ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC LÊ HOÀNG ANH PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH, THU NHẬN VÀ LÀM GIÀU ACID DOCOSAHEXAENOIC (DHA) TỪ MỢ CÁ BA SA Pangasius bocourti Sauvage KHÓA LUẬN CỬ NHÂN SINH HỌC NGÀNH SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC ĐỘNG VẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN KIM PHI PHỤNG Thành phố Hồ Chí Minh – 2006 Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Bố Mẹ và gia đình đã chăm sóc, nuôi dưỡng và dạy dỗ để tôi có ngày hôm nay. Cô Nguyễn Kim Phi Phụng và Thầy Phan Kim Ngọc đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này. Quý thầy cô, các anh chị khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên và quý thầy cô, các anh chị, các bạn khoa Hóa học trường Đại họcKhoa học Tự nhiên đã quan tâm, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2006 Lê Hoàng Anh MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG BIỂU iv DANH MỤC SƠ ĐỒ iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v MỞ ĐẦU 1 I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 I.1. Kiến thức tổng quát 3 I.1.1. Giới thiệu về chất béo 3 I.1.2. Giới thiệu về acid béo 4 I.2. Giới thiệu về acid docosahexaenoic (DHA) 5 I.2.1 Tính chất hóa học 5 I.2.2 Nguồn hiện diện 7 I.2.3. Các phương pháp ly trích, cô lập và tinh sạch DHA 8 I.2.3.1. Phương pháp phân đoạn bằng li tâm phân tử 8 I.2.3.2. Phương pháp sắc ký khí định lượng 8 I.2.3.3. Phương pháp sắc ký cột 8 I.2.3.4. Phương pháp CO 2 siêu tới hạn 9 I.2.3.5. Phương pháp trích bằng chất lỏng siêu tới hạn 9 I.2.3.6. Phương pháp bạc nitrate 9 I.2.4. Phương pháp nhận danh DHA 10 I.2.4.1. Phương pháp sắc ký khí, sắc ký khí/khối phổ và sắc ký khí mao dẫn 10 I.2.4.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 10 I.2.4.3. Phương pháp ái lực pha rắn với ion bạc và sắc ký lớp mỏng có chỉnh đổi 10 I.2.4.4. Phương pháp phổ hồng ngoại chuyển dạng Fourier 11 I.2.4.5. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 11 I.2.5. Tác dụng của DHA đối với cơ thể 11 I.2.5.1.Vai trò của acid béo 11 I.2.5.2.Vai trò của DHA 12 I.2.5.2.1. Tác dụng đối với bào thai và trẻ sơ sinh 12 I.2.5.2.2. Tác dụng đối với thị giác và màng tế bào 12 I.2.5.2.3. Tác dụng đối với não 12 I.2.5.2.4. Tác dụng đối với bệnh thấp khớp 13 I.2.5.2.5. DHA và bệnh ung thư 13 I.2.5.2.6. Tác dụng đối với các bệnh tim mạch 13 I.2.5.2.7. Tác dụng đối với huyết áp và hàm lượng lipid trong huyết tương 14 I.3. Các phương pháp tiến hành trong thí nghiệm 15 I.3.1. Phương pháp thủy giải 15 I.3.2. Sắc ký lớp mỏng 16 I.3.3. Sử dụng phương pháp tủa urê để loại bỏ các acid béo bão hòa 17 I.3.3.1. Giới thiệu 17 I.3.3.2. Phương pháp tiến hành 18 I.3.4.Phương pháp sắc ký ghép khối phổ 18 I.3.4.1. Nguyên tắc hoạt động 18 I.3.4.2. Sơ đồ thiết bị GC/MS 18 I.4. Giới thiệu về cá ba sa Việt Nam (Pangasius bocourti SAUVAGE, 1880) 19 I.4.1. Các đặc điểm chính 19 I.4.2. Phân loại 20 I.4.3. Thành phần acid béo trong mỡ cá ba sa Việt Nam 20 II. