CÔNG NGHỆ SINH ĐẠI CƢƠNG (SH3014) Giảng viên hướng dẫn: ……. BM CNSH TV – Khoa CNSH 9/3/2011 1 CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT VÀ CÁC HƢỚNG ỨNG DỤNG BM CNSH TV – Khoa CNSH 9/3/2011 2BM CNSHTV - KHOA CNSH Biến nạp gen ở thực vật là gì? • Chuyển gen /Biến nạp gen/ kỹ thuật di truyền ở thực vật là khái niệm dùng mô tả quá trình chuyển một hoặc một số gen ngoại bào vào trong tế bào thực vật nhằm tạo ra một tính trạng mới mà trƣớc đó cơ thể thực vật đó không có. • Gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trƣng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen BM CNSH TV – Khoa CNSH 9/3/2011 3 • Các gen biến nạp có thể có nguồn gốc khác nhau. Nó có thể đƣợc tách ra từ một nguồn tế bào khác có trong tự nhiên, hoặc đƣợc tổng hợp bằng các kỹ thuật sinh học phân tử • Quá trình biến nạp gen đƣợc coi là thành công khi gen biến nạp sau quá trình chuyển gen kết hợp ổn định của ADN của hệ gen nhân của tế bào biến nạp. Tế bào biến nạp này sau đó đƣợc tái sinh thành cây hoàn chỉnh với sự biểu hiện của gen biến nạp, và duy trì ổn định trong các thế hệ sau nhờ quá trình thụ tinh bình thƣờng. 9/3/2011 4BM CNSHTV - KHOA CNSH Biến nạp gen ở thực vật là gì? Mục đích biến nạp gen ở thực vật Việc biến nạp gen ở thực vật th-ờng nhằm các mục đích sau: 1. Nghiên cứu và làm sáng tỏ chức năng của một gen đ-ợc quan tâm hay từng phần của gen đó. 2. Làm thay đổi mức độ biểu hiện của một gen nội bào. 3. Chuyển các gen quy định các tính trạng mong muốn vào tế bào để thu nhận đ-ợc các tính trạng mới ở tế bào và cây chuyển gen. Trong đó, các gen quy định các tính trạng mong muốn sau đ-ợc quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả: + Các gen kháng bệnh (virus, nấm, vi khuẩn, sâu bệnh, giun tròn) + Gen chịu hạn, lạnh, và các diều kiện bất lợi khác của môi tr-ờng + Gen kháng thuốc diệt cỏ + Gen cải tạo các đặc tính về chất l-ợng (thay đổi thành phần axít béo, tăng c-ờng thành phần axít không no, tăng c-ờng thành phần các axít amin không thay thế, gen chín chậm, v.v) + Sn xut cỏc hp cht sinh hc nhõn to, nhiờn liu sinh hc 9/3/2011 5BM CNSHTV - KHOA CNSH quá trình biến nạp gen ở thực vật Giai đoạn 1. Giai đoạn chuyển gen (giai đoạn biến nạp). Trong giai đoạn này, gen mong muốn th-ờng đ-ợc chuyển vào tế bào hoặc mô thực vật. Giai đoạn 2. Giai đoạn tái sinh cây. Trong giai đoạn này, các mô tế bào đ-ợc chuyển gen đ-ợc chọn lọc ra và cho tái sinh để phát triển thành cây. Hai giai đoạn biến nạp và tái sinh cùng có ý nghĩa quan trọng và quyết định thành công của một thí nghiệm biến nạp. Nếu sự biến nạp xảy ra mà không có sự tái sinh kèm theo, hoặc sự tái sinh diễn ra mà không kèm theo sự biến nạp thì thí nghiệm biến nạp ch-a thành công. 9/3/2011 6BM CNSHTV - KHOA CNSH Giai đoạn Chuyển gen Các véctơ chuyển gen Các véctơ chuyển gen là các phân tử ADN có chứa đựng đoạn gen cần biến nạp. Ngoài ra chúng còn có các đoạn ADN có cấu trúc đặc thù nhằm tăng hiệu quả các các quá trình biến nạp giúp quá trình biến nạp có thể thực hiện đ-ợc. Gene mc tiờu Promoter Gene chn lc/ ch th 9/3/2011 7BM CNSHTV - KHOA CNSH Các véctơ mang gen biến nạp đ-ợc chuyển vào tế bào thực vật nh- thế nào? Các ph-ơng pháp chuyển gen đ-ợc sử dụng phổ biến gồm có: 1. Ph-ơng pháp chuyển gen gián tiếp - Thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens / A. rhizogens 2. Các ph-ơng pháp chuyển gen trực tiếp - Ph-ơng pháp dùng súng bắn gen (particle inflow gun / bommbardment) - Ph-ơng pháp chuyển gen nhờ xung điện (electroporation) - Ph-ơng pháp chuyển gen nhờ PEG (polyethylene glycol) - Ph-ơng pháp vi tiêm (microinjection) 9/3/2011 8BM CNSHTV - KHOA CNSH ph-¬ng ph¸p chuyÓn gen nhê Agrobacterium 9/3/2011 9BM CNSHTV - KHOA CNSH Agrobacterium spp là vi khuẩn đất, Gram (-) có hình rod-shaped, thƣờng gây ra một số bệnh hại cây trồng A. tumefaciens – bệnh nốt sần (crown gall disease) rose grapevine A. rhizogenes – gây hiện tƣợng rễ lông tơ (hairy root disease) Nghiên cứu ít hơn nhƣng có đặc tính sinh học rất giống A. tumefaciens Giíi thiÖu vÒ vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens vµ A. rhizogens 9/3/2011 10BM CNSHTV - KHOA CNSH [...]... biến nạp thành công 6 Tái sinh mô / tế bào đã đ-ợc biến nạp thành công thành cây biến nạp hoàn chỉnh (và đánh giá sự biểu hiện của gen biến nạp) 9/3/2011 BM CNSHTV - KHOA CNSH 24 Ph-ơng pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium Quá trình chuyển gen biến nạp vào tế bào thực vật và tái sinh cây Ti plasmid mang gen biến nạp ADN nhân Quá trình biến nạp Tế bào thực vật Gen biến nạp Tế bào mang gen biến nạp... - KHOA CNSH 23 Các b-ớc thực hiện ph-ơng pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium 1 Thiết kế véctơ mang gen biến nạp 2 Nhân (tách dòng cloning) véctơ nhờ Vi khuẩn E coli 3 Chuyển véctơ mang gen biến nạp từ vi khuẩn E coli sang Agrobacterium 4 Lây nhiễm Agrobacterium mang véctơ chứa gen biến nạp với tế bào / mô thực vật để tiến quá trình chuyển gen biến nạp sang mô / tế bào đích 5 Chọn lọc các tế bào / mô... gen T-ADN đ-ợc chuyển vào nhiễm sắc thể cây chủ theo một cơ chế đến nay ch-a biết rõ Vùng Vir Ti plasmid SSPB Vết nứt 1 T-ADN 9/3/2011 Vết nứt 2 BM CNSHTV - KHOA CNSH Chuyển vào tế bào thực vật Sự kết hợp của gen biến nạp với gen nhân thực vật 20 Cỏc h thng vector chuyn gen Cỏc gen vir cn thit cho quỏ trỡnh chuyn v t hp on T-DNAhai h thng vector c phỏt trin nhm m bo c chc nng ca cỏc gen vir 1 H thng... volfram, ) 34 Ph-ơng pháp biến nạp gen bằng xung điện Ph-ơng pháp chuyển gen nhờ xung điện th-ờng đ-ợc sử dụng cho việc chuyển gen vào các tế bào trần (protoplast) Tế bào trần là tế bào đã đ-ợc loại bỏ thành tế bào bằng việc xử lý với các enzym (xenlulaza, pectinaza) để thu đ-ợc cấu trúc tế bào chỉ còn chất nguyên sinh và màng nguyên sinh chất Ng-ời ta th-ờng sử dụng dòng điện có hiệu điện thế cao... thời các lỗ có đ-ờng kính khoảng 30 m, mà qua