Luận văn thạc sĩ LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới người hướng dẫn khoa học tận tâm của em – TS. Hoàng Thị Kim Dung – Phó Viện trưởng Viện Công nghệ Hóa học − Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam. Cô đã hướng dẫn rất nhiệt tình, động viên tinh thần trong những thời khắc khó khăn, là một tấm gương trong công việc cũng như đời thường. Xin thể hiện sự biết ơn đến tất cả quý Thầy Cô khoa Hóa − Trường Đại học Cần Thơ, quý Thầy Cô Viện Công nghệ Hóa học − Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, vì đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báo trong suốt thời gian học tập. Vì sự hỗ trợ nhiệt tình và tạo điều kiện tốt nhất trong việc hoàn thành luận văn, em cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Trần Ngọc Quyển, Th.s. Trịnh Thị Thanh Huyền, KS. Lý Tú Uyên, KS. Nguyễn Hoàng cùng các anh chị Phòng Hoá Hữu Cơ & Polymer − Viện Công nghệ Hóa học − Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam. Ngoài ra, em không thể thể hiện sự biết ơn của em đến những người anh, người chị, người bạn khóa 16 và 17 lớp cao học hóa Hữu cơ – Đại học Cần Thơ đã giúp đỡ em trong suốt quá trình học vừa qua. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các quý Thầy Cô trong hội đồng bảo vệ đã đọc và đưa ra những nhận xét quý báu giúp em hoàn chỉnh cuốn luận văn này. Cuối cùng, sẽ là thiếu sót to lớn nếu không nhắc đến gia đình em. Đặc biệt là ba mẹ - người đã luôn theo sát, hỗ trợ em từng phút từng giây trong suốt thời gian qua và cả sau này! Tp.Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2012 Huỳnh Thị Kim Chi Huỳnh Thị Kim Chi 1 Luận văn thạc sĩ TÓM TẮT Diosmin là một loại flavone tự nhiên có tác dụng làm bền thành mạch máu, chữa suy tĩnh mạch, bệnh trĩ, tiểu đường, ung thư. Trong nghiên cứu này, diosmin được bán tổng hợp từ hesperidin – là một loại flavanone phổ biến trong họ citrus – bằng tác nhân iodine, sodium hydroxide trong dung môi pyridine cho hiệu suất cao (76%). Diosmin được đem đi thủy phân trong môi trường acid sulfuric/acid acetic/nước tạo thành aglycone của nó là diosmetin (H=87%), từ diosmetin đã tổng hợp được 3 dẫn xuất: 3 ′ ,5,7−triacetoxy−4 ′ −methoxyflavone (DTA), 3 ′ ,4 ′ ,5,7−tetramethoxyflavone (DTM), 3 ′ ,5,7−triallyloxy−4 ′ −methoxyflavone (DTAl). Các phổ IR, HRMS, HPLC, 1 H−NMR, 13 C−NMR được dùng để xác định cấu trúc của sản phẩm, khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp đo độ hấp thu DPPH (1,1 − diphenyl − 2 − picryl − hydrazyl) và gây độc tế bào theo phương pháp SRB (Sulforhodamin B) trên các dòng tế bào ung thư như MCF-7, NCI-H460 và Hep G2. Kết quả khảo sát cho thấy khả năng kháng oxy hóa của diosmetin là mạnh nhất (SC 50 =291µg/mL) , các mẫu diosmin, DTA, DTM và DTAl đều có hoạt tính thấp. Khả năng gây độc tế bào của DTA trên hai dòng MCF-7 và Hep G2 là mạnh nhất (IC 50 lần lượt là 85.34 và 73.89 µg/mL), các mẫu khác đều có hoạt tính yếu. ABSTRACT Diosmin is a natural flavone having durable effect on blood vessels, varicose veins, hemorrhoids, diabetes, and cancer. In this study, diosmin was semi synthesized from hesperidin - a popular flavanone in the citrus family - with iodine and sodium hydroxide agents in pyridine solvent for high efficiency, yield: 76%. Diosmin was hydrolysed in H 2 SO 4 /CH 3 COOH/H 2 O mixture forming its aglycone that was diosmetin (H=87%). Three diosmetin derivatives were semi synthesized, including 3 ′ ,5,7−triacetoxy−4 ′ −methoxyflavone (DTA), 3 ′ ,4 ′ ,5,7−tetramethoxyflavone (DTM), 3 ′ ,5,7−triallyloxy−4 ′ −methoxyflavone (DTAl). The IR, HRMS, HPLC, 1 H-NMR, 13 C- NMR spectra were used to determine the structures. The antioxidant activity was measured by the absorption of DPPH (1,1−diphenyl−2−picryl−hydrazyl) and the SRB (Sulforhodamin B) method was used to estimate antiproliferation activity on the cancer cell lines: MCF-7, NCI-H460, Hep G2. The results showed that antioxidant Huỳnh Thị Kim Chi 2 Luận văn thạc sĩ capacity of diosmetin was the best. The antiproliferation ability of DTA was the most powerful on two lines MCF-7 and Hep G2. Huỳnh Thị Kim Chi 3 Luận văn thạc sĩ MỞ ĐẦU Từ xưa, con người đã biết sử dụng các dược thảo để chữa bệnh rất hiệu quả. Cho đến nay, các nhà khoa học đã xác định được phần lớn cấu trúc hóa học của các hợp chất có trong cây cỏ có hoạt tính sinh dược học, giải thích được cơ chế chữa bệnh trong dân gian của các hợp chất. Từ đó, có thể làm giàu và tăng tác dụng sinh dược của chúng. Không chỉ dừng lại ở việc nghiên cứu các hợp chất có cấu trúc từ cây cỏ, con người còn nghiên cứu tổng hợp ra các dẫn xuất có hoạt tính sinh dược học mạnh hơn, góp phần vào lĩnh vực chăm sóc sức khỏe con người ngày một nâng cao. Trên cơ sở hesperidin, một loại flavonoid có trong nhiều cây thuộc họ cam quýt, chiếm hàm lượng 2–3% trong vỏ quýt, một loại cây có sẵn và trồng nhiều ở Việt Nam, chúng tôi bán tổng hợp diosmin. Diosmin đã được sử dụng trong hơn 30 năm như là một tác nhân bảo vệ thành mạch, và gần đây đã bắt đầu được nghiên cứu cho các mục đích trị liệu khác bao gồm cả ung thư, hội chứng tiền kinh nguyệt, viêm đại tràng và bệnh tiểu đường(63). Tuy nhiên, giá thành các biệt dược chứa diosmin còn cao, phải nhập khẩu từ nước ngoài, ngăn cản người dân sử dụng rộng rãi để phòng ngừa và chữa trị các bệnh suy tĩnh mạch – tiêu biểu là bệnh trĩ. Bước đầu chúng tôi thủy phân ra diosmetin để tiến hành tổng hợp một vài dẫn xuất của diosmin sau này, xét nghiệm tính kháng oxy hóa, gây độc trên tế bào của các hợp chất tìm được. Từ đó làm nền tảng để thực hiện những bước tổng hợp các dẫn xuất khác tiếp theo trong những nghiên cứu sâu hơn. Chính vì những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu bán tổng hợp và xác định hoạt tính kháng oxy hóa của diosmin và dẫn xuất”. Huỳnh Thị Kim Chi 4 Luận văn thạc sĩ CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Huỳnh Thị Kim Chi 5 Luận văn thạc sĩ 1.1 Flavonoid 1.1.1 Phân bố Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Hơn một nửa rau quả thường dùng có chứa flavonoid. Cho đến nay đã có khoảng 4000 chất đã được xác định cấu trúc. Chỉ riêng 2 nhóm flavone và flavonol với nhóm thế là OH hoặc OCH 3 thì theo lý thuyết có thể gặp 38627 chất. Phần lớn các chất flavonoid có màu vàng. Tuy nhiên, một số có màu xanh, tím, đỏ, một số khác không có màu. Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon. 1.1.2 Cấu trúc hóa học Flavonoid là những chất màu thực vật, có cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenyl propane nghĩa là 2 vòng benzene A và B nối với nhau qua một dây có 3 carbon, hay nói cách khác là cấu tạo khung kiểu C6 – C3 –C6. Cấu trúc là một vòng kín hoặc hở. Cách đánh số tuỳ theo dây C 3 đóng hay hở, nếu dây C 3 đóng thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1 rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng B đánh số phụ. Nếu dây C 3 hở thì đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A. [2,3,4] OH 1' 6 5 4 3 2 O B A α β 2' 3' 4' 5' 6' 7 6 5 8 4 3 2 O 1 O 2' 3' 4' 5' A B 1 1' 6' Mạch hở Mạch kín Thường flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B. Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng tự do hoặc dạng glycoside. Các đường thường gặp nhất là đường D- glucose, kế đó là D- galactose, L- rhamnose, L-arabinose, D-apipse và acid uronic.[4] Trong đa số trường hợp thì mạch 3 carbon đóng vòng với vòng A và tạo nên dị vòng C có chứa oxy. Dị vòng C có thể là dihyroxypyrane, γ- pyrone, dihyro γ- pyrone. Huỳnh Thị Kim Chi 6 Luận văn thạc sĩ O O O O O Dihydropyran -pyroneDihydro γ -pyroneγ Tại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hydroxy tự do hoặc đã thay thế một phần. vì vậy về bản chất chúng là các polyphenol có tính acid.[3,4] Các polyphenol có thể phản ứng lẫn nhau qua các nhóm hydroxyl để tạo thành các phân tử phức tạp hơn hoặc có thể liên kết với các hợp chất khác trong cây như các oza (dạng glycoside), hoặc protein.[5] 1.1.3 Phân loại flavonoid Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hóa của mạch 3 carbon. Gồm có: flavone, flavanone, flavonol, dihydroflavonone, chalcone. dihydrochalcone, aurone, anthoxyanidin (2−phenylbenzo pyrilium), leucoanthoxyanidin, isoflavone, rotenoid, neoflavonoid, biflavonoid. 1.1.4 Vai trò của flavonoid a) Vai trò đối với các phản ứng sinh hoá [6, 7] Các nhóm phenol có vai trò trong sự hoà tan các chất vì di chuyển dễ dàng qua các màng sinh học, một số có tác dụng như chất kháng oxy hoá, bảo vệ như acid ascorbic, một số có tác dụng ức chế enzyme và các chất độc của cây. 2. Vai trò ức chế và kích thích sinh trưởng [8,9,10] Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy nhóm chức hydroxyl có vai trò quyết định về tính kích thích cũng như ức chế khả năng sinh trưởng. Ví dụ: trong ổi flavonoid có nhóm hydroxyl ở 4’ làm tăng hoạt tính sinh trưởng, còn flavonoid có nhóm hydroxyl ở cả 3’ và 4’ thì lại có tính ức chế. 3. Vai trò tạo màu [11,12,13] Flavonoid có khả năng tạo màu cho thực vật để trông hấp dẫn hơn. Các flavone, flavonol, aurone, chalcone thì có màu vàng. Còn các anthocyanin thì có thể có màu hồng, đỏ, tím, xanh. Huỳnh Thị Kim Chi 7 Luận văn thạc sĩ 4. Vai trò bảo vệ cây [14] Một số flavonoid không màu trong lá có khả năng bảo vệ cây, ngăn động vật ăn cỏ bằng vị đắng và khó chịu. 5. Vai trò y học [15,16,17,18] Gốc tự do trong cơ thể là các hợp chất có hoạt tính cao được tạo ra bằng quá trình trao đổi chất hoặc đưa từ ngoài vào. Các gốc tự do có năng lượng lớn nên có xu hướng phản ứng làm giảm năng lượng, khi phản ứng với các hợp chất trong cơ thể làm thay đổi các hợp chất trong cơ thể. Các dẫn xuất flavonoid có tác dụng dập tắt các gốc tự do như OH ● , ROO ● gây ra các bệnh như ung thư, lão hoá…. Flavonoid tạo phức với các ion kim loại mà những kim loại này là xúc tác cho các phản ứng oxy hoá. Thành phần màng tế bào có các lipid dễ bị peroxide hoá sinh ra sản phẩm làm rối loạn trao đổi chất và huỷ hoại tế bào. Flavonoid cùng với các acid ascorbic tham gia quá trình hoạt động của enzyme oxy hoá- khử. Flavonoid còn ức chế tác động của hyaluronidase (enzyme này làm tăng tính thấm của mao mạch). Khi hyaluronidase thừa sẽ gây hiện tượng xuất huyết dưới da hay còn gọi thiếu vitamin P. Thí nghiệm cho thấy flavonoid có nhóm OH ở 3 , 4 thìꞌ ꞌ nâng cao tính bền vững thành mạch. 6. Vai trò kháng ox y hoá [19,20] Flavonoid có đặc tính sinh học mạnh: kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng viêm…Trong các nghiên cứu in vitro, hoạt tính của flavonoid được khảo sát bằng cách cho phản ứng với các chất tương ứng, thường là các gốc tự do như ABTS, DPPH, AAPH, O ● , ● OOH, ● OH….trong các môi trường khác nhau. Tác dụng kháng oxy hoá của flavonoid là ngăn sự hình thành gốc tự do, làm sạch gốc tự do và điều chỉnh khả năng kháng oxy hoá của cơ thể. Flavonoid ngăn cản các enzyme tạo thành gốc tự do phản ứng. Trong môi trường có ion kim loại đồng, sắt có thể phản ứng oxy hoá khử với H 2 O 2 và protein tạo thành gốc tự do, flavonoid sẽ tạo phức với ion kim loại ở nhóm catechol của vòng B, vị trí 3,4 của vòng C, vị trí 4,5 của vòng A. Huỳnh Thị Kim Chi 8 Luận văn thạc sĩ 1.2 Diosmin 1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới a) Các nghiên cứu ở Việt Nam Năm 2011, Nguyễn Thị Mỹ Duyên (58) đã nghiên cứu quy trình bán tổng hợp diosmin từ hesperidn dựa theo nghiên cứu của Lorette et al(30) và sử dụng tác nhân phản ứng oxone ® /sodium bromide. Quy trình bán tổng hợp của Lorette được tiếp tục khảo sát điều kiện tối ưu, hiệu suất toàn phần là 45.8% 7. Các nghiên cứu trên thế giới Hiện nay, trên thế giới có nhiều nghiên cứu về kĩ thuật chuyển đổi hesperidin thành diosmin bằng các tác nhân phản ứng khác nhau như tác nhân NBS kết hợp benzoyl peroxide, tác nhân selen dioxide, tác nhân iodine, tác nhân bromo lỏng, tác nhân postassium iodide… o Qua trung gian hesperidin octaacetate và tác nhân NBS(30) Hesperidin được acetate hóa bằng tác nhân natri acetate trong dung môi anhydride acetic. Sản phẩm acetate được đem phản ứng với NBS và benzoyl peroxide trong dung môi chloroform. Sản phẩm sau phản ứng được xử lý với ethanol, NaOH và H 2 SO 4 . O OH O O OH OCH 3 O OH HO O HO O OH HO HO H 3 C O OCCH 3 O O OCCH 3 OCH 3 O OCCH 3 H 3 CCO O H 3 CCO O OCCH 3 H 3 