TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TPHCM Khoa Công Nghệ Hóa Học - Thực Phẩm  Môn: Phân tích thực phẩm ĐỀ TÀI QUANG PHỔ TỬ NGOẠI VÀ NHÌN THẤY GVHD: THS Lê Hoàng Du SV Thực hiện: Cao Nhân Nghĩa_12116056 Nguyễn Mạnh Trung_12116086 Nguyễn Trọng Nghĩa_12116057 Lê Đăng Khoa_12116037 i Mục lục ii I. MỞ ĐẦU Phân tích thực phẩm là một mảng lớn trong nghành công nghệ thực phẩm. Có rất nhiều phương pháp để xác định nồng độ của các thành phần dinh dưỡng có trong các loại thực phẩm. Trong đó, các phương pháp phân tích quang phổ được quan tâm đến như một trong những phương pháp được ứng dụng rất rộng rãi với độ chính xác tương đối cao, khi các máy chỉ thu nhận photon đến từ vật chất mà không cần thực hiện đo đạc trực tiếp trên vật. Một ví dụ trong phân tích hóa học, có thể xác định nồng độ của một chất trong một dung dịch, bằng cách tạo ra phức màu của chất cần xác định hay một chất mà có khả năng xác định gián tiếp chất cần xác định với thuốc thử hữu cơ, rồi quan sát quang phổ của hệ. Phương pháp này dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện từ của các dung dịch của chất phân tích. Ở cùng một điều kiện, độ hấp thu hay mật độ quang sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ chất hấp thụ. Điều kiện để làm thuốc thử là phức tạo thành bền, cường độ màu mạnh, cho các phức chiết tốt, đặc biệt là chiết trong môi trường acid mạnh. Trong bài báo cáo này, chúng em sẽ giới thiệu về nguyên tắc đối với việc dùng phương pháp quang phổ tử ngoại và nhìn thấy, các bộ phận cấu tạo nên một hệ thống thiết bị dùng trong phương pháp phân tích này. Sau khi đọc kĩ bài báo cáo này, chúng ta sẽ hiểu hơn về phương pháp và từ đó sẽ có những kĩ năng thực hành hiệu quả, giúp đạt được những kết quả thuận lợi trong quá trình phân tích thực phẩm. 4 II. NỘI DUNG CHƯƠNG 1: KHÁI QUÁT VỀ QUANG PHỔ 1.1. GIỚI THIỆU VỀ QUANG PHỔ Về mặt lịch sử, “quang phổ (spectroscopy)” là một nhánh của khoa học trong đó ánh sáng được phân giải thành các bước sóng thành phần của nó để tạo ra phổ quang học, là một đồ thị của một vài hàm của cường độ bức xạ với bước sóng hoặc tần số. Hiện nay, nghĩa của quang phổ được mở rộng bao gồm những nghiên cứu không chỉ với các bức xạ khả kiến mà còn với những loại khác của bức xạ điện từ như tia X, tử ngoại, hồng ngoại, vi sóng và bức xạ tần số radio. Quang phổ đóng một vai trò cốt yếu trong sự phát triển của thuyết nguyên tử hiện đại. Hơn nữa, các phương pháp đo phổ cung cấp những công cụ được sử dụng rộng rải trong việc so sánh cấu trúc của các loại phân tử cũng như phân tích định tính và định lượng của các hợp chất vô cơ và hữu cơ. Ngày nay phương pháp phổ được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu các hợp chất hóa học cũng như các quá trình phản ứng hóa học. Những phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối với việc xác định các hợp chất hữu cơ. Cơ sở của phương pháp phổ là quá trình tương tác của các bức