Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên CÁC HỢP CHẤT SAPONIN I. KHÁI NIỆM Saponin là một nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong thực vật. Chữ “sapo” có nghĩa là xà phòng. Người ta biết khoảng 500 loài thuộc 80 họ thực vật có saponin. Một loài động vật cũng có saponin như : hải sâm, cá sao. Saponin có những tính chất đặc trưng sau: - Tạo bọt nhiều và bền khi lắc với nước vì có hoạt tính bề mặt cao, do phân tử saponin có một đầu ưa nước, một đầu kị nước. Tính chất này làm cho saponin có tính chất giống xà phòng: tính nhũ hóa và tẩy sạch. - Làm vỡ hồng cầu ngay trong nồng độ rất loãng, tính chất này người ta gọi là tính phá huyết. Người ta cho rằng tính phá huyết có liên quan đến sự tạo phức giữa saponin và cholesterol và các ether của cholesterol trong màng hồng cầu. Nhưng có một số trường hợp chỉ số phá huyết và khả năng tạo phức với cholesterol không tỉ lệ thuận với nhau nên phải xét đến ảnh hưởng của saponin trên các thành phần khác của màng hồng cầu. Qua việc theo dõi tính phá huyết, người ta thấy rằng cấu trúc của phần aglycol có tác dụng trực tiếp đến tính phá huyết còn phần đường có ảnh huởng đến mức độ phá huyết. Hồng cầu của các động vật khác nhau cũng bị ảnh hưởng khác nhau đối với một loại saponin. Hồng cầu của cừu dễ bị phá nhất nên được dùng tốt để tính chỉ số phá huyết. - Saponin có thể làm chết cá (hoặc một số động vật máu lạnh khác) ở nồng độ rất thấp. Tính chất này được giải thích do saponin làm tăng hoạt tính thấm của biểu mô đường hô hấp làm mất chất điện giải cần thiết. - Saponin còn có tính đặc biệt nữa là tính tạo phức với cholesterol hoặc một số chất 3-β-hydroxy steroid khác. Đôi khi nguời ta dùng tính chất này để tách Saponin, hoặc ngược lại dùng saponin để tách các chất 3-β- hydroxy steroid khác. Saponin có vị đắng, khó chịu, thường ở dạng vô định hình, rất khó tinh chế. Do đó trước đây, các saponin trong cây thường được mô tả ở dạng sapogenin. Người ta phân lập được các saponin có trên 10 đơn vị đường trong phân tử, có điểm chảy và toàn bộ cấu trúc xác định (kể cả dây nối giữa các đơn vị đường). Saponin tan trong nước, cồn loãng, khó tan trong cồn cao độ, rất ít tan trong aceton, không tan trong ether và hexan. Do đó có thể dùng 3 dung môi này để tủa saponin trong quá trình chiết xuất. 146 Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên Các saponin đều là chất quang hoạt, phần lớn các sapogenin steroid là tả truyền, saponin trierpenoid là hữu truyền. Điểm chảy của các saponin thường cao hơn 200 o C. Các saponin thường hay được chuyển thành các dẫn chất acetyl dễ kết tinh hơn, có điểm chảy và năng suất quay cực cố định hơn. Trong một số trường hợp, khi muốn tinh chế saponin hoặc sapogenin, người ta chuyển hóa chúng thành các acetyl sau đó desacetyl hóa. Saponin có thể được tủa bởi chì actat, barium hydroxyd, amonium sulfat. Có thể dùng tính tạo tủa này để phân lập saponin. Saponin có loại acid, trung tính và kiềm. PHÂN LOẠI Trước đây, KOBERT chia saponin làm 2 loại: trung tính và acid căn cứ vào tính tạo tủa. Saponin trung tính thì tủa bởi Barium hydroxid và chì acetat, Còn saponin acid thì tan được trong kiềm, bị tủa bởi chì acetat trung tính và amonium sulfat. Xu hướng hiện nay, người ta chia làm 2 loại dựa theo cấu trúc hóa học: saponin steroid và saponin triterpenoid. II.1. Saponin triterpenoid Phần genin loại này có 30 carbon, gồm saponin triterpenoid pentacyclic và saponin triterpenoid tetracyclic. - Saponin triterpenoid pentacyclic : loại này được chia làm các nhóm olean, ursan, lupan, hopan. • Nhóm olean: Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm này. Phần aglycon thường có 5 vòng và thường là dẫn xuất của 3-β-hydroxy olean 12-ene, tức là β-amyrin. R 1 R 4 R 2 R 3 R 5 HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Olean β-amyrin R 1 =R 2 =R 3 =R 4 =R 5 =CH 3 147 Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên Thí dụ một vài aglycon: - Acid oleanolic : R 1 =R 2 =R 4 =R 5 =CH 3 R 3 = COOH - Hederagenin: R 1 =CH 2 OH R 2 =R 4 =R 5 =CH 3 R 3 =COOH - Gypsogenin: R 1 =CHO R 2 =R 4 =R 5 =CH 3 R 3 =COOH Phần đường có thể nối vào C 3 theo dây nối acetal, đôi khi phần đường nối vào C 28 theo dây nối ester. Gần đây người ta cô lập được saponin có 10-11 đơn vị đường. • Nhóm ursan Cấu trúc nhóm ursan tương tự như nhóm olean. Chỉ khác là nhóm methyl ở vị trí C-30 không gắn vào vị trí C-20 mà vào vị trí C-19. Các sapogenin của nhóm ursan thường là những dẫn chất của 3-β-hydroxy ursan- 12-ene tức α-amyrin. Những saponin của nhóm này thường ít gặp hơn nhóm olean. HO Ursan α-amyrin • Nhóm lupan: Cấu trúc nhóm lupan có các vòng A, B, C, D giống như các nhóm trên, chỉ khác vòng E có 5 cạnh, C-20 ngoài vòng. 148 Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên • Nhóm hopan: Cấu trúc nhóm hopan có các vòng A, B, C, D giống như các nhóm trên, chỉ khác vòng E có 5 cạnh, C-22 ngoài vòng và nhóm methyl gắn ở C-18 thay vì C-17 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 21 22 23 24 25 26 27 20 28 29 30 A B C D E Hupan Hopan - Saponin triterpenoid tetracyclic : gồm 3 nhóm chính: Dammaran, lanostan và cucurbitan • Nhóm dammaran: Đại diện là các saponin của nhân sâm. Phần aglycon gồm 4 vòng và một mạch nhánh. Phần đường nối vào – OH ở C-3 hoặc nối vào nhóm –OH ở mạch nhánh • Nhóm lanostan: Đại diện cho nhóm này là các saponin của loài hải sâm. Các saponin của động vật này có tác dụng phá huyết rất mạnh, mạnh hơn các saponin có nguồn gốc thực vật, người ta cho rằng chúng tiết ra các saponin ít tan trong nước để làm vũ khí tự vệ, cũng tạo bọt như các saponin trong thực vật, khi thủy phân thu được các sapoenin và đường. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Dammaran Lanostan • Nhóm cucurbitan: 149 Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên Phần lớn các saponin nhóm cucurbitan gặp trong họ Cucurbitaceae (họ Bầu bí). Ở đây nhóm CH 3 ở vị trí C-10 sẽ gắn vào vị trí C-9. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Cucurbitan Những chất cucurbitacin là những chất đắng. Phần lớn các chất này tồn tại trong cây ở dạng tự do, một số ít ở dạng glycosid. II.2. Saponin steroid Phần genin của saponin steroid có 27C, là dẫn chất của khung cholestan. Gồm có 3 nhóm: spirostan, furostan và nhóm saponin steroid alcaloid. • Nhóm spirostan: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 O O Spirostan Nhóm spirostan hiện nay được chú ý nhiều vì là nguồn nguyên liệu quan trọng để bán tổng hợp các thuốc steroid. Hai sapogenin quan trọng là diosgenin (có chủ yếu trong các loài Dioscorea) và hecogenin (có chủ yếu trong các loài Agave) Ở dạng glycosid, phần đường được nối vào –OH ở C-3, một số ít trường hợp ở C-1. 150 Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên O HO O O HO O O Diosgenin Hecogenin • Nhóm furostan: Nhóm này có cấu trúc tương tự nhóm spirostan, chỉ khác là vòng F bị biến đổi, thường là sự mở vòng. • Nhóm saponin steroid alcaloid: là những hợp chất vừa có tính alcaloid vừa có tính saponin gồm có nhóm spirosolan và nhóm solanidan. - Nhóm spirosolan: Chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy ở vòng F được thay bằng NH. Một điểm cần chú ý nữa là ở đây có isomer ở C-22, thí dụ như salasodin có trong cây cà Úc (Solanum laciniatum) có cấu trúc 22α còn tomatodin là các saponin có trong cây cà chua thì có cấu trúc (25 S) 22β O HO N O HO N CH 3 CH 3 H H Solasodin Tomatidin  Nhóm solanidan: Đại diện cho nhóm này là solanidin được ly trích từ khoai tây dưới dạng glycosid là solanin. Solanidin có nhân steroid giống như tất cả các chất trong các nhóm trên nhưng phần mạch nhánh có biến đổi. Hai vòng E và F có chung một carbon và N. 151 Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên N HO Solanidin II. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT SAPONIN Do đặc điểm cấu trúc saponin trong phân tử thường có chuỗi đường dài nên chúng có tính phân cực mạnh, dễ hút ẩm, thường tồn tại ở dạng dẻo, sệt, khó kết tinh. Do đó, việc chiết xuất hợp chất saponin ra khỏi cây cỏ là vấn đề tương đối phức tạp so với một số hợp chất tự nhiên khác. Tùy thuộc vào tính chát hóa học của hợp chất saponin và các chất đi kèm có trong cây để chọn phương pháp thích hợp. Cũng như một số lớn các hợp chất khác có trong thực vật, muốn chiết xuất saponin thực sự có trong tự nhiên thì nguyên liệu phải được làm khô nhanh, bảo quản cẩn thận. Tuy nhiên một số trường hợp trong sản xuất, người ta lại ủ nguyên liệu để enzym có sẵn trong cây hoạt động để tăng hoạt chất mong nuốn. Ví dụ để chiết xuất diosgenin, 2 tác giả Blunden và Hardman dùng phương pháp ủ để tăng saponin steroid có trong củ tươi Dioscorea belizensis lên từ 5-10%. Hardman và Brain cũng đã dùng phương pháp ủ củ Dioscorea deltoidea và hạt của Trigonella foenunggraecum để làm tăng hiệu suất của saponin lên. Trong một loài thực vật, saponin thường tồn tại một hỗn hợp gồm nhiều chất khác nhau. Rất nhiều trường hợp các saponin này chỉ khác nhau do cấu trúc mạch đường, do đó việc tách chiết các saponin riêng biệt rất khó. Phương pháp chủ yếu để tách riêng các saponin là sắc ký cột với pha tĩnh là silicagel, celluloze, polyamid. Người ta cũng thường dùng phương pháp sắc ký gel (gel chromatography). III.1. Chiết xuất saponin triterpen III.1.1. Loại mỡ Nguyên liệu trước khi chiết cần được loại mỡ bằng một số dung môi hữu cơ: ether dầu hỏa, benzen, ether etylic… Quá trình loại mỡ có thể được tiến hành theo phương pháp sau đây: Loại mỡ trước khi chiết: 152 Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên Bột nguyên liệu được loại mỡ bằng cách đun hoàn lưu hay chiết soxhlet với dung môi loại mỡ. Dung môi hòa tan mỡ được tách riêng ra, bã nguyên liệu được làm khô dung môi trước khi cho vào dụng cụ chiết kế tiếp. Loại mỡ sau khi chiết: Để tránh sử dụng một lượng lớn dung môi hữu cơ, người ta có thể loại mỡ sau khi chiết bằng cách lắc với dung môi loại mỡ. Bằng cách này lượng dung môi loại mỡ sẽ ít hơn nhiều so với cách loại mỡ trực tiếp trên nguyên liệu. Lọai mỡ bằng phương pháp đông lạnh: Trong một số trường hợp chiết xuất lớn và dịch chiết nhiều mỡ, có thể dùng phương pháp đông lạnh rồi hớt lớp mỡ đóng váng trên bề mặt. Sau đó, thu hồi dung môi chiết. Để đảm bảo sạch mỡ, có thể lắc với dung môi loại mỡ nếu thấy cần thiết. III.1.2. Chiết xuất Thông thường, hợp chất saponin có tính phân cực mạnh nên dung môi dùng để chiết saponin là các dung môi phân cực như: nước, cồn, methanol (thường dùng trong phòng thí nghiệm) Nước là dung môi hòa tan saponin rất tốt, nhưng có nhược điểm là: ngoài saponin, nước còn hòa tan nhiều tạp chất trong cây như chất màu, nhựa, tinh bột, tanin, đường, muối vô cơ… Do đó sẽ gây khó khăn trong quá trình tinh chế. Ngoài ra trong môi trường nước sẽ có một số saponin phân hủy do men (ví dụ như saponin của Hedera helix, Gypsophyla paniculata) Dung môi thường dùng để chiết saponin là cồn 