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 22 II.1. Vật liệu 23 II.1.1. Đối tượng nghiên cứu 23 II.1.2. Dụng cụ - thiết bị - hóa chất 24 II.1.2.1. Dụng cụ 24 II.1.2.2. Thiết bị 24 II.1.2.3. Hoá chất 24 II.2. Phương pháp 24 II.2.1. Bố trí thí nghiệm 24 II.2.2. Chuẩn bị mẫu 25 II.2.3. Phương pháp thủy giải 25 II.2.4. Sắc ký lớp mỏng 25 II.2.5. Phương pháp tủa urê 25 II.2.6. Phương pháp sắc ký ghép khối phổ 26 II.2.6.1.Phương pháp ester hóa acid hữu cơ 26 II.2.6.2. Phương pháp sắc ký ghép khối phổ 26 III. KẾT QUẢ -THẢO LUẬN 33 III.1. Kết quả phương pháp thủy giải 34 III.1.1. Ảnh hưởng của thời gian lên phản ứng thủy giải 34 III.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol lên phản ứng thủy giải 34 III.1.3. Ảnh hưởng của dung môi hòa tan lên phản ứng thủy giải 34 III.1.4. Mô tả thí nghiệm 35 III.1.5. Nhận xét 35 III.2. Kết quả phương pháp tủa urê 36 III.2.1. Mô tả thí nghiệm 36 III.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ urê/acid béo (w:w) lên phản ứng 36 III.2.3. Nhận xét 37 III.3 Khảo sát hàm lượng DHA có trong dầu béo A 1 37 III.4. So sánh với kết quả thu được của các tác giả khác 40 III.4.1. So sánh với các kết quả đạt được bởi các tác giả : PGS.TS. Hoàng Đức Như, Huỳnh Kiến Thành, Nguyễn Thị Bích Liên và Mai Thị Diệu Thảo 40 III.4.2. So sánh với kết quả đạt được của Phạm Thị Anh 41 III.4.2.1. Phương pháp thực hiện 41 III.4.2.2. Kết quả 42 IV. KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 44 IV.1. Kết luận 45 IV.2. Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU Trang Bảng I.1. Các acid béo thường gặp 6 Bảng I.2. Thành phần tương đối của các acid béo có trong mỡ cá ba sa thô 21 Bảng III.1. Ảnh hưởng của thời gian lên phản ứng thủy giải 34 Bảng III.2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol lên phản ứng thủy giải 34 Bảng III.3. Ảnh hưởng của dung môi hòa tan lên phản ứng thủy giải 35 Bảng III.4. Hiệu suất phản ứng thủy giải ở điều kiện tối ưu 35 Bảng III.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ của urê/acid béo lên phản ứng tủa urê 36 Bảng III.6. Hiệu suất phản ứng tủa urê 37 Bảng III.7. Kết quả sắc ký khí ghép khối phổ của acid béo methyl ester A 2 39 Bảng III.8. So sánh thành phần một số acid béo quan trọng có trong mẫu thí nghiệm với thành phần acid béo thu được từ mỡ cá ba sa của PGS.TS. Hoàng Đức Như, Huỳnh Kiến Thành, Nguyễn Thị Bích Liên và Mai Thị Diệu Thảo 40 Bảng III.9. So sánh hàm lượng các acid béo chủ yếu trong mẫu thí nghiệm với mẫu của Phạm Thị Anh 42 Bảng IV. So sánh thành phần một số acid béo thiết yếu trong mỡ cá ba sa có hoặc không có xử lý 45 DANH MỤC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ I.1. Sự chuyển hóa của các acid béo omega-3 trong cơ thể 7 Sơ đồ II.1. Công nghệ tách chiết mỡ lỏng từ mỡ cá ba sa 23 Sơ đồ II.2. Các bước tiến hành phản ứng xà phòng hóa 27 Sơ đồ II.3. Các bước tiến hành để làm giàu DHA 28 Sơ đồ II.4. Các bước tiến hành ester hóa mẫu acid béo thu được sau khi tủa urê 29 Sơ đồ II.5. Các bước chuẩn bị và tiến hành sắc ký lớp mỏng 30 Sơ đồ III. So sánh các bước cơ bản của 2 tiến trình thí nghiệm 41 DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình I.1. Cấu trúc cis- và trans- 4 Hình I.2. Acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic 5 Hình I.3. Cấu trúc không gian của acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic 5 Hình I.4. Hoạt động cấp phân tử của các acid béo omega-3 14 Hình I.5. Sự di chuyển điện tử của chất béo trong quá trình xà phòng hóa 16 Hình I.6. Mô hình máy GC/MS 18 Hình I.7. Cá ba sa (Pangasius bocourti SAUVAGE, 1880) 20 Hình II.1. Quá trình thủy giải dầu cá ba sa (đun hoàn lưu + khuấy từ) 31 Hình II.2. Đun dung dịch xà phòng trong môi trường acid để thu acid béo 31 Hình II.3. Hỗn hợp acid béo bão hòa và bất bão hòa thu được sau khi xà phòng hóa 31 Hình II.4. Lóng để thu lớp ether dầu hỏa chứa acid béo bất bão hòa 31 Hình II.5. Acid béo bất bão hòa trong ether dầu hỏa 32 Hình II.6. Cô quay đuổi dung môi để thu acid béo bão hòa 32 Hình II.7. Acid béo bất bão hòa 32 Hình II.8. Máy GC/MS ở phòng phân tích Hóa lý-Viện Khoa học Công nghệ để phân tích hỗn hợp acid béo bất bão hòa trong mẫu thí nghiệm 32 Hình III.1. Sắc ký lớp mỏng trong hệ dung môi giải ly benzen:chloroform (8:2) 43 Hình III.2. Sắc ký lớp mỏng trong hệ dung môi giải ly benzen:chloroform (8:2) 43 I.1. KIẾN THỨC TỔNG QUÁT I.1.1. Giới thiệu về chất béo Chất béo (lipid) là một trong những thành phần sinh hóa cơ bản của động thực vật. Các thành phần của thức ăn thường được tập trung nghiên cứu là protein, lipid, glucid và một số vitamin. Trong đó lipid đóng vai trò quan trọng như là nguồn cung cấp năng lượng (8-9 kcal/gam) và các acid béo cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của động vật. Lipid cũng đóng vai trò như là chất vận chuyển vitamin tan trong dầu và sterol. Ngoài ra trong thành phần của lipid có phospholipid và sterol ester tham gia vào quá trình sinh tổng hợp màng tế bào Lipid là một hợp chất hữu cơ có chức năng và thành phần hóa học khác nhau được ly trích từ động và thực vật nhờ các dung môi ether, chloroform, methanol Có nhiều kiểu phân loại lipid, về cơ sở phân loại chủ yếu cũng dựa vào cấu tạo hóa học. Hiện nay có 2 kiểu phân loại chính : • Kiểu 1 : chia làm 2 nhóm lớn (theo Lenindger) [11] Nhóm 1 gọi là lipid phức, thành phần có chứa gốc acid béo trong đó bao gồm acylglyceride, phosphoglyceride, sphingolipid và sáp – hay còn gọi là “nhóm lipid xà phòng hóa được”. Nhóm 2 gọi là lipid đơn, không chứa gốc acid béo trong thành phần, là “nhóm không xà phòng hóa” gồm : terpen, steroid, prostaglandin, vitamin hòa tan trong chất béo. • Kiểu 2 : cũng chia ra 2 nhóm lớn (theo Lê Ngọc Tú, Plenikov) [11] Lipid đơn giản : về cấu tạo nó chỉ là ester của rượu và acid béo, không có thành phần khác tham gia. Ví dụ như glyceride, sáp, steride (cholesterin) là ester của acid béo và rượu đa vòng sterol. Lipid phức tạp : cũng là một ester nhưng khi thủy phân thu được ngoài thành phần chính là rượu, acid béo còn có các thành phần khác như base nitơ, lưu huỳnh, acid