xạ điện từ đối với các phân tử vậ chất. Khi tương tác với các bức xạ điện từ, các phân tử có cấu trúc khác nhau sẽ hấp thụ và phát xạ năng lượng khác nhau. Kết quả của sự hấp thụ và phát xạ năng lượng này chính là phổ, từ phổ chúng ta có thể xác định ngược lại cấu trúc phân tử Có 5 phương pháp phổ: - Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử: + Phương pháp phổ quay và dao động: phương pháp quang phổ hồng ngoại + Phương pháp phổ Raman + Phương pháp electron UV-VIS. - Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR - Phương pháp phổ khối lượng Mỗi phương pháp phổ có một ứng dụng riêng. Thông thường, chúng ta kết hợp các phương pháp với nhau để giải thích cấu tạo của một hợp chất hữu cơ. 1.2. Tính chất chung của bức xạ điện từ Bức xạ điện từ là một dạng năng lượng mà dễ thấy nhất là ánh sáng khả kiến và bức xạ nhiêt. Những loại khác gồm tia gamma, tia X, tia tử ngoại, vi sóng và sóng 5 radio. Nhiều tính chất của bức xạ điện từ được mô tả một cách thuận tiện bởi kiểu sóng hình sin cổ điển sử dụng nhiều thông số như bước sóng, tần số, vận tốc và biên độ. Khác với nhiều hiện tượng sóng khác như âm thanh, bức xạ điện từ không đòi hỏi môi trường hỗ trợ cho sự lan truyền của nó và nhờ vậy nó có thể đi qua một môi trường chân không. Mô hình sóng thất bại trong việc giải thích những hiện tượng gắn liền với sự hấp thụ và bức xạ của năng lượng bức xạ. Để hiểu những quá trình này cần thiết phải nhờ đến một mô hình kiểu hạt trong đó bức xạ điện từ được xem như là một dòng hạt rời rạc gọi là photon, với năng lượng của một photon tỉ lệ với tần số của bức xạ. Quan niệm về lưỡng tính sóng hạt này của ánh sáng không loại trừ lẫn nhau mà có tính chất bổ sung cho nhau. Thực vậy, lưỡng tính này được thấy trong những dòng electron và những hạt cơ bản khác như proton và được hoàn toàn lý giải bởi cơ học sóng. 1.3. Phổ bức xạ điện từ Quang phổ của bức xạ điện từ bao gồm một dải rất lớn các bước sóng (và là năng lượng). Trong đó phần của bức xạ khả kiến mà mắt người có thể thấy được là rất nhỏ khi so với những vùng phổ khác. Cũng cần phải chú ý là các phương pháp quang phổ sử dụng không chỉ ở vùng khả kiến mà còn tử ngoại, hồng ngoại và thường được gọi là phương pháp đo quang mặc dù mắt người không nhạy với hai loại sau. Bảng liệt kê các dải bước sóng và tần số của những vùng phổ quan trọng trong mục đích phân tích và cũng kèm theo tên của những phương pháp phổ liên quan. Các cột cuối cùng liệt kê các loại chuyển dịch lượng tử của hạt nhân, nguyên tử và phân tử, là cơ sở cho các kỹ thuật quang phổ khác nhau Bảng 1.1: Một số thống kê về các loại quang phổ Loại quang phổ Dải bước sóng Dải số sóng(cm -1 ) Kiểu dịch chuyển lượng tử Phát xạ tia gamma 0.005 – 1,4 A 0 Hạt nhân Nhiểu xạ, huỳnh quang, phát xạ, hấp thu tia X 0.1-100 A 0 Electron bên trong Hấp thu tử ngoại chân không 10-180 nm 1 x 10 6 đến 5 x 10 4 Các electron liên kết Hấp thu, phát xạ và huỳnh quang tử