1          TRƢƠ ̀ NG ĐA ̣ I HO ̣ C KHOA HO ̣ C TƢ ̣ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Loan NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ HIV-1 TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC 2 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Virus gây suy gim min dch  i (Human immunodeficiency virus - HIV) là nguyên nhân chính gây ra hi chng suy gim min dch mc phi  i (AIDS) và là mt trong s nhng virus gây bnh nghiêm trng nht hin nay. HIV bii liên tc v cu trúc và h  kháng li các thuu tr và gây ra t l t vong cao. K t khi xut hin (t ng 60 trii trên hành tinh b nhing 25 trit do các bnh n AIDS  (UNAIDS, 2010). Theo các tài li b, có ít nht hai type -1) và HIV type 2 (HIV-2), n-1 là nguyên nhân chính gây ra AIDS  i trên toàn th gii. Trong chu trình sng ca HIV-1, 3 enzyme reverse transriptase, integrase và protease có vai trò quan trng không th thi        thành virus hoàn chnh. Vì vy, các cht c ch cc nghiên cu, sn xu u tr cho bnh nhân nhiu tr c gi là liu pháp dùng thuc chng retrovirus (antiretroviral drug therapy, gi tt là ART). Trong s 3 enzyme nói trên, protc mã hóa bi gen pol ca virus có cht các -                - t sinh sn nhanh ca HIV  1, có khong 10 triu ht virus m c to ra mi ngày và t l sai sót rt cao ca enzyme reverse transriptase (1/10.000 base)    thu tr. Khi có ART, các chng t bin kháng thuc chn lc và tr thành ch (Hoffmann và tp th, 2007),  (PI)                     3 -  Hin nay, trên th gi   u công trình nghiên c  sn xut protease ca HIV-1 (c gi tt là protease HIV-1)  c t cho thy protease HIV-1 không d c biu hin trong t bào vt ch c tính gây c t c sau biu hing thp, trong mt s ng hp ch có th phát hic bn dch vi các quy trình biu hin, tinh sch gm nhic rt phc tp. Mt khác, các nghiên cu u sn xut protease HIV-1 phân lp t phân nhóm B là phân nhóm HIV ph bin gây bnh  M, Australia c Tây Âu. Trong khi, phn lng hp nhim HIV-1 trên th gii và  Vit Nam không thuc phân nhóm B. Nhng nghiên cu gy s khác nhau v cu trúc ca protease phân nhóm B so vi các phân nhóm khác dn hiu qu u tr thuc c ch protease (PI) và m kháng thuc có th khác nhau.  --       công (Hoffmann  -1 có vai    Vit Nam, protease HIV-1 t các bnh nhân Vit Nam là v còn ít c nghiên cu. Các nghiên cu ch yu tnh nhóm virus gây bnh ch yu  i Vit Nam và tìm ra mt s t bin liên quan kháng thuc. c biu nào v biu hin protease HIV-1 phân lp t các bnh i Vit Nam. “Nhân dòng, biểu hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease từ HIV-1 tại Việt Nam”  ch phm protease HIV-1 tái t hp s dng cho mc và phát 4 trin các cht c ch s nhân lên ca HIV, t phát trin thuc u tr HIV/AIDS. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Phát hin mt s t bin trong gen mã hóa protease HIV-1  i Vit Nam. - Thit lp quy trình hiu qu cho vic biu hin gen mã hóa protease HIV-1  vi khun E. coli và tinh sch protease HIV-1 tái t hp  dng có hot tính. - Nghiên cu mt s tính cht protease HIV-1 và tìm hiu tác dng ca mt s cht c ch   tìm kim và phát trin các PI mi có th ng dng trong u tr HIV/AIDS. 3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài Đối tượng nghiên cứu của đề tài: Gen mã hóa