Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Đại học Thái Nguyên Đại học Sư phạm Công nghệ DNA tái tổ hợp Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Chu Hoàng Mậu Học viên thực hiện : Nguyễn Huy Hoàng Chuyên ngành : Di truyền học - K16 Thái Nguyên - 2009 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 1. Mở đầu 1.1. Công nghệ DNA tái tổ hợp là gì? Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật gen) là một bộ phận quan trọng và là công nghệ chìa khóa (key technology) của lĩnh vực công nghệ sinh học. Công nghệ DNA tái tổ hợp được ra đời trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử và hiện nay đang đóng vai trò cách mạng đối với sự phát triển của sinh học cũng như cải tạo sinh giới. Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã cho phép các nhà công nghệ sinh học phân lập và khuếch đại một gen đơn từ genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác. Các kỹ thuật này còn được gọi là tạo dòng gen do nó có thể sản xuất ra một số lượng lớn các gen xác định. Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 1. Mở đầu Sự khám phá ra các enzyme hạn chế trong những năm đầu của thập kỷ 70, thế kỷ XX là sự phát triển then chốt, không chỉ cho việc phân tích DNA hiệu quả hơn, mà còn cung cấp khả năng cắt phân tử DNA để tạo ra các đoạn DNA tái tổ hợp mới, mà ngày nay gọi là tạo dòng gen. Phương pháp tạo dòng này đã báo hiệu một kỹ năng mới trong thao tác phân tích và khai thác các phân tử nucleic acid. Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 1.2. Mục đích tạo DNA tái tổ hợp DNA tái tổ hợp được chế tác với mục đích là để thực hiện một quá trình gọi là sự tách dòng. Tách dòng là sự tách lập và thu nhận nhiều bản sao đồng nhất của một gen hay của một mảnh đoạn DNA. Tách dòng có thể được đi kèm hoặc không được đi kèm với sự biểu hiện protein. Những áp dụng này của DNA tái tổ hợp dùng để thiết lập các ngân hàng bộ gen, cDNA hoặc tổng hợp protein, enzyme, hormone, Hình 1.1. Cấu tạo phân tử DNA tái tổ hợp Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 1.3. Quy trình tạo DNA tái tổ hợp Quy trình công nghệ tạo DNA tái tổ hợp gồm 4 bước: - Tách đoạn gen. - Ghép đoạn gen với vector. - Nhân dòng phân tử trong tế bào vi khuẩn. - Sàng lọc dòng vi khuẩn mang gen mong muốn. Hình 1.2. Quy trình tạo DNA tái tổ hợp Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 1.4. Một vài công trình nghiên cứu về công nghệ DNA tái tổ hợp - Năm 1972, phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên được tạo ra tại trường Đại học Stanford ( Mỹ ) do nhà khoa học Paul Berg và các cộng sự thực hiện bằng cách sử dụng đặc tính cắt của enzym giới hạn (Restriction enzym) và khả năng nối các mạch DNA với nhau của enzym nối ligase. - Năm 1973, Staley Cohen và Boyer đã tạo ra những phân tử DNA tái tổ hợp từ các loài khác nhau, có nhiều ưu điểm và đã được biến nạp vào tế bào chủ. Và từ đây, công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời. - Hoormone sinh trưởng người (hGH-human growth hoocmon) là thành tựu đầu tiên của công nghệ DNA tái tổ hợp. Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn - Vào những năm đầu của thập kỷ 80 thế kỷ XX, người ta đã sản xuất interferol, sản xuất protein chống đông máu v.v… nhờ kỹ thuật ADN tái tổ hợp - Năm 1979, đã sản xuất và thương mại hóa hoormone insulin người bằng công nghệ DNA tái tổ hợp bằng cách chèn gen mã hóa hoormone insulin của người vào plasmid và chuyển vào vi khuẩn để sản xuất insulin người. Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 2. Công nghệ DNA tái tổ hợp và những thành tựu đã đạt được 2.1. Khái niệm DNA tái tổ hợp là một phân tử DNA nhỏ, được lắp ráp từ các đoạn DNA lấy từ thể truyền và gen cần chuyển. Năm 1973, Staley Cohen và Annie Chang đã tạo ra những phân tử DNA tái tổ hợp từ các loài khác nhau, có nhiều ưu điểm và đã được biến nạp trong tế bào chủ. Và từ đây, công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời. Hình 2.1. Quy trình tạo phân tử DNA tái tổ hợp Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 2. Công nghệ DNA tái tổ hợp và những thành tựu đã đạt được 2.2. Một số thành tựu đã đạt được: - Vaccine DNA: đây là loại nucleic acid vaccine, dựa trên nguyên lý một gen mã hóa cho protein kháng nguyên đặc hiệu được tiêm vào vật chủ (tế bào động vật hoặc vi sinh vật) để sản xuất các kháng nguyên này và khởi động một phản ứng miễn dịch. Nhiều vaccine phòng virus hiện nay (sởi, bại liệt, dại…) đều được sản xuất từ nuôi cấy tế bào động vật mà không phải là tế bào vi sinh vật. Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Phân lập một hoặc nhiều gen từ tác nhân gây bệnh (pathogen), đưa các gen này vào trong vòng DNA của plasmid và đóng lại (a). Các vòng DNA sau đó được đưa vào trong các nhóm tế bào nhỏ, thường bằng cách tiêm vào tế bào cơ (b) hoặc đẩy vào da nhờ súng bắn gen (c). Các gen được chọn lựa mã hóa cho các kháng nguyên, các chất có thể gây ra một đáp ứng miễn dịch, thường được sản xuất bởi tác nhân gây bệnh. Hình 2.2. Mô hình sản xuất DNA vaccine [...]... plasmit - Sản xuất insullin tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Phân lập gen sản xuất insulin ở người, chuyển vào tế bào vi khuẩn E.Coli thông qua plasmit Tổng hợp nhân tạo các gen mã hóa chuỗi A và B của insulin người và đưa vào E.Coli thông qua kĩ thuật tạo plasmit tái tổ hợp - Sản xuất xomatostatin bằng công nghệ plasmit tái tổ hợp Xomatostatin là loại hormon được tổng hợp ở não người và động vật với lượng cực nhỏ,... trò điều hòa hormon sinh trưởng và insulin đi vào máu và kiểm tra xự tổng hợp 2 hormon trên Gen mã hóa xomatostatin được tổng hợp invitro, sau đó gắn vào plasmit Plasmit tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào E.Coli và xomatostatin được tổng hợp Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn - Sản xuất interferon bằng công nghệ plasmit tái tổ hợp Interferon là loại prrotein đặc biệt, có vai trò bảo vệ cơ thể... E.Coli để sản xuất interferon - Ứng dụng công nghệADN tái tổ hợp trong sản xuất nông nghiệp Công nghệ AND tái tổ hợp đã tạo nên trên 40 giống cây trồng mới có năng suất cao, mang gen chống chịu sâu bệnh Thành công trong việc tách dòng gen Nif là gen tổng hợp enzyme xúc tác cho quá trình cố định nitơ phân tử, có trong plasmit của vi khuẩn nốt sần cây họ Đậu chuyển vào các cây không phải họ Đậu, tạo ra... Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 3 Kết luận Khi những thí nghiệm khởi đầu dẫn đến sự ra đời của kỹ thuật DNA tái tổ hợp được thực hiện và sự xuất hiện insulin-sản phẩm đầu tiên vào năm 1982, và thí nghiệm chuyển gen vào cây trồng năm 1982 thành công thì đến nay công nghệ DNA tái tổ hợp đã có những bước tiến khổng lồ trong các lĩnhvực nông nghiệp (cải thiện giống cây trồng ), y dược (liệu pháp... không cần đến phân đạm Tạo ra giống thuốc lá mới mang gen kháng virut TMV ( tobaco mosaic virus) Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 2.5 Tạo dòng vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp có chứa gen insulin người Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 2.6 Tạo vaccine virus H5N1, cơ chế loại độc tính ở gen HA của virus H5N1 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 2.7 Vaccine tái tổ hợp HBsAg... hiện đại, công nghệ DNA chắc chắn sẽ phát triển mạnh mẽ trong tương lai với nhiều thành tựu quan trọng mà hiện nay vẫn còn đang được nghiên cứu Tài liệu chia sẻliệu tham khảo Tài tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 1 www.ebook4u.vn 2 www.violet.vn 3 Giáo trình Công nghệ sinh học 4 Lê Đình Lương-Quyền Đình Thi, 2004 Kỹ thuật di truyền và ứng dụng, Nxb ĐHQG Hà Nội 5.Võ Thị Thương Lan, 2005 Sinh học phân tử, NXB ĐHQG... tính an toàn cao, nhất là tránh được độc tính của virus Một số vaccine DNA tái tổ hợp đã được ứng dụng rộng rãi như: viêm gan B, viêm não Nhật Bản, dịch tả, sởi, bại liệt, dại, sốt rét, lỡ mồm long móng - Vaccine thực phẩm Giá thành rẻ Ổn định Dễ dàng sản xuất trên quy mô lớn Dễ quản lý Không cần tinh sạch Bảo quản lâu Dễ vận chuyển Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 2.3 Mô hình sản xuất... truyền và ứng dụng, Nxb ĐHQG Hà Nội 5.Võ Thị Thương Lan, 2005 Sinh học phân tử, NXB ĐHQG Hà Nội 6 Phạm Thành Hổ, 2004 Di Truyền Học NXB Giáo dục, Hà Nội 7 Chu Hoàng Mậu, 2005 Cơ sở và phương pháp sinh học phân tử, NXB ĐHSP Thái Nguyên 8.Phạm Thành Hổ, 2005 Nhập môn công nghệ sinh học NXB Giáo dục, Hà Nội ... độc tính ở gen HA của virus H5N1 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 2.7 Vaccine tái tổ hợp HBsAg Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn - Sản xuất các protein tái tổ hợp + Hormone sinh trưởng người (N tabacum) + Albumin huy t thanh người (N tabacum và S tuberosum) + Nhân tố sinh trưởng biểu mô ở người (N tabacum) + α-interferon người (O sativa) + Hirudin (chống đông máu) (N tabacum) + Erythorpoetin . hormone, Hình 1.1. Cấu tạo phân tử DNA tái tổ hợp Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 1.3. Quy trình tạo DNA tái tổ hợp Quy trình công nghệ tạo DNA tái tổ hợp gồm 4 bước: - Tách. 2. Công nghệ DNA tái tổ hợp và những thành tựu đã đạt được 2.1. Khái niệm DNA tái tổ hợp là một phân tử DNA nhỏ, được lắp ráp từ các đoạn DNA lấy từ thể truyền và gen cần chuyển. . những phân tử DNA tái tổ hợp từ các loài khác nhau, có nhiều ưu điểm và đã được biến nạp trong tế bào chủ. Và từ đây, công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời. Hình 2.1. Quy trình tạo phân tử DNA tái