang hợp, tỷ lệ hạt lép cao, gạo nát, dẫn tới suất, phẩm chất lúa gạo giảm Theo thống kê Mew (1989), hàng năm suất lúa giới giảm từ 10-20% bệnh vi khuẩn, có tới 50% bệnh bạc gây Đối với bệnh bạc lá, chưa có loại thuốc hóa học đặc trị bệnh này, mặt khác sử dụng nhiều thuốc hóa học cịn gây nhiễm mơi trường, cân sinh thái Biện pháp phòng trừ chủ yếu biện pháp canh tác biện pháp khơng có khả dập tắt dịch nhanh chóng Do vậy, việc tạo giống lúa có khả kháng bệnh bền vững xem hiệu Giống lúa có khả kháng bệnh bền vững giống có nhiều gen kháng khác Do gen kháng kháng hay số chủng vi khuẩn định, vùng trồng lúa lại tồn nhiều chủng vi khuẩn khác nên giống chứa gen kháng sau thời gian ngắn bị nhiễm bệnh Vì cần phải quy tụ nhiều gen kháng vào giống để giống có khả kháng nhiều chủng vi khuẩn khác Người ta phát 29 gen kháng bệnh ký hiệu từ Xa-1 đến Xa29 (K.S Lee CS, 2003) gồm 22 gen trội gen lặn Theo kết nghiên cứu Phan Hữu Tơn gen Xa-4, xa-5, Xa-7, Xa-21 kháng hầu hết chủng vi khuẩn miền Bắc Việt Nam Để đưa gen kháng bệnh bạc hữu hiệu vào giống, theo phương pháp truyền thống người ta lai Backcross, sau chọn có gen kháng lai lại với giống bố tốt Bằng lây nhiễm nhân tạo người ta phát có mặt gen kháng Tuy nhiên, phương pháp tốn nhiều thời gian công sức, chí khơng xác tác động môi trường Ngày nay, với phát triển công nghệ sinh học đặc biệt sinh học phân tử nhà chọn giống kết hợp lai hữu tính với sử dụng thị phân tử DNA để chọn lọc gen kháng Áp dụng thị phân tử DNA phát diện gen kháng thơng qua đoạn DNA dị đặc hiệu liên kết với gen với khoảng cách liên kết định Hiện nay, xác định vị trí số gen kháng quan trọng như: gen Xa-4 liên kết với REPL Locus Npb181 Npb76 NST số 11, với khoảng cách di truyền 1.7cM (Yoshida et al, 1992) Gen xa-5 liên kết với thị phân tử RZ390, RG556, RG207 NST số 5, với khoảng cách di truyền 01cM (Mc Couch et al, 1991) Gen Xa-7 liên kết với thị P3 NST số 6, với khoảng cách di truyền 2.5cM (Taura et al, 2003) Gen Xa-21 liên kết với thị pTA248 với khoảng cách di truyền 0-1cM (Ronal et al, 1992) Việc xác định xác gen kháng, nhiễm sắc thể chứa gen kháng vị trí xếp gen nhiễm sắc thể phục vụ đắc lực công tác chọn tạo giống kháng bệnh việc quy tụ nhiều gen kháng hữu hiệu vào giống trở nên dễ dàng Với mục đích quy tụ nhiều gen kháng hữu hiệu vào giống lúa tốt, thời gian qua nhóm nghiên cứu lúa mơn CNSH ứng dụng - Khoa CNSH - Trường ĐHNN Hà Nội tiến hành lai số tổ hợp Nhằm chọn lọc giống tốt có chứa gen kháng hữu hiệu làm vật liệu cho vụ sau, tiến hành đề tài: “Lai chuyển gen chọn lọc gen kháng bệnh bạc hữu hiệu xa-5, Xa-7, Xa-21 vào số giống lúa tốt thị phân tử DNA” 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích Chuyển thành công gen kháng bệnh bạc