protease HIV-1 t huyt thanh các bnh nhân nhim HIV-1 ti Bnh vin Bnh Nhi Nội dung nghiên cứu của đề tài: - Tinh sch RNA ca HIV-1 và tng hp cDNA ca mt s mu HIV-1 t các bnh nhân nhim HIV-1 ti Vit Nam. - Nhân bc trình t gen mã hóa protease HIV-1 ca các mu virus phân l sai khác v trình t gen mã hóa protease HIV-1 gia các ng bnh nhân nhim HIV-1 so vi trình t ng trên th gii. - Thit k h thu kin biu hin gen mã hóa cho protease HIV-1  E. coli. - Xây dng quy trình tinh sch protease HIV-1 tái t hp. - Nghiên cu mt s a protease HIV-1 tái t hc. - Tìm hiu tác dng c ch ca mt s hp cht tng hp và t nhiên lên protease HIV-1 tái t hp. 4. Địa điểm thực hiện đề tài Các nghiên cu ca luc thc hin ch yu ti Phòng Thí nghim trm Công ngh i hc Khoa hc T i hc Quc gia Hà Ni. 5. Đóng góp mới của đề tài 5 - Công trình nghiên cu có tính h thng t vic nhân bn, nhân dòng và biu hin  E. coli gen mã hóa protease HIV-1 tái t hp thuc chng CRF01_AE ca Vit Nam; thit l tinh sch protease HIV-1 vi hiu sut thu nhi các nghiên cu trên th gii. - u tiên phát hin thy tác dng c ch protease HIV-1 bi axit asiatic, 8-hydroxyquinoline và menadione. 6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài - Cách thc biu hin gen mã hóa protease HIV-1 và tinh sch protease tái t hp to ra trong công trình nghiên cu này có th d dàng c áp d sn xut mt s protease tái t hp khó tan và ch c hiu vi mt s ct nhnh. - Ch phm protease HIV-1 t cho vic tìm kim và phát trin các PI m có th ng du tr bnh nhân HIV/AIDS. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV-1 1.1.1. HIV-1 nguyên nhân của AIDS Virus gây suy gim min dch  i (HIV) lc Montagnier và tp th  Vin Pasteur Paris phân li tên gu là virus liên quan ti viêm hch (LAV) c y ban Quc t thng nht gi tên HIV (Greene, 2007). Cùng thc mt virus mi  t tên là HIVc ca HIV-type 1. Hai lou làm suy gim h thng min dch ca ngt tên chung là HIV. Mc dù HIV-type 2 có mt s m ging vi HIV- cách thc 6 truyn bnh, các hình thc nhim bu tr i nhim HIV-type 2 ít phát sinh bi nhim HIV-type 1 và HIV-type 2 thy ch yu  các vùng ca Châu Phi (Hoffmann và tp th, 2007). Vì vy, HIV- type 1 (HIV-nh AIDS. HIV thuc h retrovirus, là h ng vt. HIV-1 có 3 nhóm chính là M (main), N (new), và O (outlier). Có ti 90% s lây nhim HIV trên toàn th gii thuc ký hiu bng các ch cái A-D, F-H, J, K và nhiu dng tái t hp khác c gi tt là các phân nhóm CRF (circulating recombinant forms). S khác nhau gia phân nhóm này vi phân nhóm khác là  trình t axit amin ca protein v và có th t quá 30%. Phân nhóm B ph bin  M, Tây Âu và Australia; trong khi các phân nhóm không phi nhóm B li phân b  n c phn ln nhi b nhing. S ng ca virus có th thy  vùng Sahara (châu Phi).  Vi-1 phân lp t các bnh nhân nhim HIV-1 ch yu thuc nhóm CRF01_AE, bên cnh t s ít các phân nhóm B, C và các dng tái t hp khác (UNAIDS, 2010; Nguyen và tp th, 2003; Ishizaki và tp th, 2009; Phan và tp th, 2010). Phn ln vic nghiên c tìm ra thuu tr bu da trên phân nhóm B. Tuy nhiên g ng v trình t axit amin gia các ng nghiên cu quan trng kháng thuc PI (Bandaranayake và tp th, 2008). 