PHẦN I. ĐẶT VẤN ĐỀ Sinh học là môn khoa học thực nghiệm. Hầu hết các hiện tượng, khái niệm, quy luật, quá trình trong Sinh học đều bắt nguồn từ thực tiễn. Thực hành là mô hình đại diện cho hiện thực khách quan, là cơ sở xuất phát cho quá trình nhận thức của học sinh. Thực hành không chỉ để củng cố kiến thức lý thuyết mà thông qua các bài thực hành có tác dụng rèn luyện kỹ năng, thao tác, khả năng vận dụng lý thuyết vào thực tế, phát huy tính sáng tạo và óc tìm tòi của người học. Thực hành phần nào đó diễn đạt những nội dung khó, phức tạp từ đó giúp HS dễ dàng nhận thức và khắc sâu được kiến thức trong quá trình học tập. Nhận thức sâu sắc về vai trò của thực hành, trong quá trình dạy học tôi đã tích cực đưa thực hành vào giảng dạy và mang lại hiệu quả thiết thực. Tuy nhiên khi giảng dạy: Bài 31 thực hành quan sát các kỳ nguyên phân qua tiêu bản tạm thời hay cố định (Sinh học 10 nâng cao) tại trường THPT Ba Đình, bản thân tôi thấy gặp phải những khó khăn sau đây: - Các tiêu bản cố định về các kỳ nguyên phân được cấp về trường do bảo quản không tốt nên chất lượng quan sát đã bị giảm hoặc đã bị hỏng. - Chưa có tư liệu hướng dẫn cách pha chế thuốc nhuộm NST như: cacmin axetic 2% và fuchsin base. - Thời lượng thực hành rất hạn hẹp gói gọn trong 45 phút, trong khi thời gian để thực hiện quy trình thực hành làm tiêu bản tạm thời quan sát NST quá lớn. - Quy trình thực hành làm tiêu bản tạm thời quan sát các kỳ nguyên phân được hướng dẫn trong SGK Sinh học 10 nâng cao chưa thật sự cụ thể, gây khó khăn cho tiến trình hướng dẫn thực hành của GV và trực tiếp thực hành của HS, chẳng hạn: + Để có được tiêu bản có tần số tế bào phân chia cao chắc hẳn phải thu rễ vào thời điểm thích hợp. Vậy chưa xác định được thời điểm thu rễ thích hợp? 1 + Nếu chỉ lấy 4-5 rễ hành sử dụng cho thực hành thì quá ít, không thể chủ động được nguồn mẫu. + Sau khi cho rễ vào dung dịch axetocacmin, đun nóng trên đèn cồn trong 6 phút. Thao tác này thường làm cho rễ hành bị chín, khi làm tiêu bản thì tế bào bị nát và không thể quan sát thấy NST. + Sau khi đậy lamen lên mẫu thường xuất hiện bọt khí, gây cản trở hiệu quả quan sát các kỳ phân bào trên tiêu bản qua kính hiển vi. Xuất phát từ yêu cầu lý thuyết và thực tiễn giảng dạy ở trường THPT, tôi tiến hành đề tài: “Làm tiêu bản tạm thời để thực hiện bài thực hành quan sát các kỳ nguyên phân (Bài 31 - SGK Sinh học 10 nâng cao)”. 2 PHẦN II. GIẢI QUYẾT VẤN ĐỀ 1. Chuẩn bị dụng cụ, hoá chất. 1.1. Dụng cụ: Kính hiển vi với các vật kính 10x, 40x, lam kính, lamen, kim mũi mác, lưỡi dao lam, đèn cồn, diêm, cốc thủy tinh, ống Enpendof, cốc thuỷ tinh đun nước sôi, nhiệt kế, đĩa đồng hồ, giấy thấm, panh, cát ẩm, chậu đựng cát ẩm. 1.2. Hóa chất: Dung dịch thuốc nhuộm carmin axetic 2% hoặc fuchsin base, nước cất, HCl 1N, axit axetic, Na 2 SO 3 . * Cách pha thuốc nhuộm carmin axetic 2%: - Đặc tính và tác dụng: Bột màu đỏ, có nguồn gốc động