hữu hiệu xa-5, Xa-7, Xa-21 vào giống lúa có đặc điểm nông sinh học tốt phương pháp lai Backcross kết hợp với chọn lọc phân tử Sử dụng thị phân tử DNA chọn lọc dạng đồng hợp tử gen kháng quần thể phân ly F2 1.2.2 Yêu cầu - Theo dõi đánh giá số đặc điểm nông sinh học quan trọng bố, mẹ sử dụng để lai Backcross - Lai Backcross để chuyển gen kháng bệnh bạc hữu hệu xa-5, Xa-7, Xa-21 vào dòng lúa chọn lọc thu hạt tự thụ từ tổ hợp lai F1 để trì gen kháng - Lây nhiễm nhân tạo để đánh giá kháng-nhiễm giống bố, mẹ tổ hợp lai - Tiến hành phản ứng PCR để chọn lọc gen kháng bệnh bạc hữu hiệu xa-5, Xa-7, Xa-21 PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan bệnh bạc lúa 2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh bạc lúa 2.1.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh bạc lúa giới Bệnh bạc lúa vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzae gây bệnh hại nghiêm trọng vùng thâm canh lúa giới, đặc biệt nước Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Việt Nam…Vì vậy, việc nghiên cứu nguyên nhân, biện pháp phòng trừ bệnh nhà khoa học đặc biệt quan tâm Bệnh bạc lúa phát lần cánh đồng lúa Fukuora (Nhật Bản) vào năm 1884-1885 Ban đầu, nhà khoa học Nhật Bản nhầm tưởng bệnh sinh lý đất chua gây Năm 1908, Takaishi tìm thấy vi khuẩn giọt dịch lây lại Dựa kết phân lập năm 1991, Bokura kết luận triệu chứng bệnh bạc vi khuẩn gây nên sinh lý[2] Từ năm 1950-1970, bệnh bạc lúa phát triển mạnh Nhật Bản trừ miền Bắc đảo Hokaido (Tagami Miukami, 1960; Srivartawa, 1972)[5] Ở Ấn Độ, bệnh bạc lúa phát năm 1940 (Raina CS, 1981), với tên địa phương Dansukh (có nghĩa trắng hay khơ lá)[5] Đến năm 1965, người ta xác định nguyên nhân gây bệnh vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzae gây Ở Philippine, Raiking miêu tả triệu chứng bệnh bạc vi khuẩn gây nên lại nhầm với bệnh đốm sọc vi khuẩn Xanthomonas oryzicola Mãi đến năm 1957, hai bệnh phân biệt rõ rệt Bệnh bạc lúa phát Indonexia vào năm 1950 nghiên cứu triệu chứng héo Reisma Schure gọi tên bệnh bạc Krese xác định vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzae gây Năm 1957, nhà khoa học Trung Quốc phát thấy bệnh bạc cánh đồng lúa phía Tây Nam (Wu, 1980, 1989) Năm 1976, bệnh thông báo Pakistan Theo Yoshi CS tổng kết năm 1983-1984, hầu Châu Á (trừ Tây Á) xuất bệnh bạc Năm 1973, bệnh xuất miền Bắc Châu Úc (Khush, 1976)[25] Tại Châu Mỹ La Tinh số khu thí nghiệm lúa thuộc Colombia, Panama, Mexico phát bệnh bạc lúa vào năm 1957 (Buddenhagen CS, 1979) Năm 1979 người ta quan sát thấy bệnh bạc lúa số trại thí nghiệm thuộc Châu Phi (Buddenhagen CS, 1979-1982) Năm 1980, bệnh xuất giống lúa lùn Châu Á, sau người ta quan sát thấy bệnh xuất lúa dại Oryzae bathii, Oryzae longistaminata (Buddenhagen CS,1982) 2.1.