B¸o c¸o tèt nghiÖp Hà Nội, ngày 25 tháng 08 năm 2010 Sinh viên MỤC LỤC i B¸o c¸o tèt nghiÖp DANH MỤC CÁC BẢNG Mô tả cây: 23 ii B¸o c¸o tèt nghiÖp CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT TRONG BÁO CÁO MIC : Nồng độ ức chế tối thiểu IC 50 : Nồng độ chất thử ức chế 50% sự phát triển của vi sinh vật MBC : Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu LD 50 : Liều giết chết 50% của động vật thí nghiệm L.fermentum : Lactobacillus fermentum S. aureusa : Staphylococcus aureus B. subtilis : Bacillus subtilis S. enterica : Salmonella enterica E. coli : Escherichia coli P.aeruginoa : Pseudomonas aeruginosa C.albicans : Candida albicans iii B¸o c¸o tèt nghiÖp Phần I MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Thế giới thực vật xung quanh chúng ta vô cùng đa dạng và phong phú. Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới, sự đa dạng của dược thảo đã lên đến hơn 20.000 loài. Việt Nam cũng như một số nước Đông Nam Á khác có truyền thống chữa bệnh theo lối y học cổ truyền từ lâu đời, vì vậy dược thảo có một vị trí rất quan trọng. Nhiều hoạt chất quan trọng như quinin, morphin… chưa thể đi bằng con đường tổng hợp mà phải chiết ra từ dược thảo. Thành tựu nghiên cứu của các ngành sinh dược học, đông y học đã cho ta biết tiềm năng kháng khuẩn của nhiều loại dược thảo, giúp chúng ta chủ động sử dụng nguồn kháng sinh thực vật để chữa một số bệnh nhiễm khuẩn một cách có hiệu quả. Trong bối cảnh dịch bệnh ở gia súc, gia cầm diễn biến ngày càng phức tạp như hiện nay do nhiều loại vi khuẩn lớn và kháng nhiều loại thuốc kháng sinh hoá dược, các bệnh virus đang có xu hướng gia tăng thì việc khai thác tiềm năng chữa bệnh của dược thảo để dập tắt dịch bệnh, giảm tổn thất kinh tế… ngày càng trở lên bức thiết. Đối với chăn nuôi thú y, có thể nói lịch sử của quá trình sử dụng thuốc thảo mộc trong thú y trước đây còn do kinh nghiệm mang tính truyền miệng hoặc áp dụng tương tự như ở người (Lê Thị Ngọc Diệp, 1999). Ngoài ra, việc dùng các loại thuốc kháng sinh tuy mang lại hiệu quả cao nhưng lại gây nhiều tác dụng phụ, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng, sức khỏe vật nuôi, gây ô nhiễm môi trường v,v, Trong khi đó, nguồn thuốc thảo mộc lại rất phong phú, dễ kiếm, dễ sử dụng; ít độc hoặc không độc, hiệu quả sử dụng cao, giá thành rẻ và đặc biệt không gây tồn dư trong sản phẩm động vật, ít gây ảnh hưởng hoặc không gây ảnh hưởng đến môi trường. 1 B¸o c¸o tèt nghiÖp Trong vấn đề phòng trị bệnh do vi khuẩn ở vật nuôi, đã có một số lượng khá nhiều các bài thuốc, chất thuốc dân gian dùng cho kết quả tốt mặc dù không bào chế hoặc bào chế còn thô sơ. Trên thực tế hiện nay, chúng ta đã có các nghiên cứu về tác dụng của các loại thảo dược dựa trên cơ sở thực tiễn là kinh nghiệm của ông cha và cơ sở khoa học hiện đại. Tuy nhiên, việc nghiên cứu thuốc không đơn giản và nhanh chóng. Khó khăn này không chỉ đối với nước ta do điều kiện nghiên cứu còn hạn chế mà còn là tình hình chung đối với nhiều nước có nền khoa học tiên tiến vì đối tượng nghiên cứu là cây thuốc, động vật làm thuốc là những sinh vật còn chứa nhiều bí ẩn chưa khám phá ra được (Đỗ Tất Lợi, 1999). Do đó, việc đi sâu tìm hiểu, nghiên cứu khai thác sử dụng thế mạnh của thảo dược là hướng đi hết sức đúng đắn, cần thiết hiện nay và trong tương lai. Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành: "Nghiên cứu sàng lọc và tìm kiếm một số loài thảo dược Việt Nam có hoạt tính kháng sinh nhằm chữa trị bệnh cho gia súc". 