ngoại khả kiến 180-780 nm 5 x 10 4 đến 1.3 x 10 4 Các electron liên kết 6 Hấp thu hồng ngoại 0.78-300 µm 1.3x10 4 đến 3,3x10 1 13-27 Dao động điều hòa/quay của phân tử Hấp thu vi song 0.75-3.75 mm 13-27 Dao động quay phân tử Cộng hưởng từ spin 3 cm 0.33 Spin của electron trong từ trường Cộng hưởng từ nhân 0.6-10 m 1.7x10 -2 đến 1x 10 3 Spin của hạt nhân trong từ trường 1.4. Sự tương tác giữa vật chất và bức xạ điện từ Hình 1.1: Bước sóng của sóng ánh sáng - Các bức xạ điện từ cũng mang năng lượng, các bức xạ có chiều dài bước sóng càng nhỏ thì năng lượng của chúng càng lớn và tuân theo định luật: E = h.ν = Trong đó: h là hằng số planck. h = 6,6262.10 -34 J.s Năng lượng E được đo bằng đơn vị eV, kcal/mol, cal/mol. Khi các bức xạ điện từ tương tác với các phân tử vật chất, có thể xảy ra theo hai khả năng: trạng thái năng lượng của phân tử thay đổi hoặc không thay đổi. Khi có sự thay đổi năng lượng thì phân tử có thể hấp thụ hoặc bức xạ năng lượng. Nếu gọi trạng thái năng lượng ban đầu của phân tử là E1, sau khi tương tác là E2 thì có thể viết: ΔE = E 2 – E 1 ΔE = 0 : năng lượng phân tử không thay đổi khi tương tác với bức xạ điện từ. ΔE > 0 : phân tử hấp thụ năng lượng; ΔE < 0 : phân tử bức xạ năng lượng 7 Theo thuyết lượng tử thì các phân tử và bức xạ điện từ trao đổi năng lượng với nhau không phải bất kỳ và liên tục mà có tính chất gián đoạn. Phân tử chỉ hấp thụ hoặc bức xạ 0,1, 2, 3…n lần lượng tử h.ν . Khi phân tử hấp thụ hoặc bức xạ sẽ làm thay đổi cường độ của bức xạ điện từ nhưng không làm thay đổi năng lượng của bức xạ điện từ, bởi vì cường độ bức xạ điện từ xác định bằng mật độ các hạt photon có trong chùm tia còn năng lượng của bức xạ điện từ lại phụ thuộc vào tần số ν của bức xạ. Vì vậy, khi chiếu một chùm bức xạ điện từ với một tần số duy nhất đi qua môi trường vật chất thì sau khi đi qua năng lượng của bức xạ không hề thay đổi mà chỉ có cường độ của bức xạ thay đổi. Khi các phân tử hấp thụ năng lượng từ bên ngoài có thể dẫn đến các quá trình thay đổi trong phân tử (quay, dao động, kích thích electron phân tử…) hoặc trong nguyên tử (cộng hưởng spin electron, cộng hưởng từ hạt nhân). Hình 1.2: Các trạng thái kích thích của phân tử Mỗi một quá trình như vậy đều đòi hỏi một năng lượng ΔE > 0 nhất định đặc trưng cho nó, nghĩa là đòi hỏi bức xạ điện từ có một tần số riêng gọi là tần số quay ν q , tần số dao động ν d và tần số kích thích điện từ ν đ . Vì thế khi chiếu một chùm bức xạ điện từ với các tần số khác nhau vào thì các phân tử chỉ hấp thụ được các bức xạ điện từ có tần số đúng bằng các tần số trên (ν q , ν d và ν đ ) để xảy ra các quá trình biến đổi trong phân tử như trên. Do sự hấp thụ chọn lọc này mà khi chiếu chùm bức xạ điện từ với một dải tần số khác nhau đi qua môi trường vật chất thì sau khi đi qua, chùm bức xạ này sẽ bị mất đi một số bức xạ có tần số xác định nghĩa là các tia này đã bị phân tử hấp thụ. 1.5. Định luật Lambert – Beer Khi chiếu một chùng tia sáng đơn sắc đi qua một môi trường vật chất thì cường độ của tia sáng ban đầu I 0 sẽ bị giảm đi chỉ còn là I. 8 Năng lượng ánh sáng: E = h.