CCO H 3 CCO H 3 C O O O O O O O O CH 3 COONa (CH 3 CO) 2 O O OH O O OH OCH 3 O OH HO O HO O OH HO HO H 3 C NBS CHCl 3 O O O O o Qua trung gian hesperidin octaacetate và tác nhân selen dioxide(31) Huỳnh Thị Kim Chi 9 Luận văn thạc sĩ Octaacetate hesperidin được đem phản ứng với SeO 2 trong dung môi isoamyl alcohol. Hỗn hợp sau phản ứng được lọc nóng để loại Se, sau đó hỗn hợp được xử lý với NaOH, HCl và ethyl acetate. O OH O O OH OCH 3 O OH HO O HO O OH HO HO H 3 C O OCCH 3 O O OCCH 3 OCH 3 O OCCH 3 H 3 CCO O H 3 CCO O OCCH 3 H 3 CCO H 3 CCO H 3 C O O O O O O O O CH 3 COONa (CH 3 CO) 2 O O OH O O OH OCH 3 O OH HO O HO O OH HO HO H 3 C SeO 2 isoamyl alcohol o Bằng tác nhân iodine(29) Hesperidin được đem phản ứng với iodine trong dung môi pyridine trong 9 – 10 giờ. Hỗn hợp sau phản ứng được đem xử lý lần lượt với alcohol, natri thiosulfate và NaOH. Diosmin thô được kết tinh trong dung dịch DMF. O OH O O OH OCH 3 O OH HO O HO O OH HO HO H 3 C O OH O O OH OCH 3 O OH HO O HO O OH HO HO H 3 C Pyridine I 2 o Quy trình bán tổng hợp diosmin của Zemplen và Bogner 59 Zemplen và Bogner đã mono bromo hóa acetyl flavanone bằng dung dịch bromo lỏng trong chloroform với sự có mặt tia cực tím để có được dẫn xuất flavone. Huỳnh Thị Kim Chi 10 [...]... deoxygenation o Các acid và ester của diosmetin[24] Tác giả đã tổng hợp dẫn xuất 7-carboxymethoxy-5-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxy-2-propylphenyl)-4H-1-be nzo-pyran-4-one Nghiên cứu dược tính cho thấy các hợp chất acid và ester của diosmetin có thể được sử dụng như thuốc chữa bệnh trong điều trị suy tĩnh mạch mãn tính và các rối loạn khác liên quan đến sự tăng tính thẩm thấu và chứng viêm Huỳnh Thị... (như Fe 3+, Cu2+, Ni2+, Mn2+), các ion này thường khơi mào cho phản ứng oxy hóa 1.4.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hoá48,49,50,51 Trong thực nghiệm, hoạt tính kháng oxy hóa được đo bằng khả năng bắt gốc tự do của phản ứng giữa phân tử chất kháng oxy hóa với các gốc tự do hoạt động Dựa vào cơ chế của phản ứng oxy hóa người ta đã đưa ra nhiều phương pháp đo khác nhau + Đối với phản ứng theo... chất chống oxy hóa phải: - Có hiệu thế khử càng thấp càng tốt so với dược chất cần được bảo vệ - Có cấu trúc đã được xác định và có độ tinh khiết cao - Hóa hợp với oxy dễ dàng hơn so với thuốc cần được bảo vệ - Dễ trùng hợp hoặc phản ứng với các gốc tự do do phản ứng oxy hóa sinh ra Chất chống oxy hóa có khả năng làm chậm tốc độ oxy hóa của những chất tự oxy hóa 1.4.2 Hệ thống chống oxy hóa2 4, 26,... giảm và hoạt động chống oxy hóa được gia tăng Diosmin có thể bình thường hóa tốc độ lọc của mao mạch và ngăn ngừa thiếu máu cục bộ ở bệnh nhân tiểu đường Nghiên cứu lưu biến của bệnh nhân tiểu đường tuýp 1 cho thấy diosmin tạo điều kiện thuận lợi cho việc cải tiến các đặc tính dòng chảy của máu do sự giảm tổng hợp hồng cầu, dẫn đến giảm ứ đọng máu và thiếu máu cục bộ 11 Ung thư(46,47) Những ảnh hưởng của. .. Diosmetin CH2 DTAl 1.