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh bạc lúa Việt Nam Ở Việt Nam, bệnh bạc phát vào năm 1954 giống lúa mùa cũ không gây thiệt hại nghiêm trọng Trong năm gần đây, phong trào thâm canh phát triển với việc sử dụng nhiều phân bón đặc biệt đạm vơ giống lúa chống chịu bệnh trồng diện tích rộng làm cho bệnh bạc lan rộng phá hoại nặng vụ xuân lẫn vụ mùa[8] Gần đây, bệnh tiếp tục gây hại diện tích lớn giống lúa nhập nội từ Trung Quốc chưa qua khâu kiểm dịch[9] Theo thống kê báo cáo số kết nghiên cứu lúa lai có năm có tới 350000ha bị bệnh nặng hai vụ, hàng trăm bị trắng Đan Phượng, Phú Xuyên, Bắc Ninh…[14] Năm 1968-1975 bệnh gây dịch lớn đồng sông Hồng Ở Việt Nam, có nhiều cơng trình nghiên cứu bệnh bạc như: Nguyễn Bá Trinh (1973), Nguyễn Thừa Thụy (1980), Lê Lương Tề (1980, 1985, 1987), Tạ Minh Sơn (1987)…Hầu hết cơng trình tập trung nhiều, cịn số gié cấp II nhiều làm tăng rõ rệt số hoa Những giống có cuống bơng lớn, số mạch dẫn cuống nhiều làm tăng khả vận chuyển chất dinh dưỡng nên số gié cấp I nhiều Hoa sau phân hóa xong gặp điều kiện thuận lợi phát triển thành bơng hữu hiệu, nở hoa, thụ phấn hình thành hạt bình thường Ngược lại, gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi, hoa khơng tiếp tục phát triển bị thối hóa Ngun nhân thối hóa gié hoa thiếu dinh dưỡng thời kỳ làm đòng, điều kiên ngoại cảnh bất thuận trời rét, âm u, thiếu ánh sáng, ngập úng, nhiệt độ cao, sâu bệnh phá hoại Vì vậy, cấy thời vụ, bón thúc địng có tác dụng nâng cao số hoa hữu hiệu bơng, hạn chế q trình thối hóa hoa Qua bảng chúng tơi thấy: số hạt bơng giống bố, mẹ dao động từ 165.6 hạt (IRBB5) đến 221.2 hạt (T23) Số hạt yếu tố quan trọng có ảnh hưởng trực tiếp đến suất giống Tỷ lệ hạt làm trọng lượng tăng suất hạt tăng Qua bảng thấy, số hạt chắc/bông bố mẹ dao động từ 140.0 hạt (IRBB5) đến 189.6 hạt (T23) Tỷ lệ hạt chắc/bông bố, mẹ dao động từ 81.1% (IRBB21) đến 95.5% (N46) Khối lượng 1000 hạt yếu tố cuối tạo nên suất lúa So với yếu tố khác yếu tố biến động, chủ yếu phụ thuộc vào giống Khối lượng 1000 hạt hai phận cấu thành khối lượng vỏ trấu (20%) khối lượng hạt gạo (80%) Qua bảng thấy, khối lượng 1000 hạt giống bố, mẹ dao động từ 18.4 gam (T23) đến 24.4 gam (IRBB21) Như vậy, giống IRBB21 thuộc nhóm hạt trung (24-26 gam), giống cịn lại thuộc nhóm hạt nhỏ ( 12cm: nhiễm nặng (Susseptible) Cách đo vết bệnh: sau lây nhiễm 20 ngày tiến hành đo chiều dài vết bệnh điển hình/khóm/chủng Sau lây nhiễm phản ứng chủng vi khuẩn bạc thể qua chiều dài vết bệnh Tiến hành đo chiều dài vết bệnh, xác định khả kháng-nhiễm bố, mẹ tổ hợp lai F1 Kết thể bảng Bảng 5: Phản ứng giống bố, mẹ tổ hợp lai F1 với chủng vi khuẩn số 10 Cây Giống bố, 44 10 Tính