phosphoric, glucid… Thuộc về nhóm này có một số nhóm lớn sau : Phospholipid là ester của rượu đa chức với acid béo cao phân tử, trong thành phần còn có các gốc acid phosphoric, base có nitơ (phosphatid) Glycolipid là ester của rượu và acid béo bậc cao, trong cấu tạo còn có glucid (thường là galacto) hay dẫn xuất có nitơ của glucid. Lipoprotein : thành phần tham gia cấu tạo có acid béo, rượu và protein. Chức năng của lipid [11], [37], [41] • Cung cấp năng lượng : lipid là nguồn cung cấp năng lượng tốt nhất cho cơ thể động vật. Lượng calo do lipid cung cấp cao gấp 2 lần glucid và protid. Lipid là chất dự trữ năng lượng cho cơ thể. 1gam lipid cung cấp 9,3 calo trong khi đó 1gam glucid hay protid chỉ cho 4,1 calo. • Hoạt hóa và cấu thành enzyme và hormone : Lipid, đặc biệt là phospholipid có khả năng hoạt hóa enzyme. Ví dụ phosphattidyl choline có khả năng hoạt hóa enzyme glucose-6-phosphatase, Adenogentriphosphatase (ATPase). Lipid là thành phần chính của nhiều hormone steroid. Ngoài ra một số PUFA (polyunsaturated fatty acid – acid béo bất bão hòa đa) là tiền thân của prostaglandin ở tôm cá (prostaglandin là họ acid béo 5 mạch vòng, số lượng rất nhỏ, hoạt động giống như hormone). • Tham gia cấu trúc màng tế bào : Lipid phân cực hay phospholipid có một vai trò rất quan trọng trong dinh dưỡng vì nó tham gia vào cấu trúc của tất cả các màng tế bào. Cấu trúc cơ bản của các màng tế bào này là hai lớp của những phân tử phosphoglyceride trong đó đuôi không phân cực xếp đối diện và chồng với đuôi kỵ nước của một phospholipids và chúng xếp ở giữa màng cơ bản, trong khi hai chiều ưa nước xếp ở mặt ngoài tạo nên hai bề mặt trong và ngoài của màng cơ bản. Trong màng cơ bản những đại phân tử protein sắp xếp xuyên qua màng cơ bản và liên quan đến khả năng vận chuyển những vật liệu qua màng. • Hỗ trợ hấp thu các lipid khác : Phospholipid giữ vai trò quan trọng trong sự vận chuyển và hấp thụ lipid và tham gia vào các quá trình biến dưỡng trung gian trong cơ thể sinh vật. Phospholipid đóng vai trò như chất nhũ tương hóa giúp các acid béo, muối mật và các chất hòa tan trong chất béo gắn vào các hạt micelle nhỏ li ti. Nhờ đặc tính có hai đầu phân cực: kỵ nước và hiếu nước, nên các phospholipid nằm bên ngoài các hạt micelle gắn các sản phẩm thủy phân của lipid vào. Sự vận chuyển các hạt micelle qua màng tế bào nhờ liên kết của các hạt micelle với hai lớp phospholipid của các màng cơ bản nên các sản phẩm thủy phân của lipid được đưa qua màng tế bào và hấp thụ vào hệ bạch huyết. Như vậy, phospholipd có một vai trò quan trọng trong sự hấp thu chất béo. • Vận chuyển các vitamin và một số chất khác : Lipid là dung môi hòa tan các vitamin tan trong trong dầu như A, D, E, K và hydrocarbon. Do đó trong khi hấp thu và vận chuyển trong cơ thể lipid cũng mang theo các chất hòa tan trong lipid. • Chức năng bảo vệ cơ thể : lipid giúp cơ thể chống lại các va đập cơ học, chống lạnh và bảo vệ các cơ quan bên trong. I.1.2. Giới thiệu về acid béo [11], [20] Acid béo là thành