đó các ADN biến nạp có thể thâm nhập vào tế bào 9/3/2011 BM CNSHTV - KHOA CNSH 35 Ph-ơng pháp biến nạp gen bằng xung điện -u điểm Nh-ợc điểm 1 Hiệu quả chuyển gen cao, 1 Hệ thống tái sinh của các tế bào trần của nhiều loài còn ổn định, đặc biệt đối với gặp khó khăn các gen đơn 2 Cho đến nay, nhìn chung còn ch-a đ-ợc sử dụng thông dụng Mới đ-ợc sử dụng trong... Helios portable gene gun 9/3/2011 BM CNSHTV - KHOA CNSH 33 Ph-ơng pháp biến nạp gen bằng súng bắn gen -u điểm Nh-ợc điểm 1 Có thể áp dụng với hầu hết các loại mô, tế bào 2 Quá trình chuyển gen nhanh, đơn giản về mặt kỹ thuật 3 Có thể xử lý một l-ợng mẫu lớn trong thời gian ngắn 4 Các véctơ mang gen tái tổ hợp có cấu tạo đơn giản Không đòi hỏi cấu trúc gen kiểu T-ADN nh- tr-ờng hợp chuyển gen bằng Agrobacterium... của gen biến nạp có thể quan sát thấy trong vòng vài ngày sau biến nạp 9/3/2011 BM CNSHTV - KHOA CNSH 1 Nhiều bản sao của gen biến nạp có thể đ-ợc chuyển vào tế bào cùng lúc, gây khó khăn cho việc phân tích biểu hiện của gen, dẫn đến sự biểu hiện của các gen không bền vững 2 Hiệu quả chuyển gen thấp 3 Đòi hỏi thiết bị đắt tiền (không phải PTN nào cũng có thể đầu t-) Chi phí vật t- đắt (v.d hạt vàng,... thuật sử dụng súng bắn gen Các hạt cấu tạo từ vàng hoặc tungsten hỡnh cầu có đ-ờng kính 1-1,5 m đ-ợc bao bọc bằng các vectơ tái tổ hợp chứa DNA cần chuyển nạp (đã đ-ợc ng-ng kết tr-ớc đó với CaCl2, spermidine hoặc polyethylene glycol) Các hạt này đ-ợc đẩy đi với tốc độ cao (300 đến 600 m/s) nhờ một thiết bị đặc biệt gọi là súng bắn gen sử dụng không khí nén, hoặc helium để cung cấp lực đẩy ở các tốc... trên, các hạt sẽ xâm nhập qua thành tế bào và các màng Mật độ sử dụng của hạt không gây ra các h- hại nghiêm trọng đến tế bào 9/3/2011 BM CNSHTV - KHOA CNSH 29 Ph-ơng pháp biến nạp gen bằng súng bắn gen Dòng khí Heli Dòng khí Heli Màng nổ Màng bay Hạt mang ADN L-ới chắn Buồng chân không Mô thực vật Môi tr-ờng nuôi cấy mô TV 9/3/2011 BM CNSHTV - KHOA CNSH 30 Ph-ơng pháp biến nạp gen bằng súng bắn gen. .. bào mang gen biến nạp phân chia Cây chuyển gen 9/3/2011 BM CNSHTV - KHOA CNSH 25 K thut a lỏ 9/3/2011 BM CNSHTV - KHOA CNSH 26 ph-ơng pháp chuyển gen TRC TIP 9/3/2011 BM CNSHTV - KHOA CNSH 27 Ph-ơng pháp chuyển gen trực tiếp Kỹ thuật sử dụng súng bắn gen Kỹ thuật Xung in Kỹ thuật in di K thut chuyn gen bng vi tiờm (microinjection) Kỹ thuật siêu âm K thut chuyn gen qua ng phn (polen tuber) 9/3/2011 . CÔNG NGHỆ SINH ĐẠI CƢƠNG (SH3014) Giảng viên hướng dẫn: ……. BM CNSH TV – Khoa CNSH 9/3/2011 1 CHUYỂN GEN. thành công của một thí nghiệm biến nạp. Nếu sự biến nạp xảy ra mà không có sự tái sinh kèm theo, hoặc sự tái sinh diễn ra mà không kèm theo sự biến nạp thì thí nghiệm biến nạp ch-a thành công. 9/3/2011. phát triển của công nghệ lúc đó chƣa cho phép phát hiện lƣợng nhỏ ADN đƣợc thêm vào bộ genom khá lớn của thực vật. 9/3/2011 11BM CNSHTV - KHOA CNSH - Với sự phát triển của công nghệ ADN tái tổ