1.1.2.Tình hình nhiễm HIV-1 i dt thách thc to li vi tin trình phát trin xã hi. Sau 3 thp k phát hi  u tiên là   c phát trin, ng trên toàn th gic bit  khu vc châu n nay va HIV hay thuc cha tr c hiu. Theo   HIV/AIDS     (UNAIDS, 2010), n cu i nhing trên th gii  l hin nhim HIV/AIDc tính cao gp 3 l c tính khong 33,3 tri 7 b ng nhim mi là 2,6 trii và có khong 1,8 triu b       -        1990;      . T 30/9/2010 80.631 tr/AIDS.     ( 2009; UNAIDS, Vietnam)      Theo phân tích ca các chuyên gia, tng s i nhim HIV còn sng vn p t qu cng ch yu: S i mi nhim HIV u vn cao và do kt qu tích cc ca các liu tr kháng virus làm gim s i t vong, kéo dài s si bnh. 1.1.3. Sinh bệnh học của nhiễm HIV-1 1.1.3.1. Cấu trúc hình thể của HIV-1 Trên kính hin t, HIV-1 và HIV-2 có cu trúc gng nhau hoàn toàn. Chúng ch khác nhau  khng ca c tr. C HIV-1 và HIV-u nhân bn trong t u gây bnh  i, mc dù m suy gim min dch do HIV-2 gây ra (Hoffmann và tp th, 2007). HIV-c khong 120 nm, dng cu (hình 1.1). V ngoài ca virus là lp lipid kép vi nhiu protein gc ký hin là Env. Protein Env có phn chc to thành t 3 phân t glycoprotein có khng phân t là 120 kDa (gp120) và phc to thành bi 3 phân t gp41 gn vi nhau to thành các phân t p v ngoài ca virus; gp160 có th c phát hin trong huych huyt ca bnh nhân HIV. Trong quá trình ny chi, virus có th gn thêm các protein t màng ca t bào vt ch vào lp lipoprotein ca virus, ví d các protein HLA lp I và II, hoc các protein k-1 giúp virus gn vào t c gn vào mt trong ca màng lipoprotein. 8 Lõi có dng hình tr c bao bc bi lp capsid to thành t 2.000 bn sao ca protein p24 (Hare, 2006; Hoffmann và tp th, 2007). Hình 1.1. Cấu trúc của một hạt HIV-1 (Hoffmann và tp th, 2007) 1.1.3.2. Tổ chức hệ gen của virus H gen ca HIV-1 nm trong phn lõi ca virus và bao gm hai si RNA (+) i si có chiu dài khong 9,8 kb và có 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau (hình 1.2). So vi các virus khác thuc h retrovirus thì h gen ca HIV-1 phc ti si RNA có 3 gen cu trúc là gag, pol và env;  gag   group-antig    pol  pol  env là env). C a b gen retrovirus -gag-pol-env- long terminal rn lu cùng) là u ca b gen virus, ni vi DNA t bào vt ch sau khi tích hp và không mã hóa cho bt c protein nào ca virus. Các gen gag và env mã hóa cho nucleocapsid và glycoprotein ca màng virus; gen pol mã hóa cho 3 enzyme: reverse transcriptase, integrase và protease. Ngoài ra, HIV-1 còn có 6 gen (vif, vpu, vpr, tat, rev và nef)  vùng RNA 9 kb (Hoffmann và tp th, 2007). 9 Hình 1.2. Cấu tạo hệ gen của HIV-1 (Hoffmann và tập thể, 2007) Hình 1.2. Cấu tạo hệ gen của HIV-1 (Hoffmann và tp th, 2007) 1.1.3.3. Chu trình nhân bản của nhiễm HIV-1 Quá trình nhim HIV-1 ca t bào vt ch bu bng vic gn mt phn virus lên b mt ca t c bu khi protein b mt v gp120 gn vào th th trên b mt t ng hp th th là CD4 có  t bào lympho T hoc có  mt s t i thc bào, bch cu  bào lympho B. Các t bào này có vai trò rt quan trng trong h thng min dch c  ; chúng nhn di  ng và ng các t bào lympho tn công và tiêu dit vi sinh vt l   . S liên k u tiên ca gp120 v l ra v trí khác ct vng th thng là th th chemokine CXCR4 hoc CCR5. Ti gp41 qua th th gn vào màng t -1 ci b lp v lipid t liu di truyn RNA ca nó cùng vi reverse transcriptase vào t bào cht ca t bào vt ch. Nh reverse transcriptase, si RNA cc tng hp thành si DNA b sung (cDNA). Si RNA ca virus kt hp cDNA thành chui RNA/DNA  chui lai này chuyn thành 2 si DNA xon mch th chuyn thành DNA xon d bào và nh enzyme integrase, DNA kép ca viruc chèn vào DNA nhim sc th ca t bào chc hp thành (hay gi là tin virus, phân bit nó vi dng virion) có th tn ti  trng thái tim tàng trong nhiu gi hoc nhic khi tr thành dng hong mà có th không biu hin bnh (Hare, 2006). 