phần chính của hầu hết các lipid trong cơ thể cũng như lipid trong thực phẩm. Acid béo là một mạch dài các nguyên tử carbon liên kết với nhau và được bao quanh bởi các nguyên tử hydro. Một phân tử acid bao gồm 2 đầu, đầu alpha là một nhóm carboxyl –COOH, đầu còn lại là đầu omega, là một nhóm methyl –CH 3 . Acid béo được phân loại căn cứ vào những chuỗi mắc nối và mức độ bão hòa với phân tử hydro. Chuỗi mắc nối tùy thuộc vào số lượng carbon trong mỗi chuỗi, thường là số chẵn, thí dụ như C12, C16, C18. Mức độ bão hòa tùy thuộc số lượng nối đôi giữa các phân tử carbon với nhau. Các phân tử carbon nối với nhau bằng nối đơn và carbon được bao bởi hydro thì được gọi là acid béo bão hòa hay acid béo no. Nếu các nguyên tử hydro trong mạch bị thiếu nghĩa là có sự hiện diện của một hay nhiều nối đôi C=C thì acid béo được gọi là acid béo chưa bão hòa hay chưa no. Nếu acid béo có 1 nối đôi giữa các carbon, nó được gọi là bất bão hòa đơn (monounsaturated). Nếu có 2 hay nhiều nối đôi trong phân tử acid béo thì đó là acid béo bất bão hòa đa (polyunsaturated). Với các acid béo chưa no, mỗi liên kết đôi tồn tại hai đồng phân lập thể, dạng cis và trans. Trong tự nhiên, acid béo dạng cis là phổ biến hơn nhưng dạng trans thì lại bền hơn dạng cis cho nên biến đổi dạng cis thành dạng trans dễ dàng hơn từ trans thành cis. C C CH 2 H 2 C H H C C CH 2 H H H 2 C Hình I.1. Cấu trúc cis- và trans- Vị trí của các nối đôi trong chuỗi carbon của acid béo bất bão hòa đa tạo nên sự khác biệt lớn trong việc cơ thể con người chuyển hóa chúng. Chúng ta có thể kể ra một số dạng chính như sau: nếu nối đôi đầu tiên nằm cách 3 carbon so với đầu omega (methyl) của acid béo thì đó là acid béo omega-3 (Ω-3), tương tự với cách quy ước như thế ta có acid béo Ω-6 và acid béo Ω-9. Các tế bào của cơ thể của con người chỉ có thể tạo nối đôi C=C trong acid béo kể từ carbon thứ 9 trở đi. Điều này có nghĩa là cơ thể con người không thể tự tổng hợp được acid béo Ω-3 và Ω-6. Do đó 2 loại acid béo này chỉ có thể được lấy qua chế độ ăn hàng ngày. Các phân tử acid béo bão hòa có mạch thẳng, thường dễ gắn chặt với nhau. Ngược lại các phân tử acid béo bất bão hòa có cấu tạo lệch do đó chỉ gắn với nhau một cách lỏng lẻo và dễ bị phá vỡ bởi nhiệt hơn các acid béo bão hòa. Vì vậy các chất béo giàu acid béo bão hòa có nhiệt độ tan chảy thấp hơn các chất béo giàu acid béo bão hòa (đặc biệt là các acid béo có chuỗi carbon dài hơn 12 carbon). Hầu hết các chất béo chứa nhiều acid béo bão hòa, như mỡ động vật, tồn tại dưới dạng rắn ở nhiệt độ thường, trong khi các chất béo chứa nhiều acid béo bất bão hòa hơn thì tồn tại ở dạng bán rắn hoặc dạng lỏng tùy theo hàm lượng của acid béo bất bão hòa trong chất béo. Các loại acid béo thường gặp được trình bày ở bảng I.1. I.2. GIỚI THIỆU VỀ ACID DOCOSAHEXAENOIC (DHA) I.2.1 Tính chất hóa học [35] Acid docosahexaenoic (DHA) là một acid béo bất bão hòa đa thuộc nhóm Ω-3. DHA chứa 22 nguyên tử carbon và 6 nối đôi, có công thức tổng quát là : CH 3 (CH 2 -CH=CH) 6 (CH 2 ) 2 COOH Trọng lượng phân tử của DHA là 328,6 và điểm nóng chảy là -44 0 C. DHA còn được kí hiệu là 22:6n-3 và trong tự nhiên có dạng acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic. Hình I.2. Acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic [48] Hình I.3. Cấu trúc không gian của acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic [29] Bảng I.1. Các acid béo thường gặp [42] Những acid béo có nguồn gốc từ động thực vật quen thuộc Danh pháp hệ thống Danh pháp thông dụng Số carbon Acid béo bão hòa ethanoic acetic 2:0 butanoic butyric 4:0 hexanoic caproic 6:0 octanoic caprylic 8:0 decanoic capric 10:0 dodecanoic lauric 12:0 tetradecanoic myristic 14:0 hexadecanoic palmitic 16:0 octadecanoic stearic 18:0 eicosanoic arachidic 20:0 docosanoic behenic 22:0 Acid béo bất bão hòa đơn cis-9-hexadecenoic palmitoleic 16:1(n-7) cis-6-octadecenoic petroselinic 18:1(n-12) cis-9-octadecenoic oleic 18:1(n-9) cis-11-octadecenoic cis-vaccenic 18:1(n-7) cis-13-docosenoic erucic 22:1(n-9) cis-15-tetracosenoic nervonic 24:1(n-9) Acid béo bất bão hòa đa* 9,12-octadecadienoic linoleic 18:2(n-6) 6,9,12-octadecatrienoic γ-linolenic 18:3(n-6) 9,12,15-octadecatrienoic α-linolenic 18:3(n-3) 5,8,11,14-eicosatetraenoic arachidonic 20:4(n-6) 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic EPA 20:5(n-3) 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic DHA 22:6(n-3) Ghi chú: • Trong cách viết ký hiệu của acid béo, số thứ nhất biểu thị số carbon, số thứ hai biểu thị số nối đôi và n- chỉ nhóm của acid béo bất bão hòa. • * Tất cả liên kết đôi đều ở dạng cis- Sơ đồ I.1. Sự chuyển hóa của các acid béo omega-3 trong cơ thể [53] I.2.2 Nguồn hiện diện [47] DHA được tìm thấy nhiều ở cá, đặc biệt là các loại cá béo, chứa nhiều mỡ và dầu như cá trích, cá thu, cá mòi, cá hồi, cá ngừ, cá tuyết và các loại cá da trơn. Vài loại thực vật nhất định bao gồm dầu đậu nành và dầu cải cũng chứa tiền chất của DHA là α-linolenic acid [36] . Ngoài ra, DHA cũng là một trong những acid béo chính trong thành phần acid béo của một số loài vi nấm sống ở biển như Tharaustochytrium roseum, T. aureum và Schizochytrium aggeratum. [14] Hiện nay, dầu cá là nguồn thu nhận DHA chủ yếu, nhưng DHA cũng có thể được sản xuất bằng cách sử dụng vi sinh vật. Các vi sinh vật biển có thể chứa một lượng lớn DHA và được xem như là nguồn thu nhận hiệu quả của acid béo quan trọng này. Vài loài trong đó có thể tăng trưởng theo lối dị dưỡng trên những chất nền hữu cơ ở điều kiện không có ánh sáng (như vi tảo Crypthecodinium cohnii). Gần đây đã có nhiều tiến bộ trong việc sản xuất DHA trong công nghệ sinh học từ các vi sinh vật biển. I.2.3. Các phương pháp ly trích, cô lập và tinh sạch DHA I.2.3.1. Phương pháp tách phân đoạn bằng li tâm phân tử (molecular centrifugal) [25] Acid béo của dầu cá mòi (10% DHA) được phân chia thành những phân đoạn bằng ly tâm phân tử cho đến khi được những phân đoạn chứa 5, 11, 20, 21 và 30%. Phân đoạn cuối cùng được khuấy với urê trong MeOH ở 45 0 C, làm lạnh