Li cm n MC LC TRANG PHN I. M U 1 1.1. t vn 1 1.2. Mc ớch ca ti 2 Page 1 of 55 Li đầu tiên trong bản khoá luận này tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại tr ờng và đã sắp xếp chu đáo nơi thực tập tốt nghiệp để tôi hoàn thành bài luận văn này một cách tốt nhất. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Huy Hàm Viện tr ởng Viện Di truyền Nông nghiệp đã tận tình h ớng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận văn. Cảm ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật Viện Di truyền Nông nghiệp đặc biệt là TS. Phạm Thị Lý Thu, TS. Nguyễn Thị Khánh Vân, Ths. Vũ Văn Tiến và CN. Phạm Thị H ơng đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu, tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những ng ời thân đã luôn động viên, sát cánh bên tôi, giúp đỡ tôi những khi gặp khó khăn. Hà Nội, ng y 19 tháng 5 năm 2009 Sinh viên 1.3. ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Một số đặc điểm sinh học của bèo tấm Spirodela polyrrhiza 4 2.1.1 Hệ thống phân loại 4 2.1.2 Đặc điểm hình thái của bèo tấm 5 2.1.3 Phương thức sinh sản 5 2.1.4 Phân bố của bèo tấm 6 2.2. Các yếu tố môi trường nuôi cấy ảnh hưởng tới đời sống bèo tấm… 7 2.3. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật 9 2.3.1. Phương pháp chuyển gen trực tiếp 10 2.3.2. phương pháp chuyển gen gián tiếp 12 2.4. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 12 2.4.1. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 13 2.4.2. Cấu truc và chức năng của đạn T- DNA 14 2.4.3. Cơ chế phân tử của chuyển gen thông qua A.tumefaciens 15 2.4.4. Hệ thống vectơ chuyển gen 16 2.5. Tình hình nghiên cứu xây dung hệ thống chuyển gen vào bèo tấm 18 2.5.1. Tình hình nghiên cứu thế giới 18 2.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 20 PHẦN III : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 Page 2 of 55 3.1. Vật liệu nghiên cứu 22 3.1.1. Vật liệu thực vật 22 3.1.2.Vật liệu vi khuẩn và plasmid 22 3.1.3. Hoá chất và máy móc thiết bị phục vụ cho nghiên cứu 23 3.2. Phương pháp nghiên cứu 24 3.2.1. Xây dựng hệ thống chuyển gen vào bèo tấm S. polyrrhiza 24 3.2.2. Quan sát và xác định tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus…………… … 27 3.2.3. Phương phỏp tỏch chiết DNA bèo tấm……………………………….…27 3.2.4. Phương pháp phân tích PCR…………………………………………….28 3.3. Nội dung nghiên cứu 29 3.4. Các chỉ tiêu đánh giá 31 PHẦN IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1. Xây dựng quy trình chuyển gen vào bÌo tấm S. polyrrhiza 32 4.1.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn thích hợp cho các thí nghiệm chuyển gen ở bèo tấm SP nguyên cây và callus 32 4.1.2 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyên cây và callus 34 4.1.3.Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyên cây và callus 35 4.1.4. Ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở bèo tấm SP nguyên cây và callus 36 4.2. Chuyển gen bền vững vào callus bèo tấm Spirodela polyrrhiza thông qua vi khuẩn Agrobacterium 39 4.2.1. Kết quả nuôi cấy phục hồi sau khi đồng nuôi cấy 39 Page 3 of 55 4.2.2. Kết quả chọn lọc sau diệt khuẩn 39 4.2.3. Kết quả tách chiết DNA và phân tích PCR các dòng bèo tấm chuyển gen 42 PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 5.1. Kết luận 44 5.2. Đề nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT Page 4 of 55 ADN Deoxyribo Nucleic Acid AS Acetosyringone Bp base pair CH Casein hydrolysate Cs cộng sự EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Acid Et-Br Ethidium Bromide gus β-glucuronidase gene= gen mã hoá β- glucuronidase MCS Multi-Cloning Site NOS Nopaline Sythetase NOS-p Nopaline Sythetase promotor NptII Neomycin phosphotransferase gene OD600 Mật độ vi khuẩn đo ở bước sóng 600nm bằng quang phổ kế DUR 800 Spectrophotometer của hãng Beckman Coulter PCR Polymerase Chain Reaction SP Spirodela polyrrhiza T-DNA Transferred – DNA = DNA chuyển Ti- plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u thực vật X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β -D-glucuronic acid PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 chứng kiến những thành tựu vượt bậc trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Một trong những thành tựu đó là tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có các đặc tính mới nh chống chịu sâu, bệnh, kháng thuốc diệt cỏ…Đến cuối năm 2008 diện tích cây chuyển gen toàn cầu đã đạt 125 triệu ha. Một loạt các giống cây trồng với các đặc tính hoàn toàn Page 5 of 55 mới như: chịu hạn, chịu mặn, tăng cường khả năng hấp thụ nitơ, chịu úng, tăng cường sinh trưởng, hoặc tăng cường chất lượng dinh dưỡng, chất lượng chế biến, tăng cường hoạt chất sinh học…đã được nghiên cứu và đang chuẩn bị đưa vào ứng dụng trong sản xuất (James, 2008). Sự phát triển hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng cây chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin, các dược chất, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế như: kháng nguyên, kháng thể, interferon, vaccine…(Mason & cs, 1998). Có nhiÒu hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp cần thiết cho các mục đích khác nhau của con người. Đó là hệ thống sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn, nấm men…Gần đây tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen được sử dụng để khắc phục các nhược điểm của hệ thống sản xuất protein sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn và nấm men. Do đó nhiệm vụ to lớn đặt ra cho các nhà khoa học là tìm kiÕm hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ sử dụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh có nguồn gốc virus. Hệ thống đó là thực vật. So với các hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế trong việc sản xuất protein tái tổ hợp. Vaccine do thực vật sản xuất thông qua kỹ thuật di truyền được gọi là “Vaccine sản xuất bằng thực vật” (Rowlandson & Tackaberry, 2003). Vaccine này có thể được sử dụng ở dạng tinh khiết hay dưới dạng dịch chiết thực vật hoặc nguyên liệu thực vật. Vaccine tái tổ hợp có thể được đưa vào những thực vật ăn được đối với người và động vật, tạo khả năng đưa vaccine vào qua đường miệng, gây miễn dịch cho hệ thống màng nhầy và miễn dịch toàn cơ thể (Hansson et al, 2000; Fishcher et al, 2003).