vật, tan trong cồn, axit, nước. Carmin là 1 trong các thuốc nhuộm được dùng phổ biến nhất để nhuộm NST, thường dùng dạng dung dịch 45% axit axetic (dung dịch carmin axetic), vừa có tác dụng nhuộm, vừa có tác dụng cố định. Carmin nhuộm NST thành màu đỏ. - Cách pha dung dịch carmin axetic 2%: + Cân 2g bột carmin, đong 100ml dung dịch axit axetic 45%. + Hòa tan bột carmin vào 100ml axit axetic 45% trong 1 bình cầu, sau đó đun sôi bằng đèn cồn. + Đặt bình cầu trên lưới đun để đảm bảo dung dịch luôn sôi nhẹ, thời gian đun không ít hơn một giờ (nếu có điều kiện đun liên tục trong 24h). Sau đó lấy ra và để nguội ở nhiệt độ phòng rồi tiến hành lọc qua giấy lọc. Dung dịch carmin axetic 2% được bảo quản trong lọ kín màu tối và đặt trong tủ lạnh và dùng dần. * Cách pha thuốc nhuộm fucshin base: - Đặc tính và tác dụng: Bột màu xanh, được dùng để nhuộm tế bào trong các thí nghiệm quan sát NST. Fuchsin nhuộm NST thành màu đỏ tươi. Fucshin base được bán tại các cửa hàng hoá chất trên toàn quốc. - Cách pha: Hòa tan 0,5g fuchsin base trong 100ml nước cất bằng cách đun sôi cách thủy trong khoảng 30’ – 1h. Để nguội dung dịch xuống 55 0 C tiến hành lọc 3 qua giấy lọc. Khi dung dịch lọc nguội khoảng 26 0 C cho vào 0,5g Na 2 SO 3 và 10ml HCl 1N. Đậy kín miệng lọ, bọc kín lọ bằng giấy đen để vào nơi tối, mát trong 24h rồi dùng dần. 2. Chuẩn bị mẫu. Lấy củ hành ta trồng trên môi trường cát ẩm (nên trồng môi trường cát ẩm vì khi thu mẫu, rễ sẽ trong và sáng hơn, không bị thâm), tạo điều kiện thích hợp về ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, chế độ nước… đảm bảo cho củ hành ta phát triển tốt và mô phân sinh đỉnh rễ phân chia mạnh nhất. Nên thu rễ hành ta vào thời điểm sau 3 ngày trồng. Để có tần số tế bào phân chia mạnh ở các kỳ nguyên phân, nên thu rễ hành ta vào khoảng thời gian 8 - 10 giờ sáng trong ngày và chọn những rễ có chiều dài khoảng 1.0-1.5cm. Sau đó dùng dao lam cắt rễ, rửa sạch bằng nước cất và thấm nhanh nước bằng giấy thấm. 3. Làm tiêu bản tạm thời quan sát NST. 3.1. Tiền cố định. Tiền cố định mẫu là làm cho NST co ngắn lại, tăng độ lớn của NST thuận tiện cho quan sát hình thái NST qua các kỳ, đặc biệt là kỳ giữa. Tiền cố định mẫu được tiến hành như sau: Rễ hành ta sau khi thu, rửa sạch → cho vào lọ thuỷ tinh nhỏ có chứa nước → cho vào ngăn lạnh của tủ lạnh ít nhất 3h để NST co ngắn lại và làm cho tế bào chất trong suốt. Phương pháp này không gây độc hại, đơn giản, ít tốn kém. Khi làm thí nghiệm, bước tiền cố định này có thể bỏ qua vì không ảnh hưởng lớn đến hiệu quả thực hành quan sát các kỳ nguyên phân. 3.2. Thủy phân mẫu. Thủy phân mẫu có tác dụng để làm mềm mẫu vật, tạo điều kiện cho các tế bào dễ bung ra khi nén tiêu bản, tế bào trở nên trong suốt hơn, tăng hiệu quả của quá trình nhuộm. Thủy phân rễ hành ta trong HCl 1N tiến hành như sau: Rễ hành ta sau khi rửa sạch bằng nước cất → cho mẫu vào lọ thuỷ tinh hoặc ống Enpendof chứa