ν = h.c/λ Năng lượng của ánh sáng phụ thuộc vào ν. Cường độ ánh sáng I phụ thuộc vào biên độ dao động a Hình 1.3: sự giảm cường độ của ánh sáng khi đi qua một môi trường vật chất Với hai tia sáng có cùng năng lượng nhưng có cường độ ánh sáng khác nhau T = I/I 0 .100%: độ truyền qua A = (I 0 – I)/I 0 .100%: độ hấp thụ Độ lớn của độ truyền qua T hay độ hấp thụ A phụ thuộc vào bản chất của chất hòa tan, chiều dày d của lớp mỏng và nồng độ C của dung dịch. Do đó, có thể viết: Log(I 0 /I) λ = ε λ .C.d = D λ ε λ = D λ /C.d; lgε λ = lgD λ /C.d ε được gọi là hệ số hấp thụ, C được tính bằng mol/l, d tính bằng cm và D là mật độ quang. Phương trình trên chỉ đúng với tia đơn sắc. 1.6. Phổ - Khi cho bức xạ điện từ tương tác với phân tử vật chất, dùng thiết bị máy phổ để ghi nhận sự tương tác đó, ta nhận được một dạng đồ thị gọi là phổ. - Từ định luật Lambert-Beer, người ta thiết lập và biểu diễn sự phụ thuộc: + Trên trục tung: A, D, ε, lgε, T + Trên trục hoành: tần số bức xạ ν, số sóng ν, bước sóng bức xạ kích thích λ Thu được đồ thị có dạng D λ = f(λ), lgε = f(λ), T = f(ν), A = f(ν)… đồ thị này gọi là phổ. Các đỉnh hấp phụ cực đại gọi là dải (band) hay đỉnh hấp thụ (peak), chiều cao của đỉnh peak gọi là cường độ hấp thụ. Riêng với phổ NMR và phổ MS thì đại lượng trên trục hoành được mở rộng hơn thành độ chuyển dịch hóa học (ppm) hay số khối m/e. 1.7. Tóm lại 9 Phân tích Phổ, một nhánh của quang phổ, bao gồm một loạt các kỹ thuật được sử dụng trong các phòng thí nghiệm phân tích để phân tích định tính và định lượng các thành phần hóa học của thực phẩm. Phương pháp phân tích Phổ thông thường bao gồm UV, Vis, và IR hấp thụ quang phổ; phân tử quang phổ huỳnh quang; và NMR. Trong mỗi phương pháp , người phân tích cố gắng để đo lượng bức xạ hoặc hấp thụ hoặc phát ra bởi các chất phân tích. Các phương pháp trên khác nhau ở các bước sóng bức xạ được sử dụng trong phân tích, bản chất nguyên tử so với phân tử của chất phân tích. CHƯƠNG 2: QUANG PHỔ TỬ NGOẠI VÀ NHÌN THẤY 2.1 Giới thiệu Phương pháp phân tích quang phổ trong miền tia tử ngoại và ánh sáng nhìn thấy (UV – VIS ) là một trong những phương pháp phân tích phổ biến nhất trong lĩnh vực phân tích thực phẩm . Ứng dụng trong những trường hợp như : • phân tích định lượng những chất phân tứ lượng lớn ( vd : định lượng tổng hàm lượng tinh bột bằng phương pháp phenol-sulfuric acid ) . 