TRNG I HC CN TH KHOA THY SN TRN TH M HÂN NGHIÊN CU MT S MM BNH VI KHUN GÂY BNH TRÊN CÁ THÁT LÁT CÒM (Chitala chitala Hamilton, 1822) LUN VN TT NGHIP CAO HC NGÀNH NUÔI TRNG THY SN 2013 TRNG I HC CN TH KHOA THY SN TRN TH M HÂN NGHIÊN CU MT S MM BNH VI KHUN GÂY BNH TRÊN CÁ THÁT LÁT CÒM (Chitala chitala Hamilton, 1822) LUN VN TT NGHIP CAO HC NGÀNH NUÔI TRNG THY SN CÁN B HNG DN PGs.Ts. T THANH DUNG 2013 Luan van nay, vai tira de la "Nghien cuu mot so mam benh vi khuan tren ca that lat com (Chitala chitala Hamilton, 1822)", do hoc vien Tran Thi My Han thuc hien theo sir huang dan cua TS. Tir Thanh Dung. Luan van da bao cao va dugc Hoi dong cham luan van thong qua ngay 30 thang 11 nam 2013. Uy vien Thu- ky TS. Pham Truang Yen Phan bien 1 TS. Pham Minh Due Phan bien 2 PGS. TS. Huynh Kim Dieu Can bo hiroTig dan TS. Le Hong Phuac Chu tich Hoi dong TS.Tu Thanh Dung PGS. TS. Truang Qu6c Phu i LỜI CẢM TẠ Tác giả xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện học tập và thực hiện đề tài. Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Ts.Từ Thanh Dung đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn học viên lớp cao học khóa 18 đã luôn bên cạnh giúp đỡ tôi trong quá trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện đề tài. Cảm ơn em Nguyễn Minh Trí lớp Nuôi Trồng Thủy Sản Tiên Tiến K34, Nguyễn Bảo Trung lớp Cao học Nuôi trồng Thủy sản K20 đã giúp đỡ rất nhiệt tình trong quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cám ơn sự tài trợ kinh phí đề tài cấp Tỉnh của sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Hậu Giang Sau cùng, con xin cám ơn gia đình với lòng biết ơn sâu sắc nhất gửi đến ba và mẹ đã luôn yêu thương, khuyên nhủ, động viên giúp con có đủ nghị lực và nhiệt huyết vượt qua chặng đường dài học tập. Tác giả Trần Thị Mỹ Hân ii TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định một số mầm bệnh vi khuẩn gây bệnh trên cá thát lát còm. Nghiên cứu tiến hành thu 124 mẫu cá từ 2 tỉnh Hậu Giang và Đồng Tháp. Kết quả đã phân lập và định danh được 47 chủng Edwarsiella tarda (40,3%) và 62 chủng Aeromonas hydrophila (59,7%) trên cá thát lát bệnh. Cá nhiễm vi khuẩn E.tarda có các dấu hiệu như mắt bị lồi và xuất huyết, nhiều đốm đỏ xuất huyết quanh miệng và thân, trên lưng có vết loét chứa dịch. Tuy nhiên, đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila khi gây bệnh, cá có những dấu hiệu bệnh đặc trưng, đó là màu sắc cơ thể nhợt nhạt, bụng trương, hậu môn sưng to và có vết xuất huyết rõ bắt đầu từ hậu môn kéo dài đến 1/3 vây hậu môn. Thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm với 2 chủng vi khuẩn E. tarda (DT37 và HG41) và 2 chủng A.hydrophila (D2F71 và H1F39) được thực hiện trên cá thát lát còm giống khỏe có trọng lượng 15±4 g/con. Phương pháp ngâm được tiến hành đối với cá ương giai đoạn 40 ngày tuổi (trọng lượng 0,7±0,3 g/con) với một chủng E.tarda (HG41) và một chủng A. hydrophila (H1F39). Kết quả thí nghiệm hoàn toàn thỏa mãn các nguyên tắc của định