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa – gây độc tế bào 1.4.1 Khái niệm24, 26, 50(64,65,66) Các chất chống oxy hóa là những chất khử mạnh và có hoạt tính với oxy cao hơn dược chất mà nó bảo vệ Các chất chống oxy hóa là những chất mà khi hiện diện ở nồng độ thấp hơn so với dược chất mà nó bảo vệ có khả năng làm trì hoãn hay làm giảm quá trình oxy hóa của dược chất đó Huỳnh Thị Kim... ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity): phương pháp dựa vào khả năng - hấp thụ các gốc tự do của oxygen TRAP (Total−Trapping Antioxidant Parameter): phương pháp đo hoạt tính - kháng oxy hóa tổng cộng LDL oxidation (Low Density Lipoprotein oxidation): phương pháp dựa vào sự - oxy hóa của lipoprotein tỷ trọng thấp TOSC (Total Oxidant Scavenging Capacity): phương pháp đo khả năng làm sạch sự oxy hóa tổng. .. chống oxy hóa Selen là yếu tố đồng vận của enzyme glutathion peroxidase, và mangan, đồng, kẽm là yếu tố đồng vận của superoxid dismutase… Sự tương tác đa dạng của các hệ thống chống oxy hóa khác nhau là nền tảng cho phương pháp trị liệu dựa trên sự kết hợp của những chất chống oxy hóa khác nhau, hơn là chỉ sử dụng một chất chống oxy hóa Huỳnh Thị Kim Chi 20 Luận văn thạc sĩ 1.4.3 Các kiểu tác động của. .. Trong cơ thể chất chống oxy hóa có khả năng bảo vệ những chất hóa học từ những phản ứng oxy hóa có hại bằng cách phản ứng với các gốc tự do hay những dạng oxy hoạt động khác, vì vậy ngăn cản tiến trình oxy hóa Tuy nhiên sự cung cấp các chất chống oxy hóa có giới hạn vì một phân tử chất chống oxy hóa chỉ có thể phản ứng với một gốc tự do Vì thế cần có nguồn bổ sung chất chống oxy hóa thường xuyên, có thể... Những ảnh hưởng của diosmin đối với các dòng tế bào ung thư của con người trên động vật đã được nghiên cứu và được cho là thuốc phòng ngừa và ức chế sự tăng Huỳnh Thị Kim Chi 14 Luận văn thạc sĩ sinh tế bào ung thư Nhiều nghiên cứu lâm sàng trong lĩnh vực này đã được tiến hành là để xác định liều lượng có hiệu quả của diosmin đối với các dòng ung thư ở người Các nghiên cứu về ảnh hưởng của chế độ ăn uống... phẩm được kết tinh trong acetone và methanol Hiệu suất phản ứng 80.4% Huỳnh Thị Kim Chi 33 Luận văn thạc sĩ Sơ đồ 4 Quy trình tổng hợp DTAl 2.6 Đo độ hấp thu DPPH 2.6.1 Cơ sở thực nghiệm Trong các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa, phương pháp đánh bắt gốc tự do 1,1−diphenyl−2−picrylhydrazyl (DPPH) dùng để đánh giá rất phù hợp để khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các flavonoid, do các flavonoid . trong những nghiên cứu sâu hơn. Chính vì những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài Nghiên cứu bán tổng hợp và xác định hoạt tính kháng oxy hóa của diosmin và dẫn xuất . Huỳnh. hành tổng hợp một vài dẫn xuất của diosmin sau này, xét nghiệm tính kháng oxy hóa, gây độc trên tế bào của các hợp chất tìm được. Từ đó làm nền tảng để thực hiện những bước tổng hợp các dẫn xuất. diosmetin [ 2 4] Tác giả đã tổng hợp dẫn xuất 7-carboxymethoxy-5-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxy-2-propylphenyl)-4H-1-be nzo-pyran-4-one. Nghiên cứu dược tính cho thấy các hợp chất acid và ester của diosmetin