kháng mẹ F1 N91 M M S M S N46 S M M S M S S Bắc Thơm S S S M S T23 S M S S M M S M S IR64 M M S S M S S S M M 5M/5S N19 M M S M M S S M M M 7M/3S IRBB5 R R R R R R R R R R 10R IRBB7 R R R R R R R R R R 10R IRBB21 R R R R R R R R R R 10R N91xIRBB5 M M S M M S S M S M 6M/4S N46xIRBB5 S S M S M M M S S M 5M/5S Bắc ThơmxIRBB7 R R R R R R R M R R 9R/1M T23xIRBB7 R R R R R R R R R R 10R IR64xIRBB21 R R R R R R R R R R 10R N19xIRBB21 R R R R R R R R R R 10R M S S S M S M M M S M M S S 6M/4S 5M/5S 3M/7S 4M/6S Qua bảng thấy: Các mẹ N19, N46, Bắc Thơm nhiễm vừa đến nhiễm nặng với chủng vi khuẩn số 10 Các bố IRBB5, IRBB7, IRBB21 kháng hoàn toàn với chủng vi khuẩn số 10 Ở hệ F1, mang gen kháng tồn dạng dị hợp tử (Rr) Vì vậy, mang gen kháng xa-5 trạng thái không biểu tính kháng gen xa-5 gen lặn Các F1 mang gen kháng Xa-7 Xa-21 có phản ứng nhiễm vừa đến kháng với chủng vi khuẩn số 10 * Chiều dài vết bệnh bạc số tổ hợp lai F1 nghiên cứu 45 Hình 1: Hình ảnh lây nhiễm nhân tạo chủng 10 gen Xa-7 tổ hợp lai F1 (T23xIRBB7) Hình 2: Hình ảnh lây nhiễm nhân tạo chủng 10 gen Xa-21 tổ hợp lai F1 (IR64xIRBB21) 46 4.3 Kết tiến hành phản ứng PCR Để thu dạng đồng hợp tử gen kháng bệnh bạc hữu hiệu xa-5, Xa7, Xa-21, sau thu hạt tự thụ tổ hợp lai F1 tiến hành gieo hạt, chiết tách DNA chạy PCR Trong nghiên cứu chúng tơi tiến hành phân tích chọn lọc quần thể phân ly F2 tổ hợp: N91xIRBB5; N46xIRBB5; Bắc ThơmxIRBB7; T23xIRBB7; IR64xIRBB21; N19xIRBB21 Đối với quần thể chiết tách DNA 40 cá thể, sau tiến hành phản ứng PCR cho gen kháng sử dụng cặp mồi chu trình nhiệt nêu Điện di sản phẩm PCR thu kết sau: - Từ quần thể phân ly F2 tổ hợp lai (N91xIRBB5) thu được: 29 có kiểu gen RR, có kiểu gen Rr, có kiểu gen rr - Từ quần thể phân ly F2 tổ hợp lai (N46xIRBB5) thu 27 có kiểu gen RR, 10 có kiểu gen Rr, có kiểu có kiểu gen rr - Từ quần thể phân ly F2 tổ hợp lai (Bắc ThơmxIRBB7) thu được: 13 có kiểu gen RR, có kiểu Rr, 21 có kiểu gen rr - Từ quần thể phân ly F2 tổ hợp lai (T23xIRBB7) thu được: có kiểu gen RR, có kiểu gen Rr, 25 có kiểu gen rr - Từ quần thể phân ly F2 tổ hợp lai (IR64xIRBB21) thu được: có kiểu gen RR, 11 có kiểu gen Rr, 24 có kiểu gen rr - Từ quần thể phân ly F2 tổ hợp lai (N19xIRBB21) thu được: có kiểu gen RR, 15 có kiểu gen Rr, 16 có kiểu gen rr 47 * Một số hình ảnh điện di sản phẩm PCR Hình 3: Ảnh điện di sản phẩm gen xa-5 sau tiến hành phản ứng PCR tổ hợp lai (N91xIRBB5) Giếng 1: mẹ (N91) trạng thái đồng hợp tử trội gen kháng (RR) Giếng 2: bố (IRBB5) trạng thái đồng hợp lặn gen kháng (rr) Giếng đến 12: F2 Qua hình ta thấy, sau tiến hành phản ứng PCR đoạn nhân lên có kích thước nên qua điên di ta không phân biệt đối chứng âm, đối chứng dương mẫu nghiên cứu Do vậy, sản phẩm