đề Koch, xác định vi khuẩn E. tarda chính là tác nhân gây bệnh đốm đỏ và vi khuẩn A. hydrophila là tác nhân gây bệnh đỏ lườn trên cá thát lát còm. Qua thí nghiệm, ghi nhận giá trị độc lực LD 50 của vi khuẩn E. tarda trong phương pháp tiêm lần lượt là 4,89x10 5 CFU/mL (DT37) và 4,07x10 5 CFU/mL (HG41) và phương pháp ngâm là 1,62x10 4 CFU/ml (HG41). Hai chủng A. hydrophila trong phương pháp tiêm có giá trị độc lực LD 50 lần lượt 1,26x10 4 CFU/mL (D2F71); 4,06x10 3 CFU/mL (H1F39) và 6,12x10 4 CFU/ml (H1F39) trong phương pháp ngâm. Kết quả này cũng cho thấy chủng vi khuẩn E.tarda (DT37) và A. hydrophila (D2F71) thu từ Đồng Tháp có giá trị độc lực LD 50 cao hơn của 2 chủng vi khuẩn (HG41 và H1F9) thu từ Hậu Giang. Kết quả kháng sinh đồ được tiến hành trên 20 chủng vi khuẩn E. tarda và 20 chủng vi khuẩn A. hydrophila với 11 loại kháng sinh cho thấy các chủng vi khuẩn E.tarda và A.hydrophila đều nhạy với enrofloxacin, florfenicol, flumequine, oxytetracycline, trimethoprim+sulfamethoxazol và kháng với streptomycin. Các chủng E. tarda cũng nhạy cao với ampilcillin nhưng kháng với doxycycline. Ngược lại, vi khuẩn A.hydrophila kháng hoàn toàn với ampicillin và nhạy cao với doxycycline. Giá trị MIC của 4 chủng E.tarda và 4 chủng A.hydrophila đối với oxytetracycline là thấp nhất (0,5-1 ppm). Từ khóa: Cá thát lát còm, E. tarda, A. hydrophila, kháng sinh, LD 50 iii ABSTRACT The aim of this study is to determine agents causing infected diseases on clown knifefish (Chitala chitala) in the Mekong Delta. The total of 124 samples were collected from hatcheries and commercial farms in Haugiang and Dongthap provinces. There were 47 isolates of Edwardsiella tarda (40.3%) and 62 isolates of Aeromonas hydrophila (59.7%) obtained from diseased fish. The E. tarda in fish causes gross signs of abnormal swimming, exophthamia with hemorrhages, skin ulcerations and petechiae on body while fish infected with A. hydrophila shows haemorrhagic in all fins, swollen abdormen, haemorrhages along one –third of anal fin. In this study, two E. tarda (DT37 and HG41) and two A. hydrophila (H1F39 and D2F71) isolates were selected for injected challenge in healthy fingerling clown knifefish (mean weight 15±4g) in other to determine agent and lethal doses. Moreover, the experimental infection by immersion with E.tarda (HG41) and A.hydrophila (H1F39) was performed in healthy fingerling clown knifefish (mean weight 0.7±0.3g).The result fulfilled Koch’s postulates and the LD 50 values of two E. tarda (DT37 and HG41) in inoculation were 4.89x10 5 ; 4.07x10 5 CFU/ml and 1.62x10 4 CFU/ml in immersion; Similarly, the value of LD 50 of two A. hydrophila (H1F39 and D2F71) isolates were 1.26x10 4 ; 4.06x10 3 CFU/ml respectively and 6.12x10 4 CFU/ml in immersion. Result showed that the value of LD 50 of E. tarda and A. hydrophila isolated from Dongthap were higher than those from giang. The results of in vitro antibiotic susceptibility testing showed that both 20 