HCl 1N → đun sôi nước và đo nhiệt kế khoảng 60 0 C → đặt Enpendof 4 chứa mẫu và HCl 1N vào trong khoảng 5 phút → lấy rễ hành rửa sạch HCl bằng nước cất → thấm khô nước trong rễ hành bằng giấy thấm. 3.3. Nhuộm mẫu. Nhuộm mẫu là làm cho NST bắt màu, giúp nhận biết được thể NST của tế bào ở các kỳ phân bào. Có thể nhuộm rễ hành ta bởi 1 trong 2 cách sau: - Nhuộm bằng dunh dịch Fuchsin base: Rễ sau khi thủy phân được rửa nhanh bằng nước cất, thấm khô bằng giấy thấm và nhuộm trong dung dịch Fuchsin khoảng 5 - 10 phút, nếu thấy đỉnh rễ nhuộm màu đỏ thì có thể sử dụng làm tiêu bản. - Nhuộm bằng dung dịch carmin-axetic 2%: Rễ sau khi thu buổi sáng trong ngày có thể không qua thuỷ phân mà tiến hành cho vào dung dịch thuốc nhuộm carmin axetic 2% rồi để qua đêm ở nhiệt độ thường, sáng mai dùng làm tiêu bản. Như vậy, dung dịch carmin axetic 2% đã có axit axetic có tác dụng thuỷ phân mẫu. Sử dụng nhuộm rễ bằng cacmin axetic 2% đơn giản hơn, đỡ mất nhiều thao tác. 3.4. Nén mẫu. Nén mẫu tức là làm cho mẫu dàn đều tế bào và làm bung NST, thuận tiện cho việc quan sát các kỳ phân bào trên kính hiển vi. Quy trình nén mẫu được thực hiện theo trình tự như sau: - Rễ sau khi đã nhuộm được đặt lên lam kính sạch. Dùng dao lam loại bỏ chóp rễ, cắt 1 lát mỏng ở đỉnh rễ bắt màu với thuốc nhuộm (kích thước mẫu được cắt tối đa 1mm) (Hình 1). 5 Hình 1 : Cắt mẫu - Đặt mẫu đã được cắt vào giữa lam kính, nhỏ lên mẫu 1 giọt dung dịch carmin axetic 1% (Hình 2). - Đặt lamen sao cho lamen chạm lên đầu giọt carmin axetic 1% có chứa mẫu, rồi thả lamen xuống sao cho không xuất hiện bọt khí (Hình 3). - Hơ nhẹ tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn trong 5-15 giây để làm mềm mẫu, đuổi bọt khí (nếu có) và có tác dụng nhuộm phụ (Hình 4). - Đặt lam kính vào tờ giấy thấm gập đôi đã chuẩn bị sẵn từ trước. Dùng ngón trỏ và ngón giữa của tay trái đè chặt nửa trên tờ giấy thấm vùng lamen 6 Hình 2: Nhỏ giọt dung dịch carmin axetic 1% lên mẫu Hình 3: Đậy lamen lên mẫu Hình 4: Hơ nhẹ lên ngọn lửa đèn cồn mẫu. Tay phải dùng đầu que diêm gõ đều, thẳng góc, dứt khoát trên lamen tại vị trí có mẫu (Hình 5). - Sau đó, dùng ngón cái của tay phải ép thẳng góc lên lam kính qua tờ giấy thấm để dàn đều tế bào và làm bung NST (Hình 6). 4. Quan sát các kỳ phân bào nguyên phân. Tiêu bản sau khi nén được quan sát trên kính hiển vi quang học thông thường ở vật kính 10x để phát hiện các tế bào có các NST ở các kỳ của quá trình phân bào nguyên phân. Sau đó quan sát trên kính hiển vi với vật kính 40x để nhận dạng được hình thái NST. Các tế bào phân chia có sự xuất hiện các kỳ nguyên phân được dùng để chụp ảnh lưu lại làm tư liệu giảng dạy. Tôi đã sử dụng máy ảnh Canon PowerShot SX120 IS kỹ thuật số 10.0Mp để chụp ảnh tiêu bản NST trên kính hiển vi. 7 Hình 5: Nén mẫu bằng que diêm Hình 6: Nén mẫu bằng tay 5. Những hình ảnh tiêu bản NST ở các kỳ nguyên phân của tế bào rễ hành ta minh hoạ kết quả