1.2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI - Tìm kiếm các loại thảo dược Việt Nam có hoạt tính kháng sinh tốt có khả năng sử dụng trong thực tế để chữa trị bệnh nhiễm khuẩn cho gia súc. 2 B¸o c¸o tèt nghiÖp Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. CÁC CHỦNG VI SINH VẬT ĐƯỢC NGHIÊN CỨU TRONG ĐỂ TÀI - Bacillus subtilis (ATCC 6633): Là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử và thường không gây bệnh. - Staphylococus aureus (ATCC 13709): Cầu khuẩn gram (+) Theo Nguyễn Như Thanh và cộng sự (2001): Thì ở người khoẻ mạnh mang khoảng 30% Staphylococus aureu ở trên da và niêm mạc, khi có những tổn thương ở da và niêm mạc hoặc những rối loạn về chức năng thì các nhiễm trùng do Staphylococus aureus dễ dàng xuất hiện. Staphylococus aureus gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng. Staphylococus aureus còn có khả năng hình thành độc tố ruột trong thực phẩm, do đó nó có thể hình thành nên chứng nhiễm độc. - Escherichia coli (ATCC 25922): Trực khuẩn E.coli là một loại trực khuẩn đường ruột sống ở ruột già, xuất hiện và sinh sống ở động vật chỉ sau khi sinh 2h và tồn tại đến khi cơ thể động vật chết. E.coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, kích thước 2 – 3 x 0,6 µm. Phần lớn E.coli di động do có lông ở xung quanh thân, nhưng một số không thấy di động. Vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp mô. Vi khuẩn bắt màu Gram (-), có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu, khoảng giữa nhạt hơn. Theo Nguyễn Như Thanh và cộng sự (1997): Bình thường E.coli cư trú ở phần sau của ruột, ít khi có ở dạ dày hay phía trước của ruột non. Khi sức đề kháng của con vật giảm, E.coli mới phát triển mạnh, tăng cường độc lực và gây bệnh cho cơ thể. Các tác giả cũng cho biết cấu trúc kháng nguyên của 3 B¸o c¸o tèt nghiÖp E.coli rất phức tạp, có đủ ba loại kháng nguyên O, H, K. Kháng nguyên K có 3 loại: L, A, B nên E.coli có nhiều typ huyết thanh khác nhau, có ít nhất 130 kháng nguyên O, 80 kháng nguyên K, 56 kháng nguyên H. - Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): Hay còn gọi là trực khuẩn mủ xanh, bắt màu gram (-), gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột. - Canđia albicans (ATCC10231): Là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa. - Lactobacilus fermentum: Bắt màu gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật. - Salmonella enterica: Bắt màu gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng đường ruột ở người và động vật. 2.2. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA VIỆC DÙNG THUỐC THẢO MỘC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH CHO GIA SÚC Từ thủa sơ khai loài người đã biết tìm kiếm các loại cây cỏ trong thiên nhiên dùng làm thức ăn và để chữa bệnh. Những hiểu biết về các loại cây cỏ chỉ được truyền miệng, ghi chép đúc kết thành kinh nghiệm chứ chưa được nghiên cứu tỷ mỉ, khoa học. Ngày nay, nhiều loại cây thuốc đã được sử dụng, mang lại hiệu quả kinh tế rõ rệt trong phòng trị bệnh cho người và gia súc. Có nhiều bài thuốc gia truyền vẫn chưa được giải thích về cơ chế. Xu thế chung hiện nay là kết hợp giữa Đông y và Tây y với phương châm áp dụng những kinh nghiệm của ông, cha ta bằng thuốc Nam, vừa nghiên cứu khảo sát tính năng, tác dụng cây thuốc bằng cơ sở khoa học hiện đại (Đỗ Tất Lợi, Ngô Xuân Thu, 1970). Có thể nói lịch sử của quá trình sử dụng thuốc thảo mộc trong thú y trước đây còn do kinh nghiệm mang tính truyền miệng hoặc áp dụng tương tự như ở người (Lê Thị Ngọc Diệp, 1999). 