40-90%. Hầu hết các saponin đều tan tốt trong cồn và trong môi trường này khống chế được sự hoạt động của các men. Tuy nhiên, khi dùng cồn làm dung môi chiết cần lưu ý một số trường hợp của các saponin acid trong phân tử có chứa nhóm carboxyl, dưới tác dụng của cồn sẽ chuyển thành dẫn xuất alkyl ester. III.1.3. Loại các tạp chất Trong dịch chiết thu được, ngoài saponin còn lẫn nhiều tạp chất đi kèm, do đó phải từng bước loại dần các tạp chất để thu được một hỗn hợp thành phần saponin tương dối cao gọi là “hỗn hợp saponin thô”. Loại chlorophyl: Nếu dịch chiết có chlorophyl thì loại bằng cách lắc dịch chiết với các dung môi kém phân cực như cyclohexan, tetraclorur carbon… Trường hợp các saponin bền với nhiệt, có thể loại chlorophyl bằng cách chiết cây với nước sôi 100 0 C, trong điều kiện này chlorophyl không tan trong dịch nước. 153 Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên Loại các hợp chất ít phân cực: Để loại các tạp chất kém phân cực như các chất màu, các hợp chất phenolic ta lắc dịch chiết với dung môi hữu cơ sau: choroform, ether, ethyl acetat. Loại các chất phân cực mạnh: Dịch chiết sau khi loại tạp ít phân cực sẽ được thu hồi dung môi, sau đó lắc với n-buthanol. Lớp n-buthanol sẽ chứa một lượng lớn saponin, còn lớp nước chủ yếu chứa các tạp chất phân cực mạnh như đường tự do, muối vô cơ… III.1.3. Tủa hợp chất saponin thô Tùy theo dung môi chiết và tùy thuộc vào bản chất của saponin để chọn chất kết tủa thích hợp: Bảng 27: Một số chất dùng để chiết saponin Dung môi chiết Chất kết tủa Ghi chú Nước Chì acetat trung tính Saponin acid Nước Chì acetat baz Saponin rung tính EtOH, MeOH Aceton EtOH, MeOH Ether EtOH 50-90% Metyletyl ceton EtOH 90-96% Cholesterol Saponin steroid 154 Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên Sơ đồ tổng quát chiết xuất saponin triterpen 155 NGUYÊN LIỆU Loại mỡ DM chứa dầu béo NL đã loại mỡ Dịch chiết Dịch cyclohexan (chứa chlorophyl) Dịch chiết đã loại chlorophyl Dịch CHCl 3 (chứa các hợpchất phân cực yếu) Dịch chiết đã loại hợp chất hữu cơ phân cực yếu Dịch nước (chứa hợp chất phân cực mạnh) Dịch n-buthanol (chứa saponin) Dịch MeOH Hỗn hợp saponin thô Chiết bằng dung môi (nước, cồn, MeOH) Thu hồi còn 1/3 thể tích (lắc với cyclohexan) Lắc với CHCl 3 Thu hồi đến cắn +H 2 O, lắc với n- buthanol Thu hồi chân không Hòa tan cắn với MeOH Tủa bằng ester [...]... MeOH Dịch MeOH Ether Tủa saponin Sơ đồ phương pháp tạo phức với cholesterol - Phương pháp tạo dẫn xuất Để tinh chế saponin, người ta có thể tạo các dẫn xuất của hợp chất này (ví dụ: methyl hóa, ethyl hóa ) sau đó lợi dụng tính chất đặc trưng của các dẫn xuất để tách chúng ra khỏi hỗn hợp 166 Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên Methyl hóa Acethyl hóa 5 mg saponin 5 mg saponin + 5ml MeOH + 2ml diazomethan... trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên Bột nguyên liệu MeOH Bã Dịch chiết MeOH Cô Cao toàn phần H2O Lắc với n-BuOH Dịch pha n-BuOH Dịch nước Cắn Hòa với MeOH Tủa Ether Tủa Đường và các hợp chất tự do khác Dịch Hỗn hợp Saponin thô Sterol Sơ đồ chiết saponin triterpen từ Ngưu tất (Achyranthes bidentata Blume) 157 Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên III.2 Chiết xuất saponin steroid Quá trình chiết các saponin. .. lacinatum 164 Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên Phương pháp tinh chế hợp chất saponin: Tủa saponin thu được bằng các phương pháp chiết xuất trên, tuy đã qua nhiều giai đoạn loại tạp nhưng vẫn chưa tinh khiết (thường gọi là saponin thô) Muốn có được hỗn hợp saponin tinh khiết cần phải tiếp tục tinh chế Tùy theo tạp chất đi kèm trong