NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN BAP : 6-benzyl amino purin IAA : β-indole-acetic acid IBA : Indode-3-butyric acid Kin : Kinetin (6 fulfury amino purin) α-NAA : α-Napthalene acelic acid H 2 O 2 : Hydro peroxide (nước ôxy già) HgCl 2 : Thủy ngân Clorua ND : Nước dừa Agar : Thạch MS : Muashige and Skoog, 1962 AI : Activiti ingrendient (hoạt chất) NS : Non-signficant (sai khác không có y nghĩa) LSD 0.05 : Giới hạn nhỏ nhất sai khác có y nghĩa khi so sánh ở xác suất 95% LSD 0.01 : Giới hạn nhỏ nhất sai khác có y nghĩa khi so sánh ở xác suất 95% CV% : Hệ số biến động 1 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN MỤC LỤC PHẦN MỘT: MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề 2. Mục đích yêu cầu 2.1. Mục đích 2.2. Yêu cầu PHẦN HAI 2 PHẦN MỘT: MỞ ĐẦU l. ĐẶT VẤN ĐỀ. Hoa cúc (Chrysan Themumsp) là một trong những loài hoa được nhiều người ưa chuộng và phổ biến nhất ở Việt Nam. Hoa cúc là một trong 4 cây tượng trưng cho người quân tử, tượng trưng cho 4 mùa “Tứ quí” “Xuân lan, thu cúc, đông đào Hạ chen hoa Lựu, Mai vào gió đông” Ngày nay cùng với sự phát triển của xã hội, đời sống vật chất cũng như trình độ thẩm mỹ của con người được nâng cao, nhu cầu thưởng thức cái đẹp cũng được coi trọng. Do đó nhu cầu về hoa không ngừng tăng lên. Trong rất nhiều loài hoa thì hoa cúc đã được sự chú ý của người chơi hoa. Khi nói đến hoa, Người Việt Nam không chỉ nói đến hoa cúc vì hoa cúc không chỉ hấp dẫn người tiêu dùng về màu sắc, hình dáng và mùi thêm kín đáo mà còn thu hút các nhà sản xuất kinh doanh bởi đặt trưng rất bền, mọi đặt tính mà không phải bất kỳ loài hoa nào cũng có. Từ trước đến nay, hoa cúc luôn được đánh giá là loài hoa có giá trị kinh tế cao, nhu cầu về loài hoa cúc lúc nào cũng lớn trên thị trường trong và ngoài nước. Với các ưu thế đó, hoa cúc đang được các nhà trồng hoa chú trọng đầu tư và phát triển. Trong số các giống Cúc hiện nay, Cúc CN01 là giống có năng suất cao, các đặt điểm về chất lượng hoa lại phù hợp với nhu cầu xuất khẩu, nên hiện đang trồng phổ biến. Tuy nhiên, Cúc CN01 lại được trồng chính vào mùa vụ mà thời tiết không thuận lợi, sâu bệnh nhiều… Việc nhân giống bằng phương pháp dâm cành vẫn còn gặp nhiều khó khăn. Thứ nhất: về chất lượng giống: các giống hoa Cúc hiện có ở Việt Nam tuy được nhập nội và trồng chưa lâu nhưng bước đầu tiên đã giảm chất lượng do sâu bệnh, do nhân giống và tính không được định kỳ phục trúng 3 giống. Hiện tượng này làm giảm chất lượng sản phẩm như: bông không to, cành ngắn nhỏ… Vì vậy chưa đáp ứng nhu cầu của thị trường. Thứ hai: Về kỹ thuật nhân giống, cây hoa Cúc nước Ta chủ yếu được nhân giống bằng phương pháp dâm cành nên hệ số nhân giống chưa cao, cây không sạch bệnh. Hơn nữa phương pháp nhân giống này còn phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết, khí hậu … gây khó khăn cho việc nhân giống trên đồng ruộng. Ngoài ra trong công cuộc chuyển đổi cơ cấu cây trồng theo hướng sản xuất sản phẩm nông nghiệp hàng hóa có giá trị cao, việc phát triển hoa nói chung và hoa Cúc nói riêng phục vụ tiêu dùng và xuất khẩu đang có sự bùng phát như vậy việc nghiên cứu nhân giống nhanh là việc rất cần thiết. Với kỹ thuật nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy in vitro tỏ ra ưu việt. Có thể tạo được cây con sạch bệnh, đồng nhất về việc duy truyền với số lượng lớn trong thời gian ngắn, đáp ứng được nhu cầu cho thực tiễn sản xuất, chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ''Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây hoa cúc CN01 (Standard chrysanthemum) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro''. 2. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU. 2.1. Mục đích. Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoa cúc CN01 để phần đáp ứng thực tiễn sản xuất hoa cúc hiện nay. 2.2. Yêu cầu. - Nghiên cứu các phương pháp khử trùng cho các vật liệu đưa vào nuôi cấy. - Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến việc nhân nhanh hồi cúc. - Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng hình thành rễ để tạo cây hoàn chỉnh. 4 - Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây in vi tro ở giai đoạn vườn ươm. 5 PHẦN HAI TỔNG QUAN TÀI LIỆU l. GIỚI THIỆU VỀ CÂY HOA CÚC. 1.1. Nguồn gốc, vị trí, phân loại và các giống hoa cúc. Hoa cúc (Chlysanthemum sp) là một loại hoa có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam và một số nước Châu Âu. Hoa cúc được xếp vào lớp hai lá mầm (Dicotyledones), phân lớp hoa cúc (Asterldae), bộ cúc (Astelales), phân họ hoa ống (Asteloideae) chi (Chrysanthemum). Theo điều tra hiện nay thì Chlysanthemum ở Việt Nam có 5 loài và trên thế giới có 20 loài. Các giống loài thuộc chi Chlysanthemum chủ yếu làm hoa và cây cảnh[1]. Chi Chlysanthemum thuộc cây thân thảo, sống một năm hay lâu năm, thường mọc thẳng đứng, đơn hoặc phân cành nhánh nhiều. Lá thường chia thuỳ, mọc cách và không có lá kèm, mép lá cớ khía răng cưa. Hoa lưỡng tính, tập hợp thành cụm hoa, hình đầu lớn người ta thường gọi là hoa tự đầu trạng. Mỗi cánh hoa thực chất là một bông hoa, tràng hoa hình ống. Bộ nhụy gồm hai lá noãn luôn luôn dính lại thành bầu dưới, có một ô và một noãn. Quả bế, nhẵn, không cánh, chỉ có một hạt nằm trong khoang quả và đôi khi nó lại dính với quả. Các loài thuộc chi Chrysanthemum hoa thường to, có màu vàng, trắng, tím đậm, tím nhạt hay hồng. Hiện nay hoa cúc có rất nhiều chủng loại giống khác nhau: - Giống cũ gồm có các loại: Cúc gấm, vàng Đà Lạt, hoạ mi, chi thơm, đỏ Ấn Độ, tím hoa cà. - Giống mới nhập nội gồm có: CN93, CN97, CN98, tím hè, vàng Đài Loan, tím xoáy, tím Hà Lan, đỏ tiết dê, tím sen, và tập đoàn cúc chi có nguồn gốc từ Hà Lan gồm rất nhiều giống khác nhau [ l 3]. 6 l.2. Giá trị kinh tế của cây hoa cúc. Cúc là một lại hoa đẹp thường được dùng trong các ngày lễ, tết, cưới xin và được sử dụng với nhiều cách như trồng đại trà để cắt hoa cắm bình, trồng trong bồn, trang trí trong nhà, trong vườn hoa và công viên. Sản xuất và kinh doanh hoa cúc đã đem lại cho người trồng hoa nhiều lợi nhuận. Trên mỗi sào (bắc bộ) đất trồng trọt, với mật độ trung bình: 50 cây/m 2 , người trồng có thể thu được từ 5 - 6 triệu đồng (tính giá trung bình 300đ/bông) và chi phí cho làm đất, chăm sóc, giống và các vật tư khác thì hết l,8 - 2 triệu đồng. Trong khi đó với cây lúa thu nhập chỉ đạt 350.000 - 400.000 đ/sào [ l4]. Ngoài ra, nếu hoa được đùng xuất khẩu thì lợi nhuận còn lớn hơn nhiều. Hiện nay, với sự thành công của các biện pháp kỹ thuật như kéo dài tuổi thọ của hoa, điều khiển hoa ra theo ý muốn, trồng hoa trái vụ hoặc cho nở vào các dịp lễ tết, đã làm cho giá trị của hoa được tăng lên rất nhiều lần. Bên cạnh đó, hoa còn được dùng để chế tinh dầu thơm, pha trà, ngâm rượu, làm thuốc trừ sâu Đối với ngành y dược, một số loại cúc còn có tác dụng chữa bệnh đau đầu, đau mắt… 1.3. Vài nét về cây hoa cúc CN0l CN01 là giống cúc đơn (standald Chrysanthemum). ĐÂY là giống nhập nội của Nhật Bản, được đưa ra từ Trung tâm hoa - cây cảnh - Viện Di truyền Nông nghiệp tháng 3 năm 2001. Giống có đặc điểm cây cao (70 - 75 cm), thân mập cứng, lá dài xanh bóng, bộ lá gọn. Khả năng phân cành ít nên có thể trồng dày 45 – 50 