4 B¸o c¸o tèt nghiÖp Trong những năm gần đây, đã có nhiều công trình nghiên cứu về thuốc Đông dược để phòng bệnh cho vật nuôi. Thuốc có nguồn gốc thảo mộc có giá thành rẻ, dễ kiếm, dễ sử dụng tránh được các quy trình bào chế phức tạp, ít gây độc mà hiệu quả lại cao. Thêm nữa các loại thuốc này hoặc không có hoặc tồn tại dư lượng rất nhỏ. Chính vì vậy thảo dược ngày càng trở nên quan trọng trong phòng trị bệnh cho gia súc, gia cầm. Trong đề tài này chúng tôi mong muốn nghiên cứu sàng lọc nhằm tìm kiếm một số loại cây thảo dược có hoạt tính kháng sinh để chữa bệnh cho gia súc. 2.2.1.Cơ sở khoa học để nghiên cứu tác dụng của dược liệu Khi xét tác dụng của một vị thuốc theo khoa học hiện đại chủ yếu căn cứ vào thành phần hoá học của vị thuốc, nghĩa là tìm trong vị thuốc có những hoạt chất gì, tác dụng của những hoạt chất ấy trên in vitro, in vivo và trên cơ thể động vật cũng như trên người như thế nào? Các chất chứa trong vị thuốc, hay thành phần hoá học của cây có thể chia thành hai nhóm chính: nhóm chất vô cơ và nhóm chất hữu cơ. Những chất vô cơ tương đối ít và tác dụng dược lý không phức tạp. Trái lại, các chất hữu cơ có rất nhiều loại và tác dụng dược lý hết sức phức tạp. Hiện nay khoa học vẫn chưa phân tích được hết các chất có trong cây do đó chưa giải thích được đầy đủ tác dụng dược lý của thuốc mà ông cha ta đã dùng. Việc nghiên cứu tác dụng chữa bệnh của một số vị thuốc không đơn giản, vì trong một vị thuốc đôi khi chứa rất nhiều hoạt chất, những hoạt chất đó có lúc phối hợp hiệp đồng với nhau làm tăng cường và kéo dài tác dụng, nhưng đôi khi giữa chúng lại có tác dụng đối kháng. Vì vậy, tác dụng của một dược liệu không quy hẳn về một thành phần chính. Sự thay đổi liều lượng cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả chữa bệnh. Trong đông y thường sử dụng phối hợp nhiều vị thuốc, hoạt chất của các vị thuốc sẽ tác động với nhau làm cho việc nghiên cứu đánh giá kết quả điều trị càng khó khăn (Phạm Khắc Hiếu, Bùi Thị Tho, 1995). 5 B¸o c¸o tèt nghiÖp Nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc trên động vật thí nghiệm là một khâu hết sức quan trọng. Khi kết quả tác dụng dược lý phù hợp với những kinh nghiệm của nhân dân, chúng ta có thể yên tâm sử dụng những loại thuốc đó. Trong trường hợp nghiên cứu một vị thuốc nhưng không có kết quả, chưa nên kết luận vị thuốc ấy không có tác dụng điều trị vì phản ứng của các cơ thể sinh vật là khác nhau. Chính vì thế, những kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm phải được xác định trên lâm sàng, mà những kinh nghiệm chữa bệnh của ông cha đã có từ hàng ngàn năm trở về trước là những kết quả thực tiễn có giá trị. Nhiệm vụ của chúng ta là tìm ra cơ sở khoa học hiện đại của những kinh nghiệm đó (Đỗ Tất Lợi, 1991). Mặt khác, trong thời gian gần đây trên thế giới tình trạng vi sinh vật gây bệnh kháng thuốc xảy ra khá phổ biến do việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi với mục đích kích thích tăng trọng và phòng bệnh. Vì vậy ngày 23/07/2003, Ủy ban an toàn thực phẩm EU chính thức khẳng định việc ban bố lệnh cấm sử dụng tất cả các loại kháng sinh như chất kích thích sinh trưởng trong thức ăn chăn nuôi và lệnh cấm này đã có hiệu lực từ ngày 01/01/2006. Tại Việt Nam, tình trạng này cũng diễn ra ngày càng phổ biến gây ra những tổn thất về kinh tế trong chăn nuôi, khó khăn cho công tác phòng chống dịch. Cụ thể, theo kết quả nghiên cứu của Phạm Khắc Hiếu và Bùi Thị