PCR cắt Enzyme cắt giới hạn DraI Kết chạy điện di sản phẩm cắt Enzyme trình bày hình 48 Hình 4: Ảnh điện di sản phẩm gen xa-5 sau ủ Enzyme DraI tổ hợp lai (N91xIRBB5) Giếng 1: mẹ (N91) Giếng 2: bố (IRBB5) Giếng 9, 11, 12: trạng thái đồng hợp tử lặn gen kháng (rr) Giếng 8: trạng thái dị hợp tử gen kháng (Rr) Giếng 3, , 5, 6, 7, 10: trạng thái đồng hợp tử trội gen kháng (RR) 49 Hình 5: Ảnh điện di sản phẩm Xa-7 sau tiến hành phản ứng PCR tổ hợp lai (T23xIRBB7) Giếng 1: mẹ (T23) Giếng 2: bố (IRBB7) Giếng 3, 4, 6, 13: trạng thái đồng hợp tử trội gen kháng (RR) Giếng 8, 9, 10, 11, 12: tạng thái dị hợp tử gen kháng (Rr) Giếng 5, 7, 14, 15, 16, 17, 18, 19: trạng thái đồng hợp tử lặn gen kháng (rr) 50 10 11 12 13 14 15 16 17 Hình 6: Ảnh điện di sản phẩm gen Xa-21 sau tiến hành phản ứng PCR tổ hợp lai (IR64xIRBB21) Giếng 1: mẹ (IR64) Giếng 2: bố (IRBB21) Giếng 4, 7, 10, 11, 16, 17: trạng thái đồng hợp trội gen kháng (RR) Giếng 3, 5, 6, 8, 9, 14: trạng thái dị hợp tử gen kháng (Rr) Giếng 12, 13, 15: trạng thái đồng hợp tử lặn gen kháng (rr) 51 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết theo dõi đặc điểm nông sinh học giống bố, mẹ sử dụng để lai Backross rút số kết luận sau: - Các giống sinh trưởng, phát triển bình thường Thời gian sinh trưởng giống dao động khoảng 141 ngày (N19) đến 152 ngày (IRBB21) - Năng suất tiềm giống dao động từ 61.2 đến 109.0 tạ/ha, giống có suất tiềm lớn N19 (109.0 tạ/ha) Tiến hành lây nhiễm nhân tạo chủng vi khuẩn số 10 bố mẹ tổ hợp lai F1 ta thấy: giống sử dụng làm mẹ nhiễm vừa đến nhiễm nặng, giống bố kháng hoàn toàn Các tổ hợp lai F1 chứa gen dị hợp tử xa-5 nhiễm vừa đến nhiễm nặng Đa số lây nhiễm nhân tạo tổ hợp lai F1 chứa gen dị hợp tử Xa-7, Xa-21 có phản ứng kháng Khi cho tổ hợp lai F1 có chứa gen kháng bạc hữu hiệu xa-5, Xa7, Xa-21 tự thụ tiến hành phân tích 40 quần thể F2 thu được: - Từ quần thể phân ly F2 tổ hợp lai (N91xIRBB5) thu được: 29 có kiểu gen RR, có kiểu gen Rr, có kiểu gen rr - Từ quần thể phân ly F2 tổ hợp lai (N46xIRBB5) thu 27 có kiểu gen RR, 10 có kiểu gen Rr, có kiểu có kiểu gen rr - Từ quần thể phân ly F2 tổ hợp lai (Bắc ThơmxIRBB7) thu được: 13 có kiểu gen RR, có kiểu Rr, 21 có kiểu gen rr - Từ quần thể phân ly F2 tổ hợp lai (T23xIRBB7) thu được: có kiểu gen RR, có kiểu gen Rr, 25 có kiểu gen rr - Từ quần thể phân ly F2 tổ hợp lai (IR64xIRBB21) thu được: có kiểu gen RR, 11 có kiểu gen Rr, 24 có kiểu gen rr 52 - Từ quần thể phân ly F2 tổ hợp lai (N19xIRBB21) thu được: có kiểu gen RR, 15 có kiểu gen Rr, 16 có kiểu gen rr 5.2 Đề nghị Các chứa gen xa-5, Xa-7, Xa-21 thu F1 tự thụ có kiểu gen đồng hợp tử cần trồng riêng (gen kháng không bị phân ly) theo dõi, đánh giá chọn lọc theo hướng suất cao, chất