trong 18 giờ ở 16 0 C, lọc, nước lọc cho tiếp xúc với nhiều urê hơn, làm lạnh ở 13 0 C qua α- linolenic acid (ALA, C18:3) Stearidonic acid (C18:4) ∆-6-desaturase 8,11,14,17-eicosatetraenoic acid (C20:4) 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid (EPA, C20:5) 7,10,13,16,19-docosapentaenoic acid (DPA, C22:5) 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid (DHA, C22:6) elongase ∆-5-desaturase ∆-4-desaturase lipoxygenase cycloxygenase leukotrienes prostaglandins thromboxanes elongase đêm, lọc, nước lọc được cô đặc và tái xử lý với urê. Nước lọc cuối cùng được rót vào nước, dung dịch nước này được trích ly với ether, , làm khan dung dịch eter với Na 2 SO 4 và dung môi được loại bỏ. Sản phẩm bây giờ chứa 88% DHA, và được làm tinh khiết hơn bằng cách chuyển thành methyl ester, đi qua silica gel, giải li bằng dung môi ether dầu hỏa, và loại bỏ những tạp chất còn dư bởi sự chưng cất phân tử. I.2.3.2. Phương pháp sắc ký khí định lượng (preparative scale gas chromatography) [23] Dầu gan cá tuyết chứa 3 loại acid béo không bão hòa cần thiết (C18:4, C20:5, C22:6) được xà phòng hóa, và acid được tìm thấy có giá trị iode là 205. Phổ UV cho thấy sự hiện diện của 0,11% nối đôi liên hợp và 0,07% nối ba liên hợp, những đồng phân khác không hiện diện. Từ 200g dầu, polyenoic ester được cô đặc bằng phương pháp urê – MeOH và hydro hóa để cho 36,5g các acid có giá trị iode 401. Hỗn hợp này được ester hóa với MeOH-H 2 SO 4 và hỗn hợp ester qua sắc kí cho thấy có chứa 11% C18:4; 32,6% C20:5 và 49,7% C22:6 trong khi phổ UV cho thấy 1,5% nối đôi tiếp cách. Sắc ký định lượng được tiến hành trên cột cao 5 feet được nhồi bằng 5% Apiezon trên Chromosorb G. Dòng khí N là 150ml/phút. Nhiệt độ cột và ống góp (collector) là 225 0 C. Phân đoạn thu được có thể được làm tinh sạch hơn bằng sắc ký cột. I.2.3.3. Phương pháp sắc ký cột (column chromatography) [52] Các acid béo bất bão hòa (C ≥ 16) và những dẫn xuất của chúng được tách bởi sắc ký cột sử dụng CO 2 siêu tới hạn hoặc CO 2 lỏng như là pha động và oxide nhôm đã xử lý với kiềm như là pha tĩnh. Phosphate kim loại cũng được sử dụng như là tác nhân tách chiết các acid béo bất bão hòa và các chất tương đồng của chúng. Các tác nhân tách chiết bao gồm các muối phosphoric acid với Ag (và các kim loại khác). Hỗn hợp chứa ethyl eicosapentaenoate và ethyl docosahexaenoate được đưa lên sắc ký cột silica gel phủ Ag phosphate và cột được giải li với hỗn hợp n-hexane và n-hexane-isopropanol để thu nhận lượng ester. Phương pháp sắc ký cột ion bạc cũng được dùng để thay thế cho việc trích pha rắn để tách các acid béo methyl ester. Cột trích pha rắn loại Bond Elut SCX (0.5g propylbenzene sulphonic acid) được cân bằng bởi 5ml NaOH 1M, 10ml nước, 5ml HCl 4M, nước cho đến khi đạt pH trung tính và tiếp tục với acetonitrile-nước (10:1). Cột được bọc lại trong cuộn nhôm để tránh ánh sáng. Cột được chuyển sang dạng ion bạc bằng cách cho ngấm kiệt từ từ 1ml dung dịch AgNO 3 (40mg AgNO 3 trong 1ml acetonitrile-nước 10:1). Sau đó cột được giải ly lần lượt với 5ml acetonitrile, 5ml acetone và 10ml dichloromethane. 