Tho trong 20 năm, từ 1975- 1995, vi khuẩn E.coli phân lập từ phân của lợn con phân trắng ở một số tỉnh phía Bắc đã kháng thuốc rất nhanh, tính đa kháng cũng cho một hình ảnh tương tự. Cụ thể năm 1975 có 6% số chủng kháng với 3 loại thuốc, 17% kháng với 2 loại thuốc, không có chủng nào kháng với 4, 5, 6 hoặc 7 loại thuốc. Năm 1995 có 5% số chủng kháng với 7 loại thuốc kiểm tra, 6% kháng với 6 loại, đại bộ phận các chủng kháng thuốc đều kháng từ 2- 5 loại thuốc. Đây thực sự là mối quan tâm lớn của chúng ta. Với xu hướng “Quay về với tự nhiên”, những năm gần đây, một số nước phát triển Châu Âu cũng đã bắt đầu xem xét đến việc đưa đông dược 6 B¸o c¸o tèt nghiÖp vào chữa bệnh. Hiện nay, mức tiêu thụ hàng năm trên thị trường đông dược quốc tế trị giá khoảng 16 tỷ USD. Các nước bán đông dược (dưới dạng thô và thành phẩm) nhiều nhất là Nhật Bản, chiếm 80%; Ấn Độ, Xing-ga-po chiếm 7% (theo vietnamnet). Trong lĩnh vực thú y, đã có nhiều công trình nghiên cứu về đông dược và sử dụng thuốc nam trong phòng, trị bệnh cho vật nuôi. Thuốc có nguồn gốc từ dược liệu thường dễ kiếm, quy trình bào chế đơn giản, giá thành rẻ dễ sử dụng, ít gây độc hại lại có hiệu quả cao. Ưu điểm nổi bật của thảo dược là không để lại với hàm lượng rất nhỏ chất tồn dư độc hại trong sản phẩm động vật. Vì vậy dược liệu thảo mộc trở thành nguồn thuốc quan trọng, góp phần vào việc phòng, trị bệnh cho gia súc, gia cầm. 2.2.2. Một số thành tựu nghiên cứu khoa học về cây thuốc ở Việt Nam trong thời gian qua Từ xa xưa, cha ông ta đã biết sử dụng nguồn dược liệu quý giá sẵn có của đất nước với phương pháp chế biến hay các dạng bào chế thích hợp để chữa bệnh cho người và gia súc Những công trình nghiên cứu về loại thảo dược trong thời gian gần đây đã phát hiện nhiều đặc tính mới và quý của cây, động vật làm thuốc có tác dụng trong phòng và chữa bệnh. Một trong các ngiên cứu đó chỉ ra rằng: các thuốc có nguồn gốc thảo mộc có tác dụng tốt, ít gây nên tác dụng phụ trong khi các thuốc hoá dược thường gây nên các tác dụng phụ, có thể gây tăng đột biến gen, tăng nguy cơ ung thư, quái thai dị hình (Viện dược liệu). Ngày nay, bằng các kết quả thu được đã ngày càng khẳng định rõ mối quan hệ giữa dược liệu và sức khoẻ cộng đồng. Nhiều bệnh nan y được chữa trị nhờ sự đóng góp của dược liệu. Một số nghiên cứu về dược liệu được công bố gần đây là: Các công trình nghiên cứu về lĩnh vực Đông dược, y dược cổ truyền bên nhân y đã và đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế 7 [...]... TƯỢNG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu được tiến hành trên 20 cây thuốc thường có trong các bài thuốc dùng chữa trị bệnh cho gia súc, gia cầm 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu, sàng lọc và tìm kiếm loài thảo dược có hoạt tính kháng sinh tốt từ một số loài thảo dược Việt Nam - Xác định khả năng ức chế một số loại vi khuẩn kiểm định của các chất chiết từ cây thuốc ở mức in vitro - Xác định độ độc của dược liệu... hoạt tính kháng sinh trong điều trị bệnh cho gia súc, gia cầm Chúng tôi đã dùng các phép thử sinh học (in vitro và in vivo) và đã sàng lọc trên 20 cây thuốc thường có trong các bài thuốc dùng chữa trị bệnh cho gia súc, gia cầm 2.4 HIỂU BIẾT VỂ CÂY THUỐC ĐƯỢC NGHIÊN CỨU TRONG ĐỂ TÀI 1 Cây Astiso Tên Khoa Học: Cynara Scolymus L Thuộc họ Cúc (Compositae) Mô Tả: Cây cao khoảng 1-2 m, thân và lá có lông trắng... THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU - Thời gian nghiên cứu: từ 02/2010 đến 06/2010 - Địa điểm