lượng tốt Các tổ hợp lai BC1F1 cần tiến hành phản ứng PCR để phát cá thể trạng thái dị hợp tử (Rr) gen kháng xa-5, Xa-7, Xa-21 để tiếp tục lai lại với giống cần chuyển gen 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Chí Bửu (2002) Cơ sở di truyền tính kháng sâu bệnh hại trồng NXB thành phố HCM Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (1995) Ứng dụng công nghệ sinh học cải tiến giống lúa NXB Nông Nghiệp Bùi Chí Bửu, Nguyễn Văn Tạo, Trịnh Thị Lũy, Nguyễn Thị Lang (2002) Bảo tồn nguồn tài nguyên di truyền lúa đồng Sông Cửu Long NXB Nông Nghiệp Nguyễn Văn Hiển (2000) Chọn giống trồng NXB Giáo dục Nguyễn Cơng Khối (2002) Nghiên cứu bệnh bạc lúa (Xanthomonas oryzae pv oryzae) hại số giống lúa lai, lúa tỉnh Nam Định 2001-2002 Luận án thạc sĩ nơng nghiệp Phan Chí Thành Giáo trình phương pháp thí nghiệm đồng ruộng NXB Nơng Nghiệp, 1998 Trần Bích Lan, Vũ Đức Quang, Lê Đài Phương, Trần Duy Quý Sử dụng thị phân tử liên kết với gen kháng phục vụ công tác chọn tạo giống kháng bệnh bạc lúa năm 2003 Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (2001) Giáo trình bệnh nơng nghiệp NXB Nơng Nghiệp Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (1999) Bệnh vi khuẩn, virus hại trồng NXB Giáo dục 10 Đinh Thị phòng, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội, Nguyễn Thị Hải Hà, Lê Duy Thành, Nguyễn Văn Viết (2004) Nghiên cứu đa dạng tập đồn giống lúa có tính kháng khác với bệnh bạc vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae kỹ thuật RAPD Những vấn đề khoa học sống NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội 11 Tạ Minh Sơn (1987) Bệnh bạc hại vi khuẩn tạo giống chống bệnh Luận án phó tiến sĩ khoa học Viện khoa học kỹ thuật việt Nam 12 Bùi Trọng Thủy, Phan Hữu Tôn (2004) Khả kháng bệnh bạc dòng thị (tester) chứa đa gen kháng với số chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzae gây bệnh bạc lúa phổ biến miền Bắc Việt Nam 13 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Phương Thảo (2004) Giáo trình cơng nghệ sinh học nơng nghiệp NXB Nơng Nghiệp 14 Phan Hữu Tơn (2005) Giáo trình cơng nghệ sinh học chọn tạo giống trồng NXB Nông Nghiệp 15 Phan Hữu Tôn Chiến lược chọn tạo giống lúa miền Bắc Việt Nam 16 Phan Hữu Tôn (2005) Phân bố, đặc điểm gây bệnh chủng vi khuẩn bệnh bạc lúa phát nguồn gen kháng kỹ thuật PCR Khoa học nông nghiệp phát triển nông thôn 20 năm đổi mới, tập 17 Phan Hữu Tôn Nghiên cứu thị phân tử phục vụ chọn tạo giống lúa suất cao, chất lượng tốt, kháng bệnh bạc Đồng Bằng Bắc Bộ Báo cáo hội thảo khoa học công nghệ quản lý nơng học phát triển nơng nghiệp bền vững Việt Nam 18 Bùi Trọng Thủy CS (2004) Kết nghiên cứu chủng (Pathotype) Xanthomonas oryzae pv Oryzae, gây bệnh bạc lúa