Phân lập và xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ứng dụng trong xử lí môi trường

25 864 2
Phân lập và xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ứng dụng trong xử lí môi trường

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

Phân lập và xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ứng dụng trong xử lí môi trường

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên : Trương Thị Hồng Nhung Hoàng Minh Nguyệt Lớp : CNSH – K52 Giáo viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Giang KS. Nguyễn Thị Bích Lưu Bộ môn SHPT & CNVS – Khoa Công nghệ sinh học 1 Đề tài: “Phân lập xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ứng dụng trong xửmôi trường” 2  Ô nhiễm môi trường đã đang là vấn đề cấp thiết thu hút sự quan tâm của rất nhiều cá nhân, tổ chức cũng như nhiều quốc gia trên thế giới. Các công nghệ xử lý rác thải được sử dụng hiện nay đều vấp phải các vấn đề môi trường về lâu dài. Trong khi đó xử lý ô nhiễm môi trường bằng biện pháp sinh học, đặc biệt là việc sử dụng vi sinh vật trong xử lý rác thải đang là một công nghệ đem lại hiệu quả cao, ít tốn kém bền vững.  Các vi sinh vật được sử dụng chủ yếu là các vi khuẩn có khả năng phân hủy các chất hữu cơ, một nguồn rác thải chủ yếu ở Việt Nam.  Với mục đích phân lập xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ở suối nước nóng để khởi đầu cho việc nghiên cứu sâu hơn quá trình phân giải các chất hữu cơ trong rác thải của vi sinh vật ưa nhiệt, chúng em tiến hành đề tài: “Phân lập xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ứng dụng trong xửmôi trường” 3 Mục đích yêu cầu: 1. Mục đích:  Phân lập, tuyển chọn ra một số chủng vi khuẩn ưa nhiệthoạt tính enzyme để ứng dụng trong xửmôi trường. 2. Yêu cầu:  Phân lập được các chủng vi khuẩn ưa nhiệt từ suối nước nóng.  Xác định điều kiện tối ưu để nuôi cấy vi khuẩn ưa nhiệt:  pH thích hợp.  Nhiệt độ thích hợp.  Xác định hoạt tính một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt phân lập được. 4 5 1. Đối tượng:  Mẫu thu thập: Mẫu nước lấy từ một số suối nước nóng. 6 2. Địa điểm:  Địa điểm: Bộ môn Sinh học Phân tử Công nghệ Vi sinh – Khoa CNSH – ĐH Nông Nghiệp Hà Nội. 3. Thời gian nghiên cứu:  Thời gian: Từ 3/2009 đến 3/2010. 2.1. Nội dung.  Tìm kiếm, thu thập, phân lập tuyển chọn các chủng vi khuẩn ưa nhiệt từ suối nước nóng.  Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để nuôi cấy vi khuẩn ưa nhiệt.  Xác định các hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt.  Xác định độ bền nhiệt của enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt. 2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu: Nước, bùn, đất ở lòng suối ở những điểm có nhiệt độ khác nhau > 40 0 C. 2.2.2. Môi trường nuôi cấy: Môi trường LB – Agar 1. Pepton : 10g/L 2. NaCl : 5g/L 3. Cao nấm men : 5g/L 4. Agar : 18g/L pH = 7.0 8 2.2. Phương pháp nghiên cứu. 2.2.3. Phương pháp nhuộm Gram  Bước 1: Cố định tiêu bản vi khuẩn bằng cách cố định trên ngọn lửa đèn cồn rồi nhuộm bằng dung dịch tím tinh thể (crystal violet), thường dùng dung dịch Gentian 1%, lên vết bôi trong khoảng một phút rồi rửa bằng nước cất.  