đạt được. Hình 7: Tiêu bản NST ở các kỳ nguyên phân của tế bào rễ hành (a) kỳ trung gian, (b) kỳ đầu, (c) kỳ giữa, (d) kỳ sau, (g) kỳ cuối. 8 a c g b a c a a d c c c b c PHẦN III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀI HỌC KINH NGHIỆM 1. Kết quả nghiên cứu. Tôi đã sử dụng phương pháp làm tiêu bản tạm thời để giảng dạy bài 31 (Sinh học 10 nâng cao) tại trường THPT Ba Đình Nga Sơn. Thông qua kiểm tra và đánh giá, tôi nhận thấy: - HS học tập rất hào hứng, tham gia tích cực và nghiêm túc trong giờ thực hành. - HS không chỉ phân biệt rõ các kỳ phân bào, củng cố kiến thức lý thuyết đã học rất trừu tượng mà còn được rèn luyện kỹ năng làm tiêu bản tạm thời tế bào rễ hành ta, kỹ năng quan sát tiêu bản, sử dụng kính hiển vi quang học. Đề tài của tôi đã giải quyết được những khó khăn thường mắc phải trong quá trình thực hiện bài thực hành quan sát các kỳ nguyên phân (Bài 31 - Sinh học 10 nâng cao): - Hình ảnh NST ở các kỳ nguyên phân qua tiêu bản tạm thời dễ quan sát, mang lại hiệu quả cao so với các tiêu bản cố định chất lượng kém. - Cách pha chế thuốc nhuộm cacmin axetic 2% và fuchsin base đơn giản, dễ thực hiện. - Quy trình hướng dẫn làm tiêu bản tạm thời đơn giản, dễ làm, rất thuận tiện cho công tác giảng dạy của GV THPT. Sau khi thực hiện thành công, đề tài của tôi đã được nhiều thầy, cô giáo trong trường THPT Ba Đình áp dụng mang lại hiệu quả cao trong giảng dạy. 2. Bài học kinh nghiệm. Do thời lượng thực hành hạn hẹp gói gọn trong 45 phút, vì vậy, một số bước trong quá trình làm tiêu bản, GV cần phải phối hợp với HS chuẩn bị chu đáo trước khi thực hiện bài thực hành trên lớp ở những bước sau: - Chuẩn bị dụng cụ, hoá chất. - Chuẩn bị mẫu. - Tiền cố định. - Thuỷ phân mẫu. - Nhuộm mẫu 9 Với bước nén mẫu, quan sát tiêu bản trên kính hiển vi, GV tổ chức cho HS thực hiện trên lớp. Một số trường THPT chưa đủ đáp ứng với những yêu cầu và mục tiêu của bài thực hành như: Chưa có phòng thí nghiệm cho thực hành môn Sinh, không có hoá chất nhuộm, kính hiển vi có nhưng soi rất mờ hoặc kính hiển vi để lâu ngày không sử dụng và bảo quản không tốt nên bị hỏng thì có thể sử dụng tư liệu “Làm tiêu bản tạm thời quan sát các kỳ nguyên phân” để trình chiếu cho HS trên máy chiếu Projector (Có đĩa CD tư liệu kèm theo). Nga Sơn, ngày 01 tháng 05 năm 2011 Tác giả Mai Văn Thuận 10 . khi thời gian để thực hiện quy trình thực hành làm tiêu bản tạm thời quan sát NST quá lớn. - Quy trình thực hành làm tiêu bản tạm thời quan sát các kỳ nguyên phân được hướng dẫn trong SGK Sinh. sát tiêu bản, sử dụng kính hiển vi quang học. Đề tài của tôi đã giải quyết được những khó khăn thường mắc phải trong quá trình thực hiện bài thực hành quan sát các kỳ nguyên phân (Bài 31 - Sinh. trên tiêu bản qua kính hiển vi. Xuất phát từ yêu cầu lý thuyết và thực tiễn giảng dạy ở trường THPT, tôi tiến hành đề tài: Làm tiêu bản tạm thời để thực hiện bài thực hành quan sát các kỳ nguyên