E. tarda and 20 A. hydrophila isolates were highly susceptive with enrofloxacin, florfenicol, flumequine, oxytyetracycline and trimethoprim+sulfamethoxazole but resistance with streptomycin. E. tarda isolates aslo had resistance to doxycycline and susceptibility to ampiciline while A.hydrophila isolates were highly sensitive with doxycycline. The lowest MIC value of 4 E. tarda and 4 A. hydrophila isolates was oxytetracycline (0.5-1 ppm). Keywords: Clown knifefish (Chitala chitala), Aeromonas hydrophila, E. Tarda, LD 50 . iv CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên kết quả nghiên cứu của tôi và kết quả chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác. Ngày tháng năm 2013 Tác giả Trần Thị Mỹ Hân v MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii ABSTRACT iii CAM KẾT KẾT QUẢ iv DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH……………………………………………………… viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT x Chương 1: GIỚI THIỆU 1 1.1. Giới Thiệu 1 1.2. Mục tiêu đề tài 2 1.3. Nội dung đề tài 2 Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1. Tổng quan về cá thát lát còm 3 2.1.1 Đặc điểm phân loại 3 2.1.2 Đặc điểm sinh học 3 2.1.3 Tình hình nuôi cá thát lát còm 4 2.2. Các bệnh vi khuẩn trên cá nuôi nước ngọt 5 2.2.1 Bệnh do vi khuẩn Gram âm trên cá nuôi nước ngọt 5 2.2.1.1 Bệnh do nhóm vi khuẩn Aeromonas spp 5 2.2.1.2 Bệnh do nhóm vi khuẩn Pseudomonas spp 7 2.2.1.3 Bệnh do nhóm vi khuẩn Edwardsiella spp. 8 2.2.1.4 Bệnh do nhóm vi khuẩn Flavobacterium spp. 10 2.2.2 Bệnh do vi khuẩn Gram dương trên cá nuôi nước ngọt 12 2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản 13 2.3.1 Những hiểu biết về thuốc kháng sinh 13 2.3.2 Tình hình kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên cá nước ngọt 15 2.3.2.1 Tình hình kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên cá nước ngọt trên thế giới 15 2.3.2.2 Tình hình kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên cá nước ngọt ở Việt Nam 15 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 20 vi 3.2 Vật liệu nghiên cứu 20 3.3 Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1 Phương pháp điều tra 20 3.3.2 Phương pháp thu mẫu cá và phân lập vi khuẩn 20 3.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn 21 3.3.4 Phương pháp làm kháng sinh đồ 21 3.3.5 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 21 3.3.6. Thí nghiệm cảm nhiễmvi khuẩn trên cá thát lát còm 22 3.4 Phương pháp xử lý số liệu 24 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Thông tin điều tra nông hộ 25 4.1.1 Thông tin về kỹ thuật nuôi 25 4.1.2 Thông tin về tình hình xuất hiện bệnh và sử dụng thuốc hóa chất 26 4.2 Kết quả thu mẫu cá thát lát bệnh 28 4.2.1 Số lượng thu mẫu cá thát lát bệnh 28 4.2.2 Dấu hiệu bệnh lý của cá thát lát bệnh 29 4.2.2.1 Dấu hiệu bệnh lý của bệnh đốm đỏ trên cá thát lát 30 4.2.2.2 Dấu hiệu bệnh lý của bệnh đỏ lườn trên cá thát lát 32 4.3 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh 33 4.3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn 33 4.3.2. Kết quả định danh vi khuẩn 35 4.3.2.1. Kết quả định danh vi khuẩn phân lập từ cá bệnh đốm đỏ 35 4.3.2.2. Kết quả định danh vi khuẩn phân lập từ cá bệnh đỏ lườn 39 4.4. Kết quả cảm nhiễm vi khuẩn E. tarda và A. hydrophila 42 4.4.1 Kết quả cảm nhiễm vi khuẩn E. tarda 42 4.4.1.1 Kết quả cảm nhiễm E. tarda bằng phương pháp tiêm 42 4.4.1.2 Kết quả cảm nhiễm E. tarda bằng phương pháp ngâm 45 4.4.2 Kết quả cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila 47 4.4.2.1 Kết quả cảm nhiễm A. hydrophila bằng phương pháp tiêm 47 vii 4.4.2.2 Kết quả cảm nhiễm A. hydrophila bằng phương pháp ngâm 49 4.5 Kết quả kháng sinh đồ và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 51 4.5.1 Kết quả kháng sinh đồ và MIC của vi khuẩn E. tarda 51 4.5.1.1 Kết quả kháng sinh đồ của chủng vi khuẩn E. tarda 51 4.5.1.2 Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn E. tarda 53 4.5.2 Kết quả kháng sinh đồ và MIC của vi khuẩn A. hydrophila 55 4.5.2.1 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn A. hydrophila 55 4.5.2.2 Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của A. hydrophila 57 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC 66 [...]... dng Khỏng thuc ca vi khun l hin tng 1 chng vi khun no ú cú kh nng chng li tỏc dng c ch, kỡm hóm, tiờu dit ca 1 s loi khỏng sinh i vi vi khun ú Kh nng khỏng thuc ny c qui nh bi gen khỏng thuc nm trờn plasmid, nm trong nguyờn sinh cht ca t bo vi khun (Prescott et al., 2000) Cng theo tỏc gi ny thỡ s khỏng thuc ca vi khun cú 2 dng: (1) Khỏng thuc t nhiờn: do bn cht ca vi khun cú th khỏng vi 1 hay nhiu loi... hp: cỏc vi khun thay i quy trỡnh tng hp v t bo, hay cỏc quy trỡnh khỏc khỏng sinh vụ hiu (vi khun khỏng vi penicillin) (5) Sn xut cht cnh tranh vi khỏng sinh: cú nhng vi khun tit ra nhiu APAB (acid para aminobenzoic) l cht khỏng sulfonamide nờn chỳng khỏng c vi khỏng sinh ny Hin nay trờn th trng tn ti nhiu loi thuc khỏng sinh v vic s dng chỳng rt tựy tin, khụng ỳng liu, ỳng cỏch vỡ th m vi khun khỏng... ng bng sụng Cu Long Kt qu cho thy 90% dũng vi khun 18 khỏng vi tetracycline, 76% khỏng vi ampicillin, 100% khỏng vi chloramphenicol, 65% khỏng vi nitrofurantoin v 89% khỏng vi trimethoprim-sulphamethoxazole T kt qu, cú th thy s khỏng thuc ca cỏc vi khun trong mụi trng ao nuụi thu sn ang mc rt cao T nhng thụng tin nờu trờn cho thy, c tớnh khỏng khỏng sinh ca vi khun ny thay i rt a dng, chỳng khỏc nhau... 128; 64; 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5 àg/ml 21 Chun b vi khun: Vi khun c nuụi tng sinh trong dung dch BHIB 28oC, trong 24 gi o mt vi khun bng mỏy quang ph (OD 625 = 0,085-0,13) ti giỏ tr ny vi khun t mt 108 CFU/ ml Pha loóng mt vi khun bng mụi trng BHB vi pha loóng 1:10 Mt vi khun cn cho tin hnh MIC l 105 CFU/ml Tin hnh thớ nghim: cho 2 ml dung dch vi khun vo tng ng nghim cha 2 ml thuc cú cỏc nng... ngõm c tin hnh trờn cỏ thỏt lỏt bt 40 ngy tui vi chng vi khun E.tarda (HG41) v A.hydrophila (H1F39) Thớ nghim c b trớ hon ton ngu nhiờn vi 5 nghim thc cú mt vi khun ln lt l: 104, 105, 106 CFU/ml, nghim thc i chng khụng ngõm v nghim thc i chng ngõm nc mui sinh lý, mi nghim thc lp li 2 ln vi mt cỏ thớ nghim 10 con/b Cỏ c ngõm tip xỳc vi dung dch vi khun vi cỏc nng thớ nghim trong thi gian 30 phỳt... trờn 10 chng vi khun E ictaliri Sau ú, Walman v Shotts (1986) kim tra s khỏng thuc trờn 118 chng E ictaluri phõn lp c Hoa k vi 37 loi thuc khỏng sinh, kt qu cho thy, a s vi khun khỏng vi nhúm sulfonamides v thuc colistin nhng li nhy vi nhúm penicillins, quinolones, tetracyclines v khỏng sinh chloramphenicol Tng t, vi khun E tarda phõn lp t cỏ bnh ti M v i Loan cng ó c ghi nhn l nhy cao vi cỏc loi khỏng... nh loi vi khun Aeromonas spp cú enzyem -lactamase nờn cú kh nng khỏng t nhiờn vi nhúm thuc -lactam, nhng chng E tarda v E.ictaluri cng sn xut c enzyme -lactamase nhng chỳng khụng th hin tớnh khỏng i vi nhúm khỏng sinh ny (Clark et al., 1991; Reger, 1993) nhng nhúm vi khun ny li c ghi nhn l cú th khỏng t nhiờn vi colistin v cú kh nng khỏng cao vi khỏng sinh nhúm macrolides v glycopeptides i vi bnh trng... cng c cụng b l khỏng cao vi khỏng sinh nhúm macrolide v khỏng sinh tetracycline vi giỏ tr MIC lờn n 256 ppm v 128 ppm (Park et al., 2009) Tuy nhiờn loi vi khun ny cng nhy vi nhiu loi khỏng sinh ph bin nh cefotaxim, ofloxacin, penicillin, cephalexin, gentamicin (Park et al., 2009; Lim et al., 2003) 17 2.3.2.2 Tỡnh hỡnh khỏng thuc khỏng sinh ca vi khun gõy bnh trờn cỏ Vit Nam Ti Vit Nam, nhiu chng A hydrophila... 2.2.2 Bnh do vi khun Gram dng trờn cỏ nuụi nc ngt Hin nay ó cú nhiu nghiờn cu ghi nhn 1 s tỏc nhõn vi khun gõy bnh ph bin trờn cỏ nc ngt ti Vit Nam v nhiu nc trờn th gii Cỏc loi vi khun Gram dng ny phn ln thuc nhúm vi khun Streptococcus spp Nhúm vi khun ny ó gõy thit hi nghiờm trng trờn nhiu i tng nuụi nh cỏ iờu hng, cỏ rụ phi (El-Sayed, 2006; Noga, 2010; ng Thy Mai Thy v ng Th Hong Oanh, 2011) Vi khun... vi khun Gram õm trờn cỏ nuụi nc ngt 2.2.1.1 Bnh do nhúm vi khun Aeromonas spp Vi khun ging Aeromonas spp thuc h Aeromonadaceae gm 2 nhúm: di ng Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae v Aeromonas sorbia v khụng di ng Aeromonas salmonicada c tớnh chung ca ba loi vi khun thuc nhúm di ng l vi khun Gram õm, dng hỡnh que ngn, ym khớ tựy tin Ti Vit Nam, vi khun thuc ging Aeromonas spp di ng c phõn lp t cỏ nc . hiện bệnh và sử dụng thuốc hóa chất 26 4.2 Kết quả thu mẫu cá thát lát bệnh 28 4.2.1 Số lượng thu mẫu cá thát lát bệnh 28 4.2.2 Dấu hiệu bệnh lý của cá thát lát bệnh 29 4.2.2.1 Dấu hiệu bệnh. và điều trị bệnh do vi khuẩn trên cá thát lát còm một cách hợp lý. 1.2 Mục tiêu đề tài Đề tài được thực hiện nhằm xác định một số mầm bệnh vi khuẩn gây bệnh trên cá thát lát còm, từ đó làm. Tổng quan về cá thát lát còm 3 2.1.1 Đặc điểm phân loại 3 2.1.2 Đặc điểm sinh học 3 2.1.3 Tình hình nuôi cá thát lát còm 4 2.2. Các bệnh vi khuẩn trên cá nuôi nước ngọt 5 2.2.1 Bệnh do vi