nghiên cứu: • Nghiên cứu Sinh học được tiến hành tại Tổ thử nghiệm sinh học – Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt – Cầu Giấy – Hà Nội • Nghiên cứu Hóa học được tiến hành tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt. .. trừ được ngoại ký sinh trùng và côn trùng hại rau, cây công nghiệp 10 B¸o c¸o tèt nghiÖp 2.3 KHÁI QUÁT VỀ LỊCH SỬ TÌM KIẾM, PHÁT TRIỂN VÀ NGHIÊN CỨU PHYTONCID Ở VIỆT NAM Từ bao đời nay ông cha ta đã biết dùng cỏ cây, nhất là các cây có chứa phytoncid- kháng sinh thực vật để chữa bệnh cho người và gia súc Tuệ Tĩnh trong quyển Nam dược thần hiệu”, từ thế kỷ 13, đã kê đơn dùng tỏi để chữa mụn nhọt Trong... trị bệnh nhiễm khuẩn cho gia súc - Nguyễn Hữu Nhạ (1978), cho ra mắt cuốn sách: “Thuốc nam chữa bệnh gia súc, gia cầm” Trong đó tác giả đã sưu tầm và xác minh những kinh nghiệm chữa bệnh trong nhân dân và có nhiều bài thuốc mẫu có giá trị - Trần Minh Hùng (1978) trong quá trình sưu tầm những cây thuốc nam chữa bệnh lợn con phân trắng đã công bố: • Lá Bạc thau + Nghể, tỷ lệ khỏi bệnh là 85% • Cây Bồ... dễ tìm kiếm 15 B¸o c¸o tèt nghiÖp Thấm nhuần tư tưởng chỉ đạo đông tây y kết hợp, khoa học hoá và hiện đại hoá nền thú y dân tộc cổ truyền, đồng thời xuất phát từ yêu cầu thực tiễn Chúng tôi đã tiến hành tìm kiếm và kiểm tra 20 cây thuốc trên một số loại vi khuẩn gây bệnh thú y Từ đó sàng lọc ra những cây có tác dụng tốt với vi khuẩn E.coli Để tìm kiếm và sàng lọc các hoạt chất thiên nhiên có hoạt tính. .. việc chữa các bệnh về gan mật và ung thư… thậm chí cả hiệu ứng ngăn ngừa và chống căn bệnh thế kỷ AIDS (Viện dược liệu) Khi nghiên cứu về cây tỏi, các nhà khoa học trên thế giới đã cho biết: ngoài tác dụng kháng sinh trị vi khuẩn, virut, nấm gây bệnh, tác dụng trị 8 B¸o c¸o tèt nghiÖp nguyên sinh động vật, trị sâu bọ… Tỏi còn điều trị rất nhiều bệnh hiểm nghèo trên người và động vật như: + Tỏi có tác... thích tăng trọng gia cầm; cây Astiso còn có tác dụng với một số vi khuẩn như Staphylococus aureu; Escheriacoli; Salmonella; Bacillus subtilis Thuốc có tác dụng điều trị vết thương phần mềm thực nghiệm trên chuột, tốt hơn hẳn bleumetylen và kháng sinh granulin Qua điều tra nghiên cứu cây thuốc, môn thuốc nam đã cho thấy có nhiều ưu điểm như chữa được hầu hết các bệnh thông thường và một số bệnh nhiễm trùng,... Trầu không, Tỏi, Quế, Sa nhân… - Một số hợp chất thuộc nhóm flavonozid, quinoid, tanoid… cũng được nghiên cứu nhiều Trong số các alcaloid là kháng sinh, berberin được nghiên cứu nhiều hơn Theo Đỗ Tất Lợi (1977),ở Việt Nam có 8 cây thuốc chứa berberin mà giây Vàng đắng được khai thác nhiểu nhất Từ một số cây thuốc hoang dại, đến nay Vàng đắng đã trở thành một nguồn dược liệu quý, được thu gom nhiều... cột thường - Sắc ký cột pha đảo 3.5.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là: + MIC (Minimum inhibition concentration): Nồng . hành: " ;Nghiên cứu sàng lọc và tìm kiếm một số loài thảo dược Việt Nam có hoạt tính kháng sinh nhằm chữa trị bệnh cho gia súc& quot;. 1.2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI - Tìm kiếm các loại thảo dược Việt Nam có. sàng lọc nhằm tìm kiếm một số loại cây thảo dược có hoạt tính kháng sinh để chữa bệnh cho gia súc. 2.2.1.Cơ sở khoa học để nghiên cứu tác dụng của dược liệu Khi xét tác dụng của một vị thuốc. thú y. Từ đó sàng lọc ra những cây có tác dụng tốt với vi khuẩn E.coli. Để tìm kiếm và sàng lọc các hoạt chất thiên nhiên có hoạt tính kháng sinh trong điều trị bệnh cho gia súc, gia cầm. Chúng