BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ  MAI BÍCH THOA TỔNG HỢP PAMAM LAI HÓA PEG MANG THUỐC 5-FLUOROURACIL VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ IN VIVO TRÊN CHUỘT LUẬN VĂN THẠC SĨ 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ  MAI BÍCH THOA TỔNG HỢP PAMAM LAI HÓA PEG MANG THUỐC 5-FLUOROURACIL VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ IN VIVO TRÊN CHUỘT LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên Ngành: HÓA HỮU CƠ Mã ngành: 60 44 27 HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS NGUYỄN CỬU KHOA 2011 LỜI CẢM ƠN  Sau gần năm nghiên cứu làm việc với cố gắng nỗ lực thân cộng với giúp đỡ tất người, luận văn thạc sĩ hồn thành Tơi xin chân thành biết ơn sâu sắc đến: PGS.TS Nguyễn Cửu Khoa, Viện Trưởng Viện Cơng Nghệ Hố Học -Viện Khoa Học Cơng nghệ Việt Nam, Người dành bao tâm huyết hết lịng tận tụy truyền đạt cho tơi nhiều kiến thức chuyên môn kinh nghiệm nghiên cứu khoa học Q thầy Viện Cơng Nghệ Hóa Học TP HCM, trường Đại học Cần Thơ tận tình giảng dạy suốt thời gian tơi theo học Ts Hoàng Thị Kim Dung, Kỹ sư Lý Tú Uyên, Kỹ sư Nguyễn Hồng cơng tác Phịng Hóa hữu polymer - Viện Cơng Nghệ Hóa học - Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam , nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt thời gian thực đề tài Cuối tơi xin cám ơn đến gia đình, bạn bè đồng nghiệp động viên, ủng hộ, giúp đỡ cho vật chất lẫn tinh thần để tơi an tâm học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Xin chân thành cám ơn! Cần Thơ tháng 10 năm 2011 Mai Bích Thoa MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT  ADN Acid deoxyribonucleic ADR Adriamycin ARN Acid ribonucleic DMF Dimethyleformamide DPD Dihydropyrimidine dehydrogenase EDA Ethylenediamine FA Acid folic 5-FU 5-fluorouracil EPR Enhanced Permeability and Rentention Effect H NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance IR Infrared LMWH Low molecular weight heparin MPEG Monomethoxy polyethylene glycol MTX Methotrexate NPC p-Nitrophenyl chloroformate PACA Alkylcyanoacrylate PAMAM Polyamidoamine PEG Polyethylene glycol PGL Poly(glutaraldehyde) PMMA Polymethylmethacrylate TEA Triethylamine THF Tetrahydrofuran DANH MỤC CÁC BẢNG  Bảng Tính chất vật lý hóa chất 38 Bảng Độ dịch chuyển hóa học 1H NMR MPEG p - nitrophenyl carbonate 47 Bảng Độ dịch chuyển hóa học 1H NMR PAMAM G3.0-MPEG .50 Bảng Khảo sát nhả thuốc in vitro môi trường nước 55 Bảng Trung bình phần trăm giảm thể tích khối u lơ thí nghiệm theo thời gian58 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ  DANH MỤC CÁC HÌNH  Hình Mơ hình polymer dẫn thuốc Ringsdorf36 10 Hình Cấu trúc Dendrimer52 17 Hình Sự thay đổi hình dạng độ chặt theo hệ dendrimer PAMAM core ammonia41 19 Hình Phản ứng tạo hệ lẻ PAMAM 19 Hình Phản ứng tạo hệ chẵn PAMAM .20 Hình Cấu trúc PAMAM: A.Core ethylenediamine; B Core ammonia .20 Hình Một số hình thức vận chuyển thuốc PAMAM8 22 Hình Độ độc dendrimer theo nhóm chức bề mặt8 23 Hình Những thuận lợi PEG hóa protein44 .24 Hình 10 Sự kết hợp PEG - PAMAM với adriamycin, methotrexate 25 Hình 11 Mơ hình PAMAM-MPEG mang thuốc 5-fluorouracil 27 Hình 12 Định hướng thụ động dựa theo chế EPR 