B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I ==== ==== NGUY N VĂN QUANG XÁC ð NH GENOTYPE VÀ M T S ð C ðI M D CH T H C PHÂN T TYPE (PCV2) C A PORCINE CIRCOVIRUS ðÀN L N NUÔI T I M T S T NH MI N B C VI T NAM LU N VĂN TH C SĨ HÀ N I – 2013 B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I ==== ==== NGUY N VĂN QUANG XÁC ð NH GENOTYPE VÀ M T S ð C ðI M D CH T H C PHÂN T TYPE (PCV2) C A PORCINE CIRCOVIRUS ðÀN L N NUÔI T I M T S T NH MI N B C VI T NAM CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y Mà S : 60.64.01.01 NGƯ I HƯ NG D N KHOA H C: TS HUỲNH TH M L HÀ N I – 2013 L I CAM ðOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên c u c a tơi, k t qu nghiên c u lu n văn trung th c chưa ñư c s d ng ñ b o v m t h c v Tôi xin cam ñoan m i s giúp ñ cho vi c hồn thành lu n văn đư c cám ơn thơng tin trích d n lu n văn ñã ñư c ch rõ ngu n g c Hà N i, ngày 15 tháng năm 2013 Tác gi lu n văn Nguy n Văn Quang Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… i L I C M ƠN Trong su t trình h c t p th c hi n đ tài, ngồi s n l c c a b n thân tơi cịn nh n ñư c r t nhi u s quan tâm, giúp ñ c a t p th cá nhân Tôi xin chân thành c m ơn Ban giám hi u trư ng ð i h c Nông Nghi p Hà N i, Ban qu n lý ñào t o, Ban ch nhi m khoa Thú y ñã t o u ki n cho tơi th i gian h c t p làm lu n văn t t nghi p ð c bi t, bày t lòng bi t ơn chân thành sâu s c t i TS Huỳnh Th M L - gi ng viên B môn Vi sinh v t - Truy n nhi m, khoa Thú y, trư ng ð i h c Nơng Nghi p Hà N i dành nhi u th i gian ch d n giúp đ t n tình đ tơi hồn thành lu n văn t t nghi p Tôi xin chân thành c m ơn s giúp đ t n tình c a th y cô B môn Vi sinh v t - Truy n nhi m ñã t o m i ñi u ki n thu n l i đ tơi hồn thành cơng vi c q trình th c t p c a Tơi ln bi t ơn t i gia đình, b n bè, nh ng ngư i ln đ ng viên, giúp đ tơi su t trình h c t p t i trư ng trình th c hi n ñ tài Hà N i, ngày 15 tháng năm 2013 Tác gi lu n văn Nguy n Văn Quang Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… ii M CL C L I CAM ðOAN i L I C M ƠN ii M C L C iii CÁC CH VI T T T TRONG BÁO CÁO v DANH M C B NG BI U vi DANH M C HÌNH .vii M ð U CHƯƠNG T NG QUAN TÀI LI U 1.1 Gi i thi u v PCV2 b nh PCV2 gây 1.1.1 M t vài nét v PCV2 1.1.2 B nh PCV2 gây 1.1.3 Tri u ch ng b nh tích 11 1.1.4 Ch n đốn 15 1.1.5 Phòng b nh 17 1.1.6 ði u tr 22 1.2 Tình hình nghiên c u ngồi nư c v PCV2 b nh PCV2 gây 22 1.2.1 Tình hình nghiên c u nư c 22 1.2.2 Tình hình nghiên c u th gi i 23 CHƯƠNG N I DUNG - NGUYÊN LI U PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 26 2.1 ð i tư ng nghiên c u 26 2.2 ð a ñi m 26 2.3 N i dung nghiên c u 26 2.4 Nguyên li u 26 2.5 Phương pháp nghiên c u 27 2.5.1 Phương pháp tính tốn dung lư ng m u 27 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… iii 2.5.2 Phương pháp thu th p m u huy t thanh, m u b nh ph m 27 2.5.3 Phương pháp nested PCR ch n đốn PCV2 b nh ph m 27 2.5.4 Phương pháp gi i trình t gen 31 2.5.5 Xây d ng ph h 32 2.5.6 Phương pháp x lý s li u 32 CHƯƠNG K T QU VÀ TH O LU N 33 3.1 T ng h p k t qu thu th p m u dùng nghiên c u 33 3.1.1 K t qu thu th p m u 33 3.1.2 Tri u ch ng lâm sàng b nh tích đ i th c a l n nghi m c b nh liên quan ñ n PCV2 34 3.2 K t