cây/m 2 . Hoa kép to, cánh ngắn, cứng, xếp chặt, có màu và vàng cam. Thời gian sinh trưởng từ 85 - 95 ngày, độ bền hoa cắt từ 10 - l2 ngày, được trồng chính vào các vụ xuân hè, hè thu, và thu sớm. 7 Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ từ Phòng nông nghiệp các tỉnh phía bắc, năm 2003, diện tích trồng cúc CN01 đã lên đến 6,3 ha, riêng Hà Nội có 4,9 ha [15]. l.4. Tình hình sản xuất cây hoa cúc 14.l Tình hình sản xuất cây hoa cúc trên thế giới Trên thế giới, cây hoa cúc được trồng ở nhiều nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Hà Lan, Pháp, Mỹ Trong đó, Hà Lan là một trong những nước xuất khẩu hoa cúc nói riêng và hoa cắt nói chung lớn nhất trên thế giới. Diện tích trồng hoa ở nhà kính và ở ngoài trời từ năm l970 là 709 ha, đến năm 1984 là 5016 ha. Hàng năm, Hà Lan đã sản xuất hàng trăm triệu cành hoa cắt, hoa chậu phục vụ cho thị trường tiêu thụ rộng lớn gồm hơn 80 nước ở khắp nơi trên thế giới. Đặc biệt ở Nhật Bản, nhu cầu sử dụng hoa cúc rất lớn, diện tích trồng là loại hoa này chiếm khoảng 70% tổng diện tích trồng các loại hoa khác. Tuy vậy, hàng năm ở Nhật Bản vẫn phải nhập một số lượng lớn hoa cúc từ Hà Lan. Ở Thái Lan, hoa cúc là một trong những cây trồng quanh năm, với số lượng cành cắt hàng năm là 50.841.500 cành. Trung Quốc là một trong những nước có kỹ thuật tiên tiến trong việc sản xuất hoa cúc khô và là nơi có nguồn hoa cúc phong phú. 1.4.2. Tình hình sản xuất hoa cúc ở Việt Nam. Ở Việt Nam, diện tích trồng hoa cúc còn ở mức khiêm tốn, khoảng 3500 ha, tập trung chủ yếu ở các vùng trồng hoa như Hà Nơi, Hải Phòng, Đà Lạt và chủ yếu là các giống cúc nhập nội. Riêng Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh, hàng năm sản xuất hàng chục triệu cành hoa cúc cắt, cúc chậu phục vụ cho nhu cầu trong nước. Hải Phòng, cúc là cây quan trọng thứ hai trong cơ cấu sản xuất hoa tươi. Cùng với layơn, cúc là một mặt hàng xuất khẩu trong những năm tới. 8 Ở các tỉnh phía Nam như Đà Lạt, Huế là nơi có diện tích trồng cúc lớn nhất. Đà Lạt là vùng lý tưởng cho nhiều giống cúc sinh trưởng và phát triển. Có thể nói, so với những năm trước đây sản xuất hoa cúc ở Việt Nam là đã tăng lên đáng kể. Tuy nhiên, lương hoa sản xuất ra thực sự còn rất hạn chế so với nhu cầu rất cao của thị trường, cũng như tiềm năng kinh tế to lớn mà cây hoa cúc có thể mang lại nếu được đầu tư phát triển 19]. Ở Việt Nam hiện nay việc nhân giống cây hoa cúc chủ yếu bằng phương pháp vô tính gồm hai biện pháp: - Nhân giống bằng giâm cành: Chọn cành bánh tẻ, to khoẻ, không sâu bệnh làm cành giâm. Cành giâm có chiều dài 6 - 8 cm, có 3 - 4 lá, sau khi giâm phải che nắng, che mưa, giữ ẩm 70% - 80%. - Nhân giống bằng nuôi cấy in vitro: Là phương pháp được dùng phổ biến hiện nay ở các nước trồng cúc, bởi cây cúc dễ nhân trong ống nghiệm, hệ số nhân cao, giá thành hạ, cây con sạch bệnh. Đặc biệt phương pháp này có thể duy trì và nhân giống quanh năm, không phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh. Từ các mô, các cơ quan khác nhau qua nuôi cấy người ta có thể tạo ra những cây hoàn chỉnh, hoàn toàn sạch bệnh và đồng nhất về mặt di truyền [16]. 2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÂY HOA CÚC TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM Do giá trị kinh tế cũng như giá trị sử dụng của cây hoa rất cao mà trên thế giới có rất nhiều nước đi sâu nghiên cứu kỹ thuật trồng hoa, kỹ thuật nhân và tạo giống hoa mới. 2.l. Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc ở lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào Năm l974, Asjes và công sự (Hà Lan) đã chứng minh rằng có thể sử dụng nhiều bộ phận của cây hoa cúc để làm vật liệu nuôi cấy mô. Ông đã ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo ra các giống cúc sạch bệnh. 9 Việc sử dụng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy in vitro cũng được thực hiện thành công bởi Fukai, Goi và Yanaka (1991). Các tác giả đã nghiên cứu phương pháp tối ưu để tạo mẫu vô trùng có tỷ lệ sống và tái sinh chồi cao nhất. Kết quả thí nghiệm cho thấy, bảo quản chồi đỉnh cúc trước nuôi cấy 2 ngày trong điều kiện lạnh dần cứ 0,2 0 C/phút đến -40 0 C Với 10% dimethyl sufoide và 3% gluco cho tỷ lệ sống và tái sinh chồi rất cao, có loài lên tới 100% . Ngoài chồi đỉnh, nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng các bộ phận khác của cây hoa cúc để nuôi cấy như đoạn thân, mẫu lá Kaul, Miller, Hutchison, Richards (1990) cho thấy các đoạn thân có khả năng tái sinh chồi cao hơn các mẫu lá. Cùng năm đó Lu, Negent và Wardley đã thành công việc tái sinh cây trực tiếp từ những đoạn thân của hoa cúc Chlysanthemum morifolium Ramat trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 0,2-0,5 mg/l BAP và 0,2-2 mg/l NAA. Tỷ lệ tạo chồi cao nhất là 100%. Đối với những đoạn thân của cây đã thành thục, khả năng phát sinh chồi cao hơn [28]. Người ta còn có thể nhân giống hoa Cúc bằng cách tái sinh Callus từ các mẫu cấy thân và lá. Rasthasarathi, Bhattaccharya, Satyahari, Nilanana (1960) đã nuôi cấy callus từ lá và thân của Chrysanthemum morifoliun trên môi trường MS có bổ sung 2mg/l 2,4D trong 2 tuần. Sau đó, các tác giả đã tái sinh chồi từ callus trên môi trường đặc MS có bổ sung 1mg/l IAA và 0,2 mg/l BAP. Sau 2 tuần 1cm 2 callus được tái sinh 2-3 chồi. Ngoài ra, việc sử dụng cánh hoa, quả để làm nguyên liệu nuôi cấy tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp cũng được nhiều nhà khoa học nghiên cứu [32]. Cho đến nay, việc sử dụng chồi đỉnh và chồi nách để làm nguyên liệu cho nuôi cấy mô vẫn là biện pháp phổ biến nhất bởi vì sử dụng chồi đỉnh và chồi nách dễ thành công, ít nhiễm bệnh, có hiệu quả cao hơn so với việc sử dụng các bộ khác của cây hoa cúc để nuôi cấy. Sử dụng phương pháp này, cho phép tạo một số lượng lớn cây con giống, sạch bệnh đồng nhất về mặt di 10 [...]... cả nước đã nghiên cứu thành công nhiều quy trình nhân giống cây hoa và cây ăn quả Tóm lại, nuôi cấy mô thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương trình chọn giống và nhân giống hiện đại, góp phần tích cực vào lý luận sinh học cây trồng, và thực tiễn nông nghiệp Mở ra một hướng đi mới cho nghiên cứu di truyền học, sinh hoá, sinh lý thực vật Đặc biệt đem lại những ứng dụng to lớn trong công tác lai... Sinh vật - Viện Khoa học 22 Việt Nam hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro một số giống cây trồng có khả năng chống chịu như lúa, thuốc lá, khoai lang, dứa sợi Tại trường Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội hoàn thiện quy trình nhân giống khoai tây Tại các tỉnh phía Nam xây dựng được ngân hàng cà phê với 10 giống khác nhau, hoàn thiện quy trình nhân giống cao su Ngoài ra, các phòng thí nghiệm nuôi cấy. .. l.000 giống đã được trồng phổ biến, riêng ở Việt Nam có 75 giống, 199 loài Từ năm l992, Trung tâm Hoa - cây cảnh Viện Di truyền Nông nghiệp kết hợp với Bộ môn nuôi cấy mô tế bào của Viện đã tiến hành nghiên cứu xây dựng qui trình nhân giống cây hoa cúc bằng phương pháp nuôi cấy in vitro Tiến hành thu thập khảo sát và đánh giá một số giống cúc mới, kết quả là từ 12 2/1993 đến tháng 2/1999, giống cúc CN93... hiệu quả của toàn bộ quá trình vi nhân giống vào thực