Bước 2: Nhuộm tiếp bằng dung dịch Iot ( dung dịch lugol) trong 1 phút rồi rửa vết bôi bằng nước cất.  Bước 3: Phủ lên vết bôi dung dịch ethanol 95% : Acetone (1:1) trong khoảng 1 phút rồi rửa lại bằng nước sạch.  Bước 4: Nhuộm tiếp bằng thuốc nhuộm màu đỏ ( safrnin hoặc fucsin Ziehl ) 30 – 60 giây rồi rửa lại bằng nước sạch hong khô trong không khí.  Để tiêu bản khô tiến hành soi trên kính hiển vi ở vật kính dầu 100. Vi khuẩn bắt màu tím là vi khuẩn Gram (+) còn vi khuẩn bắt màu hồng là vi khuẩn Gram (-). 2.2.4. Phương pháp thử khả năng sinh Enzyme ngoại bào của vi khuẩn:  Phương pháp đục lỗ trên thạch: môi trường gồm agar (18g/l) + nước cất + 1% cơ chất tương ứng với từng loại enzyme được hấp khử trùng, đổ vào đĩa petri. Chờ môi trường nguội, dùng khuyên đục lỗ (đường kính 1cm). Nhỏ dịch nghiên cứu vào lỗ thạch. Ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 50 o C thời gian 18h – 24h. Nhuộm màu bằng thuốc nhuộm tương ứng; sau đó đo đường kính vòng phân giải (D). Từ đó ta có kích thước vòng phân giải (D- d).  Môi trường thử khả năng sinh enzyme protease: agar + cơ chất (0,1 % cazein) + nước cất, thuốc nhuộm lugol (5%).  Môi trường thử khả năng sinh enzyme amylase: agar + cơ chất (0,1% tinh bột) + nước cất, thuốc nhuộm là dung dịch KI (0,1%).  Môi trường thử khả năng sinh enzyme cellulase: agar + cơ chất (0,1% CMC) + nước cất, thuốc nhuộm lugol (5%). 10 [...]... ưu, nhiệt độ 400C CT 2: pH tối ưu, nhiệt độ 500C CT 3: pH tối ưu, nhiệt độ 600C CT 4: pH tối ưu, nhiệt độ 700C CT5: pH tối ưu, nhiệt độ 800C  Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính của enzyme ngoại bào thu được từ chủng vi khuẩn ưa nhiệt đã phân lập: Mỗi enzyme hoạt động ở một ngưỡng nhiệt độ pH nhất định vậy xác định các điều kiện tối ưu cho hoạt tính của enzyme có ý nghĩa ứng dụng. .. chỉ tiêu theo dõi chủng vi khuẩn phân lập được: 1 Quan sát hình thái khuẩn lạc 2 Hình thái tế bào nhuộm Gram 3 Khả năng di động  Thí nghiệm 2: Thử khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng vi khuẩn ưa nhiệt phân lập được: - Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch - Chỉ ra chủng vi khuẩn sinh enzyme ngoại bào sử dụng cho thí nghiệm tiếp... Hình 1a: Hình thái khuẩn lạc tế bào của chủng vi khuẩn ưa nhiệt N6 17 18 Bảng 2a: Hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn đã phân lập sau 24 h Hoạt tính enzyme (D – d) (mm) Chủng vi khuẩn ưa nhiệt Amylase Protease Cellulase N1 6 14 10 N2 2 6 4 N3 3 2 2 N4 2 4 4 N5 6 16 12 N6 6 8 6 N7 4 8 6 N8 8 16 10 Trong đó: D: Đường kính vòng phân giải của enzyme (tính cả giếng) d: Đường kính của giếng đã đục lỗ... lỗ (d = 1cm) 19 Hình 2: Vòng phân giải của 3 chủng N1, N6, N8 đã phân lập sau 24h Dịch nuôi vi khuẩn Vòng phân giải casein chủng N6 (trái) N5 (phải) Vòng phân giải tinh bột chủng N7 (trái) N8 (phải) Vòng phân giải CMC chủng N1 (trái) N2 (phải) 20 Bảng 2b: Hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn đã phân lập sau 36 h Hoạt tính enzyme (D – d) (mm) Chủng vi khuẩn ưa nhiệt Amylase Protease Cellulase... Bảng 2c: Hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn đã phân lập sau 48h Hoạt tính enzyme (D – d) (mm) Chủng vi khuẩn ưa nhiệt Amylase Protease Cellulase N1 10 22 16 N2 8 14 12 N3 6 14 10 N4 8 14 12 N5 11 20 14 N6 12 18 8 N7 10 16 12 N8 14 20 16 23 Từ kết quả trên chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:  Phân lập được 8 chủng vi khuẩn (N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 ) với những đặc điểm, hình thái khuẩn. ..2.2.5 Phương pháp đo mật độ quang để xác định mật độ vi khuẩn:  Phương pháp này dưa trên khả năng hấp thụ cực đại của các bước sóng đối với các phân tử có kích thước khác nhau trong dung dịch Mỗi mức độ phân tử được hấp phụ ở một bước sóng khác nhau Bước sóng hấp phụ cực đại đối với vi khuẩn là 620nm 11 2.2.6 Cách bố trí các thí nghiệm  Thí nghiệm 1: Phân lập mẫu vi khuẩn thu thập tại một số suối nước... Phân lập được 8 chủng vi khuẩn (N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 ) với những đặc điểm, hình thái khuẩn lạc hình dạng sắp xếp tế bào đặc trưng  Cả 8 chủng vi khuẩn đều có khả năng sinh enzyme ngoại bào amylase, protease cellulase, trong đó khả năng sinh enzyme ngoại bào protease là lớn nhất sinh amylase là nhỏ nhất 24 25 ... thí nghiệm tiếp theo 12  Thí nghiệm 3 4: Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho các chủng vi khuẩn phân lập được: 1 Xác định pH nuôi cấy tối ưu: thí nghiệm được bố trí với 11 công thức: CT 1: pH = 5,0 CT 7: pH = 8,0 CT 2: pH = 5,5 CT 8: pH = 8,5 CT 3: pH = 6,0 CT 9: pH = 9,0 CT 4: pH = 6,5 CT 10: pH = 9,5 CT5: pH = 7,0 CT 11: pH = 10 CT6: pH = 7,5 2 Xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu: thí nghiệm được... thực tiễn rất quan trọng 13 14 Bảng1: Đặc điểm của các chủng vi khuẩn phân lập: Chủng N1 N2 N3 N4 Màu sắc khuẩn lạc Trắng đục Trắng trong Trắng Vàng nhạt Hình thái khuẩn lạc Nhỏ, tròn, bề mặt không nhẵn Tròn, nhỏ, có nhân trắng ở giữa Khuẩn lạc mọc thành cụm, bề mặt có váng tím Tròn, lồi, bề mặt nhẵn Nhuộm Gram Gram (+) Gram (+) Gram (+) Gram (+) Hình dạng tế bào Hình tròn Hình tròn Hình que Hình que Di... động Không di động Hiếu khí Hiếu khí 15 Bảng 1: Đặc điểm của các chủng vi khuẩn phân lập: Chủng N5 N6 N7 Hồng Hồng Vàng Trắng Tròn, lúc đầu không có sau có váng trắng đục N8 Đặc điểm Màu sắc khuẩn lạc Hình thái khuẩn lạc Tròn, nhăn Tròn, lồi, bề mặt nhẵn Tròn, lồi, xung quanh có vi n vàng Nhuộm Gram Gram (+) Gram (+) Gram (+) Gram (+) Hình dạng tế bào Hình tròn Hình tròn Hình tròn Hình que Ít di động . trong rác thải của vi sinh vật ưa nhiệt, chúng em tiến hành đề tài: Phân lập và xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ứng dụng trong. nhiệt.  Xác định các hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt.  Xác định độ bền nhiệt của enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt. 2.2.1.

Ngày đăng: 04/04/2013, 20:49

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan