Nguyên lý và ứng dụng của phương pháp PCR trong phát hiện và chẩn đoán bệnh ở động vật thủy sản Kết quả chẩn đoán bệnh phụ thuộc rất lớn vào: 2. tính sẵn có của phương pháp chẩn đoán đang được áp dụng ở phòng thí nghiệm 3. lảnh vực nghiên cứu của người chẩn đoán 4. những phép chẩn đoán được phát triển trên cơ sở các loài địa phương. Chẩn đoán bệnh ở thủy sản Nắm vững nguyên tắc của các kỹ thuật Nắm vững nguyên tắc của các kỹ thuật đoán và cách đọc kết quả một cách chuẩn đoán và cách đọc kết quả một cách chuẩn xác có ý nghĩa rất quan trọng. xác có ý nghĩa rất quan trọng. Chẩn đoán bệnh ở thủy sản Sự đồng nhất trong thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu 1. thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến kết quả của các phép chẩn đoán bệnh 2. thời gian thu mẫu, khoảng cách giữa các lần thu mẫu, phương pháp cố định mẫu, nhiệt độ bảo quản mẫu, chất lượng của môi trường phân lập, thời gian sử dụng của các dung dịch hoá chất sau khi chuẩn bị, vv, cần được cân nhắc trong quá trình phân tích mẫu. 3. số lần mẫu được đông lạnh rồi rả đông cũng ảnh hưởng đến kết quả phân tích → Giữa các phòng thí nghiệm và các phép phân tích được sử dụng phải đồng nhất thì kết quả đạt được mới có ý nghĩa về mặt so sánh. Các vấn đề khác Cần phải thiết lập những giá trị giới hạn cho những phép phân tích mà kết quả thu được có tính định lượng để xác định kết quả âm tính và dương tính. Giá trị giới hạn này sẽ ảnh hưởng đến kết quả âm tính và dương tính giả cũng như kết quả âm và dương tính thật. Tính hiệu lực của phương pháp Một phương pháp phân tích có tính hiệu lực là phương pháp có thể cho ra kết quả phân biệt rỏ ràng giữ kết quả dương tính và âm tính hoặc giữa cá thể bị nhiễm bệnh và không bị nhiệm bệnh. Tính hiệu lực của phương phá biểu hiệu qua hai đặc điểm: – Tính nhạy (khả năng xác định chính xác mẫu có nhiễm hay không) – Tính chuyên biệt (khả năng phát hiện mẫu không có nhiễm bệnh) Tính hiệu lực của phương pháp được xác định bằng cách so sánh các cá thể cùng loài trong cùng một mẫu. Trong trường hợp khác kết quả phải được kiểm định bằng các kỹ thuật mô học. Tính ổn định của phương pháp Một phương pháp được gọi là ổn định khi phương pháp đó cho ra kết quả tin cậy và giống nhau sau nhiều lần lập lại. Hai yếu tố quyết định cho tính ổn định của phương pháp là: - biến động giữa các cá thể phân tích - biến động giữa các lần đọc kết quả Kary Mullis Giải Nobel hóa học (1993) POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) PCR là phương pháp khuếch đại nhanh và nhạy có chọn lọc môt trình tự DNA/RNA nhất định từ một mạch khuôn axit nucleic Phương pháp PCR là gì? Nguyên tắc  Tất cả các ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt (một mồi xuôi và một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen). Mồi là những đoạn ADN ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và ADN polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN thì chỉ đoạn ADN nằm giữa hai mồi được tồng hợp. Hai mồi này gồm mồi xuôi và mồi ngược theo chiều phiên mã gen. PCR.EXE [...]... bản • PCR 2 bước (PCR tổ-Nested PCR) : sử dụng hai cặp mồi • PCR phức (Multiplex PCR) : khuếch đại đồng thời hai hay nhiều đoạn DNA mục tiêu trong một mẫu • PCR phiên mã ngược (RT -PCR) : định tính biểu hiện gen hoặc phát hiện vi-rút RNA • PCR thời gian thật (RealTime PCR) Nested PCR Mồi F1 Mạch khuôn Mồi R1 Mồi F2 Sản phẩm PCR thứ nhất Mồi R2 Sản phẩm PCR tổ Ưu và khuyết điểm của nested -PCR • Tăng tính... (do sử dụng 2 cặp mồi) • Tăng độ nhạy (khuếch đại 2 lần) • Sử dụng để phát hiện sinh vật hiện diện ở mức thấp Rủi ro do ngoại nhiễm cao Multiplex PCR • Phương pháp phát hiện nhanh cùng lúc nhiều đoạn AND trong cùng một phản ứng • Hổn hợp PCR có nhiều cặp mồi – Từ nhiều sinh vật – Từ nhiều gen của cùng một sinh vật • Ưu điểm quan trọng là