tiễn sản xuất Roberts và Smith (1990) đã nghiên cứu bảo vệ rễ bằng chất đệm cellulose sorbarods trong môi trường nuôi cấy dạng lỏng, làm giảm thiệt hại trong quá trình đưa cây ra ngoài [35] 2.2 Các nghiên cứu khác về cây hoa cúc Ngoài lĩnh vực nuôi cấy in vitro, các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu cây hoa cúc ở các lĩnh vực khác... truyền cho công tác chọn giống - Nhân nhanh và duy trì các giống, cá thể có ý nghĩa khoa học và ý nghĩa kinh tế cao - Làm sạch virut phục tráng giống bị thoái hoá vì bệnh Trong đó, ứng dụng trong nhân giống cây trồng là lĩnh vực được quan tâm hơn cả Nuôi cấy in vitro là một phương pháp nhân giống hữu hiệu nhất trong các phương pháp nhân giống vô tính Phương pháp này cho phép tạo ra một quần thể cây con... thương mại để sản xuất hoa cắt Colombia là nước sản xuất hoa Cẩm Chướng lớn nhất giới nhờ công nghệ nuôi cấy in vitro Tóm lại, nuôi cấy in vitro đã được đưa vào chương trình chọn và nhân giống hiện đại Bằng phương pháp này, con người đã xây dựng nên các hệ thống sản xuất giống gốc, cho nhiều loại cây hoàn toàn sạch virut (khoai tây, đu đủ… Ở Việt Nam, từ năm 1975 nhiều phòng nuôi cấy mô trong cả nước... 2: Tái sinh mô nuôi cấy Trong nhân giống in vitro, mẫu nuôi cấy thường được sử dụng là chồi hoặc chồi nách của cây mẹ Ngoài ra, tuỳ từng đối tượng mà người ta còn có thể dùng các mẫu nuôi cấy là rễ, thân, lá, đài hoa, cánh hoa Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy: Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vàn tỉ lệ các hợp chất auxin/cytokinin ngoại sinh đưa... hoa cây cảnh, kỹ thuật nuôi cấy in vitro và các nghệ sinh học khác như: tạo phôi soma, biến dị soma đã ngày càng đóng góp rất nhiều vào thị trường hoa - cây cảnh trên thế giới Năm 1985, kim ngạch của thị trường này ước tính 20 - 25 tỷ USD ở Hà Lan, kỹ thuật vi nhân giống trở thành nền tảng của công nghệ hoa và cây cảnh Năm l987, Thái Lan có 20 công ty tư nhân dùng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trên quy. .. trùng Cho đến nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật được xem giải pháp công nghệ quan trọng trong công nghệ sinh học nói chung Trên môi trường nhân tạo, từ các môn hoặc các cơ quan thực vật ban đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chỉ trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một lượng lớn cây trồng có cấu trúc di truyền và các đặc điểm sinh học giống hệt nhau 3.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào... cho cây có tỷ lệ sống cao thì cần phải đưa cây ra vườn ươm, ươm trên các giá thể thích hợp từ 10 -15 ngày Lúc này rễ mới được sinh ra, lá non bắt đầu hình thành Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thường 3.5 ứng dụng của nuôi cấy in vitro trong công tác nhân giống Nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể phục vụ rất nhiều lĩnh vực khác nhau Trong công tác nhân giống cây trồng, nuôi cấy in vitro . vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: '&apos ;Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây hoa cúc CN01 (Standard chrysanthemum) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro& apos;'. 2. MỤC. tâm Hoa - cây cảnh Viện Di truyền Nông nghiệp kết hợp với Bộ môn nuôi cấy mô tế bào của Viện đã tiến hành nghiên cứu xây dựng qui trình nhân giống cây hoa cúc bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. . đích. Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoa cúc CN01 để phần đáp ứng thực tiễn sản xuất hoa cúc hiện nay. 2.2. Yêu cầu. - Nghiên cứu các phương pháp khử trùng cho các vật liệu đưa vào nuôi