10 • phân tích định lượng những chất phân tứ lượng nhỏ ( vd : định lượng thiamin bằng phương pháp thiochrome huỳnh quang ) . • Đánh giá độ ôi hóa của dầu mỡ . • phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu phân tích . Trong những trường hợp trên , dấu hiệu phân tích được dựa trên sự hấp thụ hoặc phát xạ của bức xạ điện từ UV – VIS . Dấu hiệu này phụ thuộc vào bản chất vốn có của chất phân tích ( độ hấp thụ của bức xạ điện từ trong vùng ánh sáng nhìn thấy ) hoặc kết quả của phản ứng hóa học liên quan đến chất phân tích ( phương pháp so màu Lowry nhằm phân tích protein tan trong nước ) . Bức xạ điện từ trong khoảng tia tử ngoại và ánh sáng nhìn thấy có bước sóng dao động từ 200-700 nm , tia tử ngoại : từ 200-350 nm và ánh sáng nhìn thấy : 350- 700 nm ( bảng 2.1 ) . Không thể quan sát tia tử ngoại UV bằng mắt thường , trong khi mỗi bước sóng của ánh sáng nhìn thấy cho ta 1 màu quan sát khác nhau , đó là 1 dãy màu liên tục gồm 7 màu cơ bản ( đỏ , cam , vàng , lục , lam , chàm , tím ) . Ánh sáng đỏ có bước sóng lớn nhất , ánh sáng tím có bước sóng nhỏ nhất . Phân tích quang phổ trong UV – VIS được chia thành 2 nhóm chính : quang phổ hấp thụ và quang phổ huỳnh quang , nhờ vào mối quan hệ giữa bức xạ điện từ và vấn đề t đang phân tích . Mỗi nhóm nhỏ trong 2 nhóm trên lại được chia thành 2 nhóm nhỏ nữa : kỹ thuật định tính và kỹ thuật định lượng . Bảng 2.1 : bước sóng của 1 số màu cơ bản Nói chung , phương pháp quang phổ hấp thụ định lượng là phương pháp phổ biến nhất trong phân tích quang phổ trong vùng tia tử ngoại và ánh sáng nhìn thấy . [...]... thụ phân tử ( (cm)-1(M)-1 ) Tóm lại Quang phổ UV-VIS hấp thụ và huỳnh quang là những kỹ thuật được sử dụng rất rộng rãi trong phân tích thực phẩm nhằm mục đích chính là định tính - định lượng Kỹ thuật định tính dựa trên sự khác biệt về năng lượng giữa các chất phân tích , dẫn đến tính chất hấp thụ hoặc phát xạ của chúng Do đó , kỹ thuật phân tích định tính được dựa vào việc phân tích tính chất phổ. .. cần phân tích và nửa còn lại sẽ đi qua mẫu trắng Hình 2-10 mô tả một hệ thống quang học chùm đôi trong đó chùm bức xạ được chia đôi trước khi đến mẫu cần phân tích và mẫu trắng Ở thiết kế này , chùm bức xạ được chia ra và truyền qua mẫu cần phân tích và mẫu trắng nhờ một bộ phận gương xoay Thiết kế chùm đôi cho phép các nhà phân tích đo lường và so sánh độ hấp thụ tương đối của mẫu cần phân tích và. ..11 2.2 Quang phổ hấp thụ trong vùng tia tử ngoại và ánh sáng nhìn thấy 2.2.1 Cơ sở của phương pháp định lượng quang phổ hấp thụ Mục đích của phương pháp trên nhằm xác định nồng độ của mẫu phân tích dựa trên sự hấp thụ ánh sáng khi truyền qua 1 dung dịch mẫu Trong 1 vài trường hợp , mẫu phân tích sẽ tự động hấp thụ bức xạ UV-VIS , như vậy , bản chất hóa học của chất phân tích không bị thay... dùng đến đường cong chuẩn để phân tích định lượng Trong phân tích thực phẩm, có một số lượng thí nghiệm thực nghiệm mà dùng đến đường chuẩn là cần thiết Các đường cong chuẩn này được sử dụng để thiết lập các mối quan hệ giữa nồng độ chất cần phân tích với độ hấp thụ Các mối quan hệ này được thiết lập thông qua thực nghiệm phân tích một loạt các mẫu có nồng độ chất phân tích đã được xác định Các giải... phân tích Nồng độ thực tế mà định luật Beer sai lệch sẽ phụ thuộc vào bản chất hóa học của chất phân tích Khi