giảm thời gian phân tích mẫu Multiplex PCR Multiplex PCR of WSSV... của phản ứng (PCR mix) 4 Khuếch đại bằng máy chu kỳ nhiệt 5 Điện di 6 Đọc kết quả Đối chứng Một xét nghiệm PCR tiêu chuẩn phải có những đối chứng sau: • Không có ADN/ARN (chung am) phản ứng PCR không có mạch khuôn ADN để kiểm soát trường hợp bị tạp nhiễm • ADN/mRNA của vật chủ: (noi chuan) để chắc chắn axit nucleic mẫu cũng được khuếch đại và mồi không đặc hiêu với hệ gen của vật chủ • Đối chứng dương:... gen của vật chủ • Đối chứng dương: phản ứng PCR có mạch khuôn ADN đặc hiệu với mồi Giếng 1-2 là sản phẩm khuếch đại bước 1 Giếng 4 là mẫu đối chứng dương Giếng 5, 6 và 7 là những mẫu dương tính với WSSV Giếng 8 là mẫu đối chứng âm Quy trình chẩn đoán bệnh vi-rút đốm trắng trên các loài thuộc họ tôm He bằng kỹ thuật PCR tiêu chuẩn ngành (28 TCN202:2004) do Bộ Thủy sản ban hành năm 2004 (nguồn: http://www.fistenet.gov.vn/standard.asp)... đoạn của PCR Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là ở 92-95 oC trong vòng 30 giây đến 1 phút Giai đoạn lai (hybridization): Nhiệt độ dược hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với khuôn Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động. .. Nguyên lý của RT -PCR AAAAAA 3’ TTTTTT mRNA 5’ Tổng hợp mạch cDNA thứ nhất Reverse transcriptase AAAAAA TTTTTT mRNA 5’ 1st stranded cDNA 3’ 3’ 5’ RNaseH Cắt mạch khuôn RNA AAAAAA TTTTTT 5’ 3’ 3’ 5’ DNA polymerase Tổng hợp mạch cDNA thứ 2 AAAAAA TTTTTT 5’ 3’ Double stranded cDNA 3’ 5’ Phương pháp PCR bao gồm các bước: 2 Ly trích DNA/RNA từ vật chủ để sử dụng làm mạch khuôn 3 Chuẩn bị các thành phần của. .. theo lý thuyết 1013 10 Sản phẩm thực tế 11 109 107 105 “Exponential phase” 0 10 20 “Plateau phase” 30 Số chu kỳ 40 50 60 Tối ưu hóa PCR • DNA template concentration – Hàm lượng: 5-100 ng – Tinh sạch • • • • • Nồng độ MgCl2 : 1.0 - 6.0 mM Taq DNA polymerase: 1-5 units Nhiệt độ lai Số chu kỳ PCR: 25-40 cycles Thể tích PCR: 13-100 µl Các dạng PCR • PCR một bước (one steo PCR) : thao tác cơ bản • PCR 2... này dao động trong khoảng 37-65 oC tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1phút Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (extension): Nhiệt độ được tăng lên đến 70-72 oC giúp cho ADN polymerase hoạt động tốt nhất Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút   Chu kỳ gồm ba giai đoạn nói trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần... sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng gấp đôi lượng ADN của lần trước Sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với lượng bản mẫu ban đầu PCR. EXE Giai đoạn Biến tính 90 80 70 60 50 40 Giai đoạn lai 90 80 70 60 50 40 Giai đoạn kéo dài 90 80 70 60 50 40 Sản phẩm PCR đầu tiên Khuếch đại trình tự mong muốn Thành phần của PCR • • • • Mạch khuôn (template) Mồi (Primers) dNTPs: dATP, dCTP, dGTP... DNA) • PCR buffer (dung dịch PCR) : có chứa Mg2+ cần cho hoạt động của men DNA polymerase CD Mạch khuôn • • • • Hệ gen DNA Hệ gen RNA, mRNA Máu (huyết tương) Các mô cơ thể (i.e nơi bị nhiễm) Thiết kế mồi • Mồi thường được thiết kế có trình tự bổ sung với mạch khuộn DNA • Chiều dài đoạn mồi khoảng 20-30 nt 3’ T A C A G A T G T C 5’ • Nhiệt độ nóng chảy khoảng 55-65°C và tương thích giữa mồi xuôi và mồi . Nguyên lý và ứng dụng của phương pháp PCR trong phát hiện và chẩn đoán bệnh ở động vật thủy sản Kết quả chẩn đoán bệnh phụ thuộc rất lớn vào: 2. tính sẵn có của phương pháp chẩn đoán. áp dụng ở phòng thí nghiệm 3. lảnh vực nghiên cứu của người chẩn đoán 4. những phép chẩn đoán được phát triển trên cơ sở các loài địa phương. Chẩn đoán bệnh ở thủy sản Nắm vững nguyên tắc của. thủy sản Sự đồng nhất trong thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu 1. thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến kết quả của các phép chẩn đoán bệnh 2.