qu xác ñ nh genotype c a PCV2 ñàn l n nuôi t i m t s t nh mi n B c Vi t Nam 40 3.2.1 K t qu xác đ nh s có m t c a PCV2 m u nghiên c u 40 3.2.2 K t qu xác ñ nh s có m t c a PCV2 đàn có/khơng bi u hi n tri u ch ng c a PCVAD 44 3.2.3 K t qu xác ñ nh genotype c a ch ng PCV2 đàn l n ni t i m t s t nh mi n B c Vi t Nam 45 3.3 K t qu gi i trình t b gen c a PCV2 46 3.4 Phân tích, so sánh trình t ch ng gi i trình t đư c ch ng lưu hành th gi i 47 3.4.1 ð c m trình t gen PCV2 lưu hành Vi t Nam 47 3.4.2 K t qu phân tích ph h ch ng PCV2 lưu hành Vi t Nam 50 3.4.3 K t qu phân tích trình t amino acid c a capsid protein 53 CHƯƠNG K T LU N VÀ ð NGH 55 4.1 K t lu n 55 4.2 ð ngh 55 TÀI LI U THAM KH O 57 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… iv CÁC CH VI T T T TRONG BÁO CÁO ADN : Axit Deoxyribose Nucleic ELISA : Enzym Linked Immunosorbent Assay ORF : Open Reading Frame PBS : Phosphate – Buffered - Saline PCR : Polymerase Chain Reaction PCV : Porcine CircoVirus PCV1 : Porcine CircoVirus type PCV2 : Porcine CircoVirus type PCVAD : Porcine CircoVirus Associated Disease PDNS : Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome PK15 : Pig Kidney 15 PMWS : Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome PNP : Proliferating Necrotizing Pneumonia PRDC : Porcine Respiratory Disease Complex PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome TAE buffer : Tris-Acetate Etilendiamin Tetraaxetic Axit buffer Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… v DANH M C B NG BI U B ng 1.1 B ng so sánh khung ñ c m c a PCV1 PCV2 B ng 1.2 Nh ng nghiên c u v PCV2 th gi i 23 B ng 2.1 Trình t c p m i c a ph n ng nested PCR ñ xác ñ nh genotype gi i trình t PCV2 29 B ng 2.2 Chu trình nhi t c a ph n ng PCR ch n đốn đ nh type PCV2 31 B ng 3.1 T ng h p tình hình thu th p m u xác đ nh s có m t c a PCV2 33 B ng 3.2 K t qu nested PCR xác đ nh s có m t c a PCV2 m u huy t thu th p ñư c t ñ a phương 41 B ng 3.3 K t qu nested PCR xác đ nh s có m t c a PCV2 m u b nh ph m thu th p ñư c t ñ a phương 41 B ng 3.4 So sánh t l dương tính PCR nhóm l n kh e m nh nhóm l n có tri u ch ng b nh 44 B ng 3.5 K t qu xác ñ nh genotype PCV2 lưu hành đàn l n ni t i m t s t nh mi n B c 46 B ng 3.6 Thơng tin PCV2 đư c s d ng đ gi i trình t gen 47 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… vi DANH M C HÌNH Hình 1.1: C u trúc PCV2 (Gillespie c ng s , 2009) Hình 2.1 Sơ đ v trí m i ph n ng nested PCR 28 Hình 3.1 L n cịi c c, ch m l n 36 Hình 3.2 L n g y cịm, lơng d ng 36 Hình 3.3 L n b viêm da 36 Hình 3.4 L n b viêm da 37 Hình 3.5 L n b tiêu ch y 37 Hình 3.6 L n có tri u ch ng hô h p 37 Hình 3.7 L y m u l n thí nghi m 37 Hình 3.8 H ch b n nơng sưng, xu t huy t 38 Hình 3.9 H ch b n nơng sưng, xu t huy t 38 HÌnh 3.10 Viêm dính màng ph i v i thành l ng ng c 38 Hình 3.11 H ch màng treo ru t b sưng, xu t huy t 38 Hình 3.12 L n b viêm kh p 39 Hình 3.13 Th n b sưng, xu t huy t có m ho i t 39 Hình 3.14 Ph i b viêm m c ñ khác 39 Hình 3.15 K t qu nested PCR m u ADN dương chu n m u b nh ph m 40 Hình 3.16 K t qu phân tích ph h c a PCV2 ch ng lưu hành Vi t Nam v i ch ng tham chi u 51 Hình 3.17 K t qu phân tích ñư ng phát tán c a virus thu c