nồng độ chất phân tích tăng , khoảng cách giữa các phân tử trong một dung dịch mẫu nhất định sẽ giảm , cuối cùng , khi đạt đến một giá trị mà tại đó , các phân tử cạnh nhau sẽ sắp xếp lại trật tự của nhau Việc xáo trộn này có thể ảnh hưởng đáng kể khả năng thu nhận photon của chất phân tích. .. hợp này , chất phân tích không hấp thụ bức xạ ở một vùng quang phổ sẽ được biến đổi , tạo nên 1 mẫu mới với tính chất hấp thụ thích hợp với vùng quang phổ được chọn Những phản ứng như vậy được dùng trong rất nhiều phép 15 phân tích so màu dựa trên sự hấp thụ của bức xạ trong vùng nhìn thấy Mẫu trắng cho những phép phân tích này được chuẩn bị bằng cách xử lý dung môi giống với mẫu phân tích Mẫu trắng... các bình thêm một thể tích xác định của chất phân tích (V u) mà là chất bạn đang cố gắng để xác định nồng độ chất phân tích (C u) Tiếp theo, thêm vào bình một lượng thể tích (Vs) của chất là giải pháp phân tích với nồng độ C s, như vậy mỗi bình chứa một lượng thể tích tiêu chuẩn nhất định giống nhau Các loạt kết quả của các bình sẽ chứa khối lượng khác nhau của chất cần phân tích và khác nhau về khối... chất phân tích có thể không được phát hiện 2.2.6 Thiết bị đo đạc Có rất nhiều thành phần của việc đo quang phổ tử ngoại trong máy đo quang phổ UV- Vis Một số thiết bị được thiết kế hoạt động trong phạm vi của ánh sáng nhìn thấy, trong khi những cái khác thì bao gồm cả phạm vi của tia UV và Vis Các thiết bị có thể khác nhau về chi tiết thiết kế, chất lượng các thành phần và tính đa dạng Một máy đo quang. .. mẫu phân tích nhưng không chứa chất phân tích Mẫu trắng thường là một cuvette có chứa nước cất Mẫu này sau đó được đặt ngang đường truyền của chùm sáng ; năng lượng của bức xạ ra khỏi mẫu trắng được đo lại và là giá trị P 0 cho mẫu phân tích Phương pháp này giả định rằng ngoại trừ sự hấp thụ có chọn lọc các bức xạ bởi mẫu phân tích , tất cả các quá trình khác là tương đương cho mẫu phân tích và mẫu... lưu trữ và sau đó xử lý bằng máy vi tính 26 Hình 2-10: Sự sắp xếp các bộ phận của thiết bị đo quang phổ chùm đôi UV-Vis Các tia bức xạ tới lần lượt đi qua mẫu phân tích và mẫu trắng bằng một bộ phận gương xoay Sơ đồ hình 2-11 là một ví dụ đơn giản về máy quang phổ chùm đơn đo bức xạ nhìn thấy Ánh sáng trắng phát ra từ nguồn đi qua bộ phận đơn sắc (monochromator) ; sau đó bị phân tán vào phổ của một . PHẠM KỸ THUẬT TPHCM Khoa Công Nghệ Hóa Học - Thực Phẩm  Môn: Phân tích thực phẩm ĐỀ TÀI QUANG PHỔ TỬ NGOẠI VÀ NHÌN THẤY GVHD: THS Lê Hoàng Du SV Thực hiện: Cao Nhân Nghĩa_12116056 Nguyễn. chất phân tích. Các phương pháp trên khác nhau ở các bước sóng bức xạ được sử dụng trong phân tích, bản chất nguyên tử so với phân tử của chất phân tích. CHƯƠNG 2: QUANG PHỔ TỬ NGOẠI VÀ NHÌN THẤY 2.1. Phương pháp phân tích quang phổ trong miền tia tử ngoại và ánh sáng nhìn thấy (UV – VIS ) là một trong những phương pháp phân tích phổ biến nhất trong lĩnh vực phân tích thực phẩm . Ứng dụng