29 Hình 13 Quá trình nhập bào chất mang - thuốc vào tế bào 31 Hình 14 Sơ đồ phản ứng tổng hợp MPEG p – nitrophenyl carbonate 33 Hình 15 Phản ứng MPEG tác dụng với NPC 34 Hình 16 Sơ đồ phản ứng tạo thành sản phẩm phụ 35 Hình 17 Sơ đồ phản ứng tổng hợp MPEG – PAMAM 35 Hình 18 Máy quay chân không 39 Hình 19 Tủ hút chân khơng 40 Hình 20 Máy đo phổ IR 40 Hình 21 Sản phẩm MPEG – p-nitrophenylchloroformate 46 Hình 22 Phổ 1H NMR MPEG p - nitrophenyl carbonate .47 Hình 23 Sản phẩm PAMAM G3.0-MPEG 5000 48 Hình 24 Cơng thức PAMAM G3.0-MPEG 49 Hình 25 Phổ 1H NMR PAMAM G3.0–MPEG .49 Hình 26 Sản phẩm PAMAM G3.0 - MPEG-5-FU .51 Hình 27 Phổ IR 5-FU (A), PAMAM G3.0-MPEG (B), PAMAM G3.0-MPEG-5FU (C) 52 Hình 28 Phổ 1H NMR PAMAM G3.0-MPEG (A) PAMAM G3.0–MPEG-5-FU (B) 53 Hình 29 Ảnh TEM 5-FU nang hóa PAMAM G3.0-MPEG 54 Hình 30 Phần trăm lượng thuốc phóng thích theo thời gian 56 Hình 31 Kết phân tích khối u phương pháp Flow cytometry với kháng thể kháng HLA 57 Hình 32 Chuột mang khối u tế bào ung thư người MCF7 58 Hình 33 Biểu đồ so sánh phần trăm giảm thể tích khối u lơ thí nghiệm 59 Hình 34 Chuột mang khối u vào ngày (a) sau 15 ngày điều trị thuốc (b) 59 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC  MỞ ĐẦU Ung thư bệnh nguy hiểm cướp sinh mạng ngườ i Theo thống kê nay, ung thư nguyên nhân 1/3 số ca tử vong giới nguyên nhân thứ hai gây tử vong sau bệnh tim mạch Việc điều trị ung thư cịn gặp nhiều khó khăn hiệu điều trị thấp, kháng thuốc tế bào ung thư tính khơng đặc hiệu tế bào ung thuốc… Cùng với phát triển khoa học kỹ thuật người khơng ngừng nghiên cứu tìm vật liệu nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết sống Với tinh thần này, công nghệ nano đời tạo vật liệu với kích thước từ vài nanometer tới vài trăm nanometer sử dụng chất mang để vận chuyển dược chất cho việc điều trị bệnh PAMAM loại nano polymer có cấu trúc đặc biệt thích hợp cho việc mang thuốc, bên cạnh lai hóa với PEG tính tương hợp sinh học polymer tăng lên Đây vật liệu có tiềm ứng dụng y dược công nghệ sinh học, đặc biệt làm chất mang thuốc để điều trị bệnh mãn tính bệnh ung thư Trên sở chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tổng hợp PAMAM lai hóa PEG mang thuốc 5-fluorouracil khảo sát hoạt tính chống ung thư in vivo chuột” nhằm đánh giá sơ khả mang thuốc polymer hoạt tính chống ung thư thể sống 5-fluorouracil mang PAMAM-PEG Từ tạo tiền đề nghiên cứu sâu nhằm tạo loại thuốc đáp ứng đến phận mong muốn thể với liều lượng thích hợp theo thời gian mong muốn, đảm bảo yếu tố tạo nên tính an tồn hiệu điều trị: nơi, lúc liều Chương TỔNG QUAN 1.1 MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ THUỐC 5-FLUOROURACIL3, 51 5-Fluorouracil (5-FU) thuộc loại thuốc chống chuyển hóa, thuốc chống ung thư quan trọng sử dụng rộng rãi suốt thập kỷ qua 1.1.1 Dược lý chế tác dụng Fluorouracil thuốc chống chuyển hóa pyrimidin có fluor Khi fluorouracil chuyển hóa theo đường đồng hóa, thuốc phong bế phản ứng methyl hóa axit deoxyuridylic thành axit thymidilic Do fluorouracil cản trở tổng hợp axit deoxyribonucleic (ADN) ức chế tạo thành axit ribonucleic (ARN) Vì ADNvà ARN cần thiết cho phân chia phát triển tế bào, mà fluorouracil lại gây thiếu