10 Quá trình sao chép h gen cc thc hii s u khin phc tp ca mt s protein, bao gm Tat và các yu t sao chép DNA ca t bào. Chính vic gn vt cht di truyn ca virus vào h i cu trúc gen ca t bào vt ch. DNA ca virus s ch th cho t bào sn xut ra RNA ca virus nh c nhân lên, các protein ca c tng hp nh ribosome ca t bào vt ch, chúng di chuyn ra mi ni cht hoc màng t bào, tip theo là quá trình ny chi to thành các virion nm trên màng hoc tách ra khi t bào chi gn vào các t bào lympho T khác. S vn chuyn RNA cc sao chép ra khi nhân ph thuc vào mt s nhân t ca virus và vt ch  c vn chuyi dng vt liu di truyn cho các virion mi hay có th c ni tng phn hoc toàn b nhm tng hp nên nhng protein khác nhau ca virus (Hare, 2006; Hoffmann và tp th, 2007). Hình 1.3. Chu kỳ sống của HIV-1 (Weiss, 2001) Các t bào lympho T CD4 + b nhim có th b git trc tip khi mng lc sn sinh và ny chi t b mt, phá v màng t bào hoc khi các protein và axit amin ca virus có mt bên trong t bào, cn tr s hong ca b máy t bào. Mt khác, các t bào lympho T CD4 + b nhim có th ng Bản sao DNA của HIV [...]... tiên mô tả cấu trúc tinh thể của protease HIV- 1 Từ đó đến nay, nhiều protease HIV- 1 khác nhau đã đƣợc nghiên cứu về chức năng, tính đặc hiệu cơ chất và vị trí gắn của các chất ức chế Cấu trúc của một số phức hợp protease HIV- 1 kháng thuốc với các chất ức chế đặc hiệu cũng đã đƣợc làm sáng tỏ (King và tâ ̣p thể , 2000) Protease HIV- 1 đƣợc mã hóa bởi hệ gen của HIV- 1 và là một protease aspartyl, họ retropepsin... lƣợng protease sau biểu hiện có thể tăng lên và chiếm từ 8 -10 % protein tổng số của tế bào Nghiên cứu cũng cho thấy rằng, protease HIV- 1 tái tổ hợp không thể biểu hiện một cách đơn giản nhƣ các protein tái tổ hợp khác ở vi khuẩn E coli Leuthardt và Roesel (19 93) đã nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch protease HIV- 1 tái tổ hợp bằng hệ thống vector pDS56/3H-3H ở E coli Với hệ thống biểu hiện này, protease. .. và tâ ̣p thể , 19 89; Baum và tâ ̣p thể , 19 90; Cheng và tâ ̣p thể , 2006) Một trong các lý do đƣợc dự đoán là protease HIV- 1 có thể đã thủy phân các protein chức năng của tế bào (Danley và tập thể, 19 89) Phỏng đoán này đặt ra một thách thức cho nghiên cứu biểu hiện protease HIV- 1 ở vi khuẩn Để hạn chế tính độc này, một vài nhóm nghiên cứu đã nhân dòng và biểu hiện protease HIV- 1 bằng cách sử dụng... S-sepharose và pepstatin–agarose) đã thu đƣợc 5 mg protease HIV- 1 từ 10 g tế bào E coli Tuy vậy, kết quả kiểm tra độ sạch trên SDS-PAGE, ngoài protease HIV- 1 vẫn còn lẫn 1 băng protein tạp nhiễm kích thƣớc 14 kDa Ở Việt Nam, protease là một trong số những enzyme đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong những thập kỷ qua và các nghiên cứu chủ yếu là điều tra, tách chiết và nghiên cứu một số tính chất trên đối... thể , 2008) Năm 2008, Bandaranayake đã biểu hiện và tinh sạch chế phẩm protease HIV- 1 tái tổ hợp từ phân nhóm CRF 01_ AE cho nghiên cứu cấu trúc tinh thể của protease trong phức hợp với cơ chất và so sánh với cấu trúc protease HIV- 1 phân nhóm B bằng cách sử dụng quy trình của Rose và tập thể (19 93) Theo quy trình này, protease HIV- 1 đƣợc biểu hiện từ vector pSOD/PR179, sau 3 bƣớc tinh sạch (qua các hệ... quan trọng của protease trong liệu pháp dùng thuốc chống HIV- 1 Một trong các chất ức chế hoạt tính protease HIV- 1 đƣợc phát hiện sớm nhất là pepstatin A - chất ức chế protease aspartyl – làm mất hoạt tính của protease HIV- 1 dẫn đến tạo ra các chủng virus không hoàn chỉnh và không có khả năng nhiễm vào tế bào chủ (Seelmeier và tập thể, 19 88) Cơ chế xúc tác của protease HIV- 1 là tƣơng tự với các protease. .. lực gắn của PI với protease bình thƣờng và protease mang đột biến I50L/A71V Kết quả nghiên cứu cho thấy đột biến I50:A và I50:B (I50 trên hai tiểu đơn vị A và B của protease HIV- 1) nằm giữa vị trí liên kết S1/S2’, S2/S1’ và tƣơng tác với các nhóm P1/P2’ và P2/P1’ trên chất ức chế protease Các nhóm t-butyl của atazanavir tại P2 và P2’ (hình 1. 8) tạo liên kết van der Waals với I50:B và I50:A trên protease. .. nguyên GP 41, GP120 và P24 của HIV 30 ở E coli và bƣớc đầu ứng dụng chúng trong phát hiện kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân bằng kỹ thuật phân tích miễn dich ̣ Tóm lại, mặc dầu đã có khá nhiều công trình nghiên cứu khác nhau ở trong nƣớc về gen và protein của HIV, nhƣng cho đến nay chƣa có công trình nào công bố về biểu hiện, tinh sạch và nghiên cứu tính chất của protease từ HIV- 1 gây nhiễm... phản ứng nhỏ nên lƣợng protease HIV- 1 thu nhận đƣợc sau khi kết thúc quy trình không cao, chƣa đến 10 0 μg protein Mặt khác, nghiên cứu chƣa kiểm tra hoạt tính của protease HIV- 1 thu nhận đƣợc Nhiều nhóm nghiên cứu đã thông báo biểu hiện đƣợc protease HIV- 1 ở E coli bằng cách thiết kế các vector khác nhau Tuy nhiên, tất cả các số liệu đều cho thấy biểu hiện protease HIV- 1 có hoạt tính là gây độc giết... để sản xuất lớn (Taylor và tâ ̣p thể , 19 92) Năm 19 92, Rangwala và tập thể đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình biểu hiện protease HIV- 1 ở vi khuẩn E coli Theo nhóm tác giả này, trình tự gen mã hóa protease HIV- 1 ảnh hƣởng đến mức độ biểu hiện proteae HIV- 1 Nếu dùng thể nhân dòng cDNA, lƣợng protease HIV- 1 biểu hiện thƣờng thấp và chỉ có thể phát hiện đƣợc bằng thẩm tách miễn dịch Vấn đề . Loan NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ HIV-1 TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC 2 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài. hin protease HIV-1 phân lp t các bnh i Vit Nam.  Nhân dòng, biểu hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease từ HIV-1. tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài Đối tượng nghiên cứu của đề tài: Gen mã hóa protease HIV-1 t huyt thanh các bnh nhân nhim HIV-1 ti Bnh vin Bnh Nhi Nội dung nghiên