ý tưởng sử dụng thực vật làm hệ thống sản xuất vaccine uống (edible vaccine) đó lôi cuốn các nhà khoa học của nhiều nước tham gia vào nghiên cứu trong thập niên vừa qua và đã thu được nhiều kết quả khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003). Page 6 of 55 Spirodela polyrrhiza là loài bèo tấm có tốc độ sinh sản vô tính nhanh. Thời gian nhân đôi sinh khối của chóng trong vòng 36 - 48 giờ. Bèo S. polyrrhiza dễ nuôi trồng với các thiết bị và thao tác đơn giản, môi trường dinh dưỡng không phức tạp, tạo ra các cây bèo đồng nhất, hệ số nhân sinh khối lớn trong thời gian ngắn, hàm lượng protein cao với thành phần axit amin phong phó (Landolt,1986). Vì vậy việc sử dụng bèo tấm nói chung và Spirodela polyrrhiza nói riêng làm đối tượng chuyển gen để sản xuất các loại protein tái tổ hợp có giá trị cao với giá thành thấp là một hướng nghiên cứu triển vọng. Xuất phát từ những cơ sở khoa học và đòi hỏi của thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào bèo tấm Spirodela polyrrhiza thông qua Agrobacterium tumefaciens “. 1.2. Mục đích của đề tài Xây dựng quy trình chuyển gen vào callus và bèo tấm nguyên cây Spirodela polyrrhiza thông qua Agrobacterium tumefaciens . 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài *Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về khả năng tiếp nhận gen từ Agrobacterium tumefaciens vào loài bèo tấm Spirodela polyrrhiza. * Ý nghĩa thực tiễn: Là cơ sở ứng dụng để chuyển gen quan tâm vào bèo tấm Spirodela polyrrhiza nhằm sản xuất protein tái tổ hợp. Page 7 of 55 PHẦN II . TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Một số đặc điểm sinh học của bèo tấm Spirodela polyrrhiza 2.1.1 Hệ thống phân loại Bèo tấm gồm 5 chi: Spirodela, Landoltia, Lemna, Wolffia, Wolffiella thuộc họ Lemnaceae với khoảng 40 loài khác nhau (Landolt, 1998; Les & cs, 2002; http://plants.usda.gov/java/profile?symbol=SPPO). Spirodela polyrrhiza thuộc: Giới : Thực vật (Plantae) Phân giới: Thực vật có mạch (Tracheobionta) Liên ngành: Thực vật có hạt (Spermatophyta) Ngành: Ngọc lan (hạt kín) (Magnoliophyta) Lớp: Một lá mầm (Liliopsida) Phân lớp: Ráy (Arecidae) Bộ: Ráy (Arales) Họ: bèo tấm (Lemnaceae) Chi: Spirodela a. Bèo trong vại nuôi b. Hình thái bèo tấm S.polyrrhiza Hình 2.1: Bèo tấm Sprirodela polyrrhiza Page 8 of 55 a b S. polyrrhiza thuộc chi Spirodela, chi này gồm 2 loài: S. intermedia và S. polyrhiza. Chi Spirodela là chi nguyên thủy nhất trong họ Lemnacea và có kích cỡ genome nhỏ nhất (Landolt, 1986). 2.1.2 Đặc điểm hình thái của bèo tấm Bèo tấm nói chung không có dạng thân, lá điển hình mà cơ thể gãi gọn trong một cấu trúc gọi là cánh bèo (frond). Chúng có hình dạng và kích thước rất đa dạng, từ,1 mm đến 10,0 mm, từ hình cầu đến hình trứng méo, hình ovan; từ không rễ tới có một rễ và nhiều rễ. Mặc dù tổ chức cơ quan của chóng bị suy giảm so với các loài thực vật điển hình nhưng hầu hết các loài bèo tấm có đầy đủ các mô và cơ quan tương tự nhiều loài thực vật hạt kín lớn hơn như: rễ, hoa, quả, hạt, Sự suy giảm về tổ chức cơ thể có thể quan sát thấy bắt đầu ở chi Spirodela, tiếp đến là chi Lemna, Wolffiella và Wolffia (Landolt, 1986). Bèo tấm S. polyrrhiza có hình dạng giống chiếc lá, hình trứng méo, cơ thể dạng bản mỏng, dài 1,5 – 10,0 mm, rộng 1,5- 8,0 mm. Mặt trên cánh bèo có màu xanh nhờ sự tập trung của diệp lục, đôi khi có một chấm nâu ở vùng nút (node) cánh. Mô biểu bì gồm nhu mô quang hợp xen kẽ bởi các gian bào khí lớn, nhờ các gian bào khí này mà bèo tấm trôi nổi được trên mặt nước. Mặt dưới (mặt bụng) có màu nâu đỏ, thường gặp khi bèo hoá già hoặc sống trong môi trường thiếu chất dinh dưỡng. Phần phía dưới nút có hai túi bên do vảy mành tạo thành. Các cánh bèo con được hình thành từ mô phân sinh tại điểm nút nằm trong hai túi màng này. Mỗi cánh bèo có 7-21 rễ mọc ra tại vùng nút phía ngoài hai tói (Landolt, 1986). 