miền Bắc Việt Nam – Tạp chí BVTV Số 19 Nguyễn Thị Lang, Hồng Nhật Hùng, Bùi Chí Bửu (2002) Cơ sở di truyền khả kháng bệnh bạc lúa Tạp chí NN & PTNT ki I, tháng 20 Đinh Thị Phịng, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội, Nguyễn Thị Hải Hà, Lê Duy Thành,Nguyễn Văn Viết (2004) Nghiên cứu đa dạng tập đoàn giống lúa có tính kháng khác với bệnh bạc vi khuẩn xanthomonas 55 oryzae pv Orryzae kỹ thuật RAPD Những vấn đề khoa học sống NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội Tài liệu nước 21 A.C Sanchez et al (2002) Sequence Tagged site marker assistance selection for three Bacterial Blingt gến in rice Crop science, vol 40,p792797 22 Devadath S (1985) Managenment of bacterial blight and bacterial leaf steak of rice Central rice Research Institute, Cuttack, India, p.143 23 Fang C.T & CS (1963) Studies on the dissease resistance of rice Ibid.6, 107-112 24 Lee K.S & CS (2003) Inheritance of resistance to Bacterial bling in 21 cutivars of rice Phytopathology, p.147-152 25 Khush G.S (1977) Disease and insect resistance in rice Adv Agron.29: 268-341 26 Kiryu T, Mizuta H (1955) On the relation between habits of rice and resistance of bacterial leaf blingt Kyushu Agricultural reseach,54-56 27 Mizukami T, Murayama Y (1960) Studies on the bacterial blight resistance of rice plant Agricultural Bulletin, Saga University 11, 75-82 28 Misawa T, Miyazaki E (1972) Studies on the bacterial blight resistance of rice plan Annals of the phytopathological Society of Japan, 375-380 29 Niveditam Nayak et al (2002) Biological control of Bacterial leaf blight of rice by Bdellovibrio bacterivorus-Plant-Disease-Research, 381-383 30 Reimers P.J, Leach J.E (1991) Race-specific Resistance to Xanthomonas oryzae pv oryzae conferrend by bacterial blight resistance gene Xa10 in rice (Oryza sativa) involves accumulation of lignin-like substance in host tissuses Physiol Mol Plant Pathol,39-55 31 Tika B Adhikari, Anil Shrestha, Ram Chandra Basnnyat, 56 T.W.Mew (1999) Use of Partial host resistance in the management of Bacterial blight of rice Plant disease Vol 83, p896-901 57 ... tính kháng bệnh bạc .15 2.4 Ứng dụng thị phân tử DNA chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc 16 2.4.1 Giới thiệu thị phân tử DNA 16 2.4.2 Chỉ thị phân tử liên quan số gen kháng bệnh. .. chứa gen kháng hữu hiệu làm vật liệu cho vụ sau, tiến hành đề tài: ? ?Lai chuyển gen chọn lọc gen kháng bệnh bạc hữu hiệu xa-5, Xa-7, Xa-21 vào số giống lúa tốt thị phân tử DNA? ?? 1.2 Mục đích yêu... đích Chuyển thành cơng gen kháng bệnh bạc hữu hiệu xa-5, Xa-7, Xa-21 vào giống lúa có đặc điểm nơng sinh học tốt phương pháp lai Backcross kết hợp với chọn lọc phân tử Sử dụng thị phân tử DNA chọn