nhóm tái t h p 52 Hình 3.18 Trình t amino acid c a ch ng PCV2 lưu hành t i Vi t Nam 53 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… vii M ð U Chăn nuôi m t hai lĩnh v c kinh t quan tr ng n n kinh t nông nghi p (chăn nuôi, tr ng tr t) nư c ta m t m t xích quan tr ng s n xu t nông nghi p b n v ng, t o vi c làm, tăng thu nh p, xóa đói gi m nghèo Vì th , chăn ni ln chi m v trí quan tr ng đ i tư ng v t ni ln ñư c quan tâm phát tri n ð thúc ñ y nhanh q trình nhân gi ng v t ni nh ng năm g n ñây vi c ng d ng ti n b khoa h c ngày nhi u như: ng d ng th tinh nhân t o vào chăn nuôi quy mô r ng nh m tăng su t chăn nuôi, tránh c n huy t, d ch b nh qua giao ph i t nhiên đ c bi t chăn ni l n Khi ngành chăn nuôi phát tri n ngày m nh m theo xu hư ng công nghi p, ngư i ta nh n th y vi c cai s a s m có th làm cho l n khơng nh n đ kháng th c n thi t t m , d n ñ n r t d m c b nh Porcine circovirus (PCV) ñư c phát hi n ñ u năm 1974 t bào PK15 ñư c x p vào Porcine circovirus typ không gây b nh (PCV1) Năm 1997, Harm c ng s tìm Porcine circovirus typ (PCV2) nh ng l n m c h i ch ng g y còm sau cai s a (postweaning multisystemic wasting syndrome – PMWS) ñã xác đ nh trình t nucleotide c a PCV1 PCV2 gi ng dư i 80% trình t amino - acid dư i 70%; đ c tính kháng nguyên c a hai lo i virus có nhi u ñi m khác Nghiên c u m u b nh ph m ñư c thu th p t nh ng 1970 ñã ch s có m t c a PCV2 lưu hành đàn l n m t s nư c Tuy nhiên, h i ch ng b nh PCV2 gây m i ñư c xác ñ nh vào nh ng năm 90 c a th k XX PCV2 tác nhân gây suy gi m h th ng mi n d ch, v i tác nhân gây b nh khác gây nên h i ch ng b nh liên quan ñ n PCV2 (Porcine circovirus type 2-associated disease, PCVAD) g m H i ch ng g y còm l n Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 68 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 69 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 70 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 71 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 72 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 73 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 74 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 75 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 76 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 77 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 78 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 79 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 80 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 81 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 82 ... 3 12 35,7 85 1735-1034 23 3 27 ,8 1 723 –1 022 23 3 27 ,8 66 671-357 104 11,9 658-38 20 6 23 ,2 62 565-386 59 6,5 5 52- 205 115 13,3 83 1016-1177 53 6 ,2 1163-1450 95 9,8 không 1611-1530 27 2, 8 1518-1330 62. .. Úc 20 06 Ba Lan 20 09 New Zealand 20 03 Rumani 20 06 Brazil 20 03 Scotland 20 00 Venezuela 20 05 Slovakia 20 09 Argentina 20 00 Tây Ban Nha 1997 Th y ði n 20 02 Th y Sĩ 20 01 Anh 20 01 Châu Á B cM Dương Nam. .. ch t h c phân t c a PCV2 Căn c vào k t qu gi i trình t gen, ngư i ta chia PCV2 thành genotype, ký hi u t PCV2a-2e Tuy nhiên, theo Segalés c ng s (20 08), ch có genotype PCV2a, PCV2b PCV2c đư c