thymin, nên làm cho phát triển cân tế bào bị chết Hiệu thiếu hụt ADNvà ARN rõ nét tế bào phát triển nhanh tốc độ fluorouracil thâm nhập vào tế bào nhanh Fluorouracil thường dùng tiêm tĩnh mạch có nửa đời chuyển hóa ngắn Mặc dù thuốc có hoạt tính uống, sinh khả dụng không ổn định Sau tiêm tĩnh mạch, thuốc phân bố vào khối u, niêm mạc tiêu hóa, tủy xương, gan mơ khác khắp thể Mặc dù tan mỡ fluorouracil dễ dàng thấm qua hàng rào máu - não phân bố vào dịch não tủy, mô não Tiêm tĩnh mạch, nửa đời thải trừ trung bình khỏi huyết tương khoảng 16 phút (từ đến 20 phút phụ thuộc vào liều dùng) Khơng cịn thấy thuốc dạng ngun vẹn huyết tương sau tiêm tĩnh mạch 7-20% thuốc thải trừ dạng không biến đổi qua nước tiểu sau giờ, số tới 90% thải trừ đầu Phần cịn lại chuyển hóa phân giải gan tạo chất giáng hóa (carbon dioxide, urea, alpha - fluoro - beta - alanine) khơng có hoạt tính Các chất xuất qua nước tiểu sau 3-4 Khi dùng chỗ, khoảng 6% lượng thuốc hấp thu không đủ gây tác dụng tồn thân Thuốc có tác dụng mạnh đến tế bào tăng sinh nhanh Sự đáp ứng điều trị bắt đầu ban đỏ, tạo mụn nước, trợt da, loét nông, hoại tử cuối tái tạo lại biểu mô 1.1.2 Chỉ định Fluorouracil có hiệu làm thuyên giảm bệnh carcinom đại tràng, trực tràng, vú dày Thuốc có hiệu điều trị carcinom buồng trứng, cổ tử cung, bàng quang, gan tụy Dùng da: Ðiều trị tổn thương da nơng ác tính tiền ác tính; dày sừng tuổi già; dày sừng quang hóa; u sừng gai; bệnh Bowen; carcinom nông tế bào đáy Carcinom tế bào đáy tế bào vảy xuyên sâu thường không đáp ứng với liệu pháp fluorouracil Thuốc dùng tạm thời khơng có phương pháp điều trị khác 1.1.3 Chống định Phụ nữ mang thai cho bú, người bệnh suy dinh dưỡng; suy tủy; nhiễm khuẩn nặng; người bệnh có tiền sử mẫn cảm với thuốc 1.1.4 Liều lượng cách dùng Tiêm truyền tĩnh mạch cho người lớn Fluorouracil tiêm tĩnh mạch truyền tĩnh mạch Liều dùng thường dựa vào thể trọng người bệnh Nếu béo phì, tăng trọng phù cổ trướng dạng giữ nước khác tính theo trọng lượng lý tưởng Liều giảm 1/3 1/2 thể trạng người bệnh dinh dưỡng kém, sau phẫu thuật lớn (trong vòng 30 ngày), suy tủy xương (thiếu máu, giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu), suy gan, suy thận Truyền tĩnh mạch 15 mg/kg/ngày, không g cho lần truyền Thuốc hòa 500 mL dextrose 5% 500 mL NaCl 0,9%, truyền tốc độ 40 giọt/phút truyền 30-60 phút truyền liên tục 24 Liều hàng ngày truyền liên tiếp độc tính xuất 12-15 g Ðây (46) X Wang, Y Wang, Z Chen, D M Shin, Advances of Cancer Therapy by Nanotechnology, Cancer Res Treat, 2009, 41(1), 1-11 (47) C Yiyun, X Tongwen, European Journal of Medicinal Chemistry, 2005, 40, 1188–1192 (48) D Y Zhang, X Z Shen, J Y Wang, L Dong, Y L Zheng, L L Wu, Preparation of chitosan-polyaspartic acid-5-fluorouracil nanoparticles and its anti-carcinoma effect on tumor growth in nude mice, World J Gastroenterol, 2008, 14, 3554-3562 (49) R X Zhuo, B Du, Z R Lu, In vitro release of 5-fluorouracil with cyclic core dendritic polymer, J Control Release, 1999, 57, 249-257 (50) dieutriungthu.net/dich-te-ung-thu/canh-bao-ung-thu-can-benh-thoi-hiendai.aspx (51) nanopharma.com.vn/index.php? option=com_content&task=view&id=276&Itemid=317&lang=english (52) ninger.com/dendrimer/ (53) vi.wikipedia.org/wiki/Ung_thu Luận văn thạc sĩ PHỤ LỤC  Phụ lục Phổ 1H NMR MPEG p – nitrophenyl carbonate (dung mơi CDCl3) Mai Bích Thoa Trang Luận văn thạc sĩ Phụ lục Phổ 1H NMR PAMAM G3.0 - MPEG (dung môi CDCl3) Phụ lục Phổ IR 5-fluorouracil D:\KETQUA10\P49\111010\UYEN.0 5FU SOLID 2010/11/10 Page 1/1 Phụ lục Phổ IR PAMAM G3.0 - MPEG Mai Bích Thoa Trang Luận văn thạc sĩ Phụ lục Phổ IR PAMAM G3.0-MPEG-5-FU D:\KETQUA10\P49\110910\SV.0 G3-MPEG-5-FU SOLID 2010/11/09 Page 1/1 Phụ lục Phổ 1H NMR PAMAM G3.0-MPEG-5-FU (dung mơi D2O) Mai Bích Thoa Trang Luận văn thạc sĩ Phụ lục Phổ 1H NMR 5-fluorouracil (dung môi D2O) Phụ lục Ảnh TEM PAMAM G3.0-MPEG-5-FU Mai Bích Thoa Trang Luận văn thạc sĩ Phụ lục Ảnh TEM PAMAM G3.0-MPEG-5-FU Phụ lục 10 Phổ 1H NMR PAMAM G3.0-MPEG sau nhả thuốc 5-FU hồn tồn (dung mơi D2O) Mai Bích Thoa Trang Luận văn thạc sĩ Phụ lục 11 Xây dựng phương trình đường chuẩn độ hấp thu A265,5 theo nồng độ 5fluorouracil C5-FU Pha dãy dung dịch 5-Fluorouracil có nồng độ từ khoảng 0,7 đến 15,0 µg/ml Tiến hành đo độ hấp thu A dung dịch bước sóng 265,5 nm, thu bảng số liệu: STT A265.5 0,662 0,033 1,325 0,08 2,981 0,175 5,962 0,353 8,942 0,501 11,923 0,663 Mai Bích Thoa Nồng độ µg/ml 14,904 0,841 Trang Luận văn thạc sĩ Từ xây dựng phương trình đường chuẩn A265,5 theo C5-FU phương pháp bình phương cực tiểu, thu phương trình: A265,5 = 0,0559.C5-FU + 0,0052 với R2= 0,99 Phụ lục 12 Kết thử nghiệm hiệu in vivo 5-fluorouracil nang hóa PAMAM G3.0-MPEG chuột mang khối u vú người Lơ Ngày Ngày Ngày 10 Thể tích Thể tích % Giảm Ngày 15 Thể tích % Giảm Thể tích % Giảm 106,25 68,00 36,00 56,00 47,29 31,50 70,35 126,00 105,88 15,97 90,75 27,98 40,00 68,25 5-FU 126,00 64,00 49,21 44,00 65,08 4,00 96,83 nang 100,00 81,00 19,00 60,75 39,25 36,75 63,25 87,50 75,00 14,29 40,00 54,29 0,50 99,43 chất 56,00 18,00 67,86 24,50 56,25 0,50 mang 48,00 62,50 -30,21 62,50 -30,21 Chết 101,25 100,00 1,23 44,00 44,00 0,00 44,00 0,00 40,00 9,09 125,00 272,00 -117,60 126,00 53,68 137,31 -9,85 80,00 100,00 -25,00 100,00 0,00 93,75 -17,19 169,00 144,00 14,79 90,75 36,98 75,00 55,62 48,00 48,00 0,00 48,00 0,00 36,75 23,44 169,00 169,00 0,00 147,88 12,50 55,69 67,05 81,25 98,31 -21,00 75,00 7,69 62,50 23,08 Đối 21,88 29,25 -33,71 24,75 -13,14 4,00 81,71 chứng 64,00 64,00 0,00 56,00 12,50 44,00 31,25 44,00 55,69 -26,56 75,00 -70,45 75,00 -70,45 68,75 68,75 0,00 68,75 0,00 75,00 -9,09 147,88 144,00 2,62 171,50 -19,10 126,00 14,79 hóa 5-FU Mai Bích Thoa 99,11 Chết Trang Luận văn thạc sĩ Mai Bích Thoa Trang ... ? ?Tổng hợp PAMAM lai hóa PEG mang thuốc 5-fluorouracil khảo sát hoạt tính chống ung thư in vivo chuột? ?? nhằm đánh giá sơ khả mang thuốc polymer hoạt tính chống ung thư thể sống 5-fluorouracil mang. ..BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ  MAI BÍCH THOA TỔNG HỢP PAMAM LAI HÓA PEG MANG THUỐC 5-FLUOROURACIL VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ IN VIVO TRÊN CHUỘT LUẬN VĂN THẠC... polyamidoamine, đề tài tổng hợp lại polyamidoamine (PAMAM) lai hóa với MPEG với lượng lớn Sản phẩm tổng hợp dùng làm chất mang thuốc 5-fluorouracil thử nghiệm hoạt tính chống ung thư chuột mang khối