2.1.3 Phương thức sinh sản Bèo tấm có hai phương thức sinh sản để duy trì nòi giống: sinh sản hữu tính và sinh sản vô tính. Sinh sản hữu tính được thực hiện thông qua sự ra hoa và tạo hạt tương tự như các loài thực vật hạt kớn khỏc. Không chỉ có kích thước cơ thể nhỏ mà hoa và hạt của bèo tấm cũng rất nhỏ bộ, chớnh vì thế mà bèo tấm Page 9 of 55 được xem là loại thực vật hạt kín nhỏ bé nhất trong thế giới thưc vật (Landolt, 1986). Bèo tấm sinh sản vô tính thông qua hình thức nảy chồi, các cánh bèo con được sinh ra từ vựng mụ phân sinh nằm sâu trong cánh bèo mẹ và chúng tách khỏi cánh bèo mẹ khi trưởng thành ở hầu hết các loài. Khi các cánh bèo con được hình thành thì bản thân chỳng đó mang sẵn các thế hệ cánh bèo tiếp theo đang được hình thành ở mô phân sinh của chúng (Landolt, 1986). Trong tự nhiên, sinh sản vô tính là phương thức chủ yếu giúp cho quần thể bèo phát triển nhanh chúng, cũn phương thức sinh sản hữu tớnh giỳp cho quần thể bốo cú sự đa dạng về di truyền và chỉ xảy ra ở điều kiện nhiệt độ, độ ẩm và chất dinh dưỡng thớch hợp với sự ra hoa, thụ phấn và kết trái. Hạt của bèo tấm có sức chống chịu lớn với cỏc điốu kiện nóng, lạnh và khô hạn nên có thể tồn tại qua nhiều năm trong bùn, đất và các điều kiện ngoại cảnh bất lợi (Ladolt, 1986). 2.1.4 Phân bố của bèo tấm S. polyrhiza nói riêng và bèo tấm nói chung, sống ở các vùng nước ngọt như ao hồ hay đầm lầy Đặc điểm của các vùng nước này là tĩnh lặng hoặc có dòng chảy chậm. Chúng cũng có thể sống ở các vùng nước lợ nhưng rất hiếm thấy (Landolt, 1986). S. polyrhiza phân bố rộng rãi trên toàn thế giới trừ vùng cực Bắc, cận Bắc cực, những vùng rất ẩm ướt hay rất khô với mùa hè ấm, phia Đông và phía Nam của Nam Mỹ, New Zealand và một số đảo khác, hiếm gặp ở cỏc vựng cú khí hậu Địa Trung Hải (Landol, 1986). Page 10 of 55 [...]... ngày) Agrobacterium nuôi trên LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc thích hợp với từng chủng (Nuôi qua đêm ở 280C, lắc 140 vòng/phút) Bổ sung AS (1 - 2h trớc khi biến nạp) (Trộn đều) Vật liệu chuyển gen (Callus/SP nguyên cây) Đo OD Huyền phù callus /bèo tấm và Agrobacterium (Ly tâm chân không) Chuyển callus /bèo tấm lên môi trờng đồng nuôi cấy (Đồng nuôi cấy 2-3 ngày) Quan sát biểu hiện tạm thời của gen. .. 2003) Cỏc gen trờn T-DNA gm 2 nhúm: (1) Nhúm gen mó húa cỏc enzyme cho cỏc quỏ trỡnh sinh tng hp opine - l sn phm c vi khun A tumefaciens s dng lm ngun nng lng cung cp Cacbon v Nit; (2) Nhúm gen gõy khi u mang cỏc gen tms1, tms2 mó húa cho sinh tng hp auxin, tmr mó Page 18 of 55 húa cho enzyme liờn quan n sinh tng hp cytokinin (PGS TS Khut Hu Thanh, 2003) 2.4.3 C ch phõn t ca chuyn gen thụng qua A tumefaciens. .. mi ca c th chuyn gen (GS TS Nguyn Quang Thch, 2004) Cú nhiu phng phỏp chuyn gen vo thc vt nhng cú th phõn thnh hai nhúm chớnh: Phng phỏp chuyn gen trc tip v phng phỏp chuyn gen Page 13 of 55 giỏn tip Trong phng phỏp chuyn gen giỏn tip, gen c chuyn vo t bo thc vt qua một sinh vt trung gian, thng l vi khun, virus Cũn phng phỏp chuyn gen trc tip, gen c a trc tip vo t bo thc vt thụng qua nhng thit b v... ngày) Quan sát biểu hiện tạm thời của gen Gus Chuyển callus /bèo tấm lên môi trờng diệt khuẩn (Diệt khuẩn 2-3 đợt (5-6ngày/đợt) Chuyển callus /bèo tấm lên môi trờng chọn lọc (Chọn lọc 6-7đợt(5-6 ngày/đợt) Nhân + tái sinh callus /bèo tấm ngay sau chọn lọc Kiểm tra dòng bèo sống sót sau chọn lọc bằng PCR 3.2.1.1 Chun b dch vi khun lõy nhim: Page 29 of 55 Cy vi khun A tumefaciens t a thch sang 5 ml mụi trng LB... gn cỏc gen cn chuyn vo Tuy nhiờn hin nay, vic chuyn gen nh virus rt ít c s dng, do virus v nguyờn tc khụng truyn qua ht do vy vic nhõn ging cỏc cõy chuyn gen nh virus phi tin hnh bng phng phỏp vụ tớnh iu ny khụng phi thc hin c vi tt c cỏc loi cõy õy chớnh l mt nhc im ln ca phng phỏp chuyn gen bng virus 2.3.2.2 Phng phỏp chuyn gen thụng qua vi khun Agrobacterium Da vo c ch chuyn gen ca vi khun A tumefaciens, ... xõy dng quy trỡnh chuyn gen Page 22 of 55 thụng qua Agrobacterium tumefaciens vo bốo tm L.gibba G3 v L.minor 8744 v 8627 Tỏc gi ó thu c 1 dũng bốo chuyn gen thuc loi L.gibba G3 v 3 dũng bốo chuyn gen ca L.minor 8627 (2 dũng) v L.minor 8744 (1 dũng) Gen c chuyn l gen gus c iu khin bi promotor CaMV35S Kt qu phõn tớch lai ADN cho thy tt c cỏc dũng bốo chuyn gen u thy s cú mt gen gus (Yamamoto & cs.,... 300àM CT5: 400àM Ni dung 2: Chuyn gen bn vng vo callus Spirodela polyrrhiza + Thc hin 24 thớ nghim chuyn gen gus v hptII vo callus bốo tm SP +Chn lc v tỏi sinh cõy chuyn gen trờn mụi trng tỏi sinh cú b sung 10 mg/l geneticin (6-7 chu k chn lc) Page 34 of 55 + Bèo sng sút sau chn lc em tỏch chit DNA v c kim tra bng phng phỏp PCR 3.4 Cỏc ch tiờu ỏnh giỏ T l biu hin tm thi ca gen gus bốo tm nguyờn cõy Tf... cht dinh dng ca cõy Bốo tm cú th sinh trng v phỏt trin trong mụi trng cú di pH t 3,5 10,4 2.3 Cỏc phng phỏp chuyn gen vo thc vt K thut chuyn gen l k thut a mt hay nhiu gen l ó c thit k dng DNA tỏi t hp vo t bo ch ca cõy trng núi riờng v ca cỏc sinh vt núi chung (vi sinh vt, ng vt) lm cho gen l cú th tn ti dng plasmid tỏi t hp hoc gn vo b gen t bo ch Trong t bo ch, cỏc gen ny hot ng tng hp nn cc protein... loi Lemna chuyn cỏc gen cú giỏ tr kinh t, nhm sn xut cỏc hot cht khỏc nhau, trong ú cú vaccine Thỏng 10 nm 2004, chớnh ph Phỏp ó ti tr thnh lp cụng ty Lemnagene nhm mc ớch ng dng cụng ngh sinh hc trờn i tng bốo tm (www lemnagene com) Mi õy, Rival & cs ó ỏp dng quy trỡnh nuụi mụ v chuyn gen vo bốo tm Spirodela oligorrhiza ca Edelman & cs (1998) v Li & cs (2004) chuyn thnh cụng gen mó hoỏ aprotinin,... quy trỡnh chuyn gen mó hoỏ virus Gumboro VP2 (gõy bnh viờm tỳi bch huyt nhim trựng g) vo callus v bốo tm nguyờn cõy (Lemna sp v Wolffia sp ) bng sỳng bn gen v Page 24 of 55 Agrobacterium ó c xõy dựng v ci thin trờn c s ti u hoỏ cỏc yu t chớnh nh hng n quỏ trỡnh biộn np: chng vi khun, nng AS, thi gian ng nuụi cy,S cú mt ca gen chuyn trong cỏc dũng bốo tm chuyn gen ó c phõn tớch bng cỏc phng phỏp sinh . “ Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào bèo tấm Spirodela polyrrhiza thông qua Agrobacterium tumefaciens “. 1.2. Mục đích của đề tài Xây dựng quy trình chuyển gen vào callus và bèo tấm. phân tử của chuyển gen thông qua A .tumefaciens 15 2.4.4. Hệ thống vectơ chuyển gen 16 2.5. Tình hình nghiên cứu xây dung hệ thống chuyển gen vào bèo tấm 18 2.5.1. Tình hình nghiên cứu thế giới. về khả năng tiếp nhận gen từ Agrobacterium tumefaciens vào loài bèo tấm Spirodela polyrrhiza. * Ý nghĩa thực tiễn: Là cơ sở ứng dụng để chuyển gen quan tâm vào bèo tấm Spirodela polyrrhiza nhằm sản