các tủa thô để lựa chọn phương pháp tinh chế thích hợp Sau đây là một... acetyl saponin Kết tinh lại Dẫn xuất methyl saponin Sơ đồ phương pháp tạo dẫn xuất Phương pháp kết tinh lại Thông thường các hợp chất saponin có chuỗi đường dài nên rất khó kết tinh Tuy nhiên cũng có một số ít saponin có khả năng kết tinh được, đặc biệt là các ester sapogenin, trong trường hợp này có thể dùng phương pháp kết tinh Phương pháp sắc ký cột Đây là phương pháp hữu hiệu để tinh chế hỗn hợp saponin. .. thích hợp để tinh chế mà còn hiệu quả trong việc tách các đơn chất, đặc biệt là saponin triterpen Một số chất nhồi cột và dung môi thường dùng để tinh chế và tách saponin: Chất nhồi cột: silicagel, acid alumin, cellulose, polyamid… Dung môi rửa cột: tùy theo bản chất của saponin để chọn dung môi phân cực hay kém phân cực một số hỗn hợp dung môi thường dùng là: n-buthanol bão hòa nước 167 Giáo trình Hóa. ..Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên Bột nguyên liệu Dịch chiết MeOH Cô giảm áp Cắn Dịch nước Lắc với n-hexan (loại nhựa, chất màu ) Lắc với CHCl3 (loại chất màu) Dịch chiết đã loại tạp Lắc với n-buthanol Dịch nbuthanol Dịch nước Cắn Hòa tan với MeOH Dịch MeOH Tủa bằng ether Hỗn hợp saponin thô Sơ đồ chiết xuất saponin triterpen từ cây Ngũ gai bì chân chim (Schefflera... các saponin steroid cũng tương tự như các saponin triterpen gồm có các bước cơ bản: loại chất béo, chiết bằng dung môi phân cực, loại tạp… Tuy nhiên, các hợp chất saponin steroid thường được ứng dụng nhiều trong công nghiệp bán tổng hợp chất corticoid dưới dạng sapogenin (Ví dụ như: diosgenin, hecogenin, tigogenin ) vì thế trong quá trình chiết xuất người ta kết hợp thêm giai đoạn thủy phân để thu nhận... cholesterol của một số saponin để trong ethanol tác dụng với dung dịch cholesterol trong ethanol nóng (50-60oC) sẽ tạo phức ở dạng tủa Lọc lấy tủa phức, phá phức bằng các hòa tan tủa trong pyridin Thu hồi dịch pyridin đến cắn Hòa cắn trong methanol, sau đó tủa dịch methanol bằng ether ethylic sẽ thu được hỗn hợp saponin tinh khiết 165 Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên Tủa saponin thô EtOH Dịch... tinh chế tương tự như tinh chế hợp chất alcaloid 163 Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên Bột nguyên liệu HCl 5% / isopropanol Hồi lưu 2h Lọc, ép bã Dịch acid (đường) Bã (solasodin chlohydrat) Kiềm hóa bằng NaOH 20% Chiết bằng Xylen Dịch xylen (solasodin baz) Tinh chế bằng than hoạt Lắc với CH3COOH/isopropanol/H2O Dịch xylen tạp Dịch acid (solasodin acetat) Kiềm hóa bằng NH4OH 25% Lọc tủa Tủa solasodin... trong quá trình chiết có thể lợi dụng 2 tính chất này 162 Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên Bột quả Ngấm kiệt CH3COOH 5%, MeOH 80% Dịch chiết Benzen-ether Dịch chiết đã lọai béo Kiềm hóa bằng NH4OH 25% Tủa glucoalcaloid thô Tinh chế Tủa glucoalcaloid Sơ đồ chiết solasodin từ quả S.Xanthocarpum Schard ed Wendl Cũng tương tự như saponin steroid, các saponin steroid cũng thường được xử lý ở dạng . trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên CÁC HỢP CHẤT SAPONIN I. KHÁI NIỆM Saponin là một nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong thực vật. Chữ “sapo” có nghĩa là xà phòng. Người ta biết khoảng 50 0. với một số hợp chất tự nhiên khác. Tùy thuộc vào tính chát hóa học của hợp chất saponin và các chất đi kèm có trong cây để chọn phương pháp thích hợp. Cũng như một số lớn các hợp chất khác có. không tan trong dịch nước. 153 Giáo trình Hóa học các Hợp chất Tự nhiên Loại các hợp chất ít phân cực: Để loại các tạp chất kém phân cực như các chất màu, các hợp chất phenolic ta lắc dịch chiết