0,1ml dichloromethane chứa không quá 1mg acid béo methyl ester. Các (hệ) dung môi dùng để giải ly có độ phân cực tăng dần (từ dichloromethane đến acetone-acetonitrile) theo số liên kết đôi của acid béo (từ acid béo bão hòa đến acid béo 6 nối đôi). Sự giải ly tiến hành ở áp suất khí quyển (vận tốc dòng chảy 0,5ml/phút). I.2.3.4. Phương pháp CO 2 siêu tới hạn (supercritical carbon dioxide) [27] CO 2 siêu tới hạn (SC-CO 2 ) là một chất thích hợp để trích ly các chất không phân cực (triacylglycerol). Hiệu quả trong việc sử dụng SC-CO 2 và hỗn hợp ethanol để trích ly và phân đoạn các phospholipid từ trứng cá hồi đã được khảo sát. Sự trích ly được thực hiện ở nhiệt độ 33 0 C và áp suất thấp 17,7MPa để tránh sự oxide hóa các acid béo bất bão hòa đa. Các phospholipid đươc trích ly hiệu quả với 10, 15 hay 20% ethanol trong SC-CO 2 . Lượng phospholipid được trích ly tăng cùng với sự bổ sung ethanol (với hỗn hợp 20% ethanol, có 80% các phospholipid được thu nhận). I.2.3.5. Phương pháp trích bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid extraction – SFE) [22] Các acid béo được trích ly từ cá bằng cách sử dụng một máy đặc biệt gọi là “máy trích CO 2 lỏng siêu tới hạn” (Supercritical Fluid CO 2 Extraction Machine). 3 mức áp suất khác nhau (200, 240 và 280 bar), 3 mức nhiệt độ khác nhau (35, 40 và 45 0 C) và 5 khoảng thời gian khác nhau (60, 120, 180, 240 và 300 phút) được chọn. Điều kiện lý tưởng nhất cho sự trích ly acid béo bất bão hòa đa được xác định là áp suất 280 bar ở nhiệt độ 40 0 C và 300 phút. I.2.3.6 Phương pháp bạc nitrate (silver nitrate method) [21] DHA và các dẫn xuất của nó được cô lập từ hỗn hợp các acid béo bất bão hòa đa từ nguồn tự nhiên bằng phương pháp bạc nitrate. Phương pháp bao gồm sự tính toán lượng bạc nitrate cần để tạo phức với các acid bất bão hòa đa dựa trên số mol nối đôi có trong acid béo bất bão hòa. DHA được tách chiết và tinh sạch từ dầu cá ngừ bằng phương pháp tách chiết nhiệt độ thấp kết hợp với phương pháp kết tinh sắc ký cột Ag + /silica gel hoặc phương pháp riêng lẻ với sắc kí cột Ag + /silica gel. Dung môi giải ly cột là hỗn hợp của aceton (hoặc diethyl ether)-hexane. Một phương pháp khác được sử dụng để tinh sạch hỗn hợp các acid béo methyl ester từ dầu cá hoặc dầu thực vật là phương pháp sắc ký lớp mỏng ion bạc. Các bản mỏng silica gel được nhúng trong 1 phút vào dung dịch bạc nitrate 4% trong methanol-nước (9:1). Sau đó bản mỏng được sấy khô 2 phút dưới ánh sáng mờ trong tủ sấy thông gió và tiếp tục trong 20 phút ở 100 0 C. Chúng được giữ trong 1 hộp được đậy kín ở trong tối. Dung môi giải ly có thể là hexane-diethyl ether (9:1) để tách các acid béo bão hòa, acid béo có 1 nối đôi và acid béo có 2 nối đôi, hoặc là toluen-ethyl acetate (9:1) để tách tất cả các loại acid béo theo độ bất bão hòa. [...]... bằng cách sử dụng lipase Tuy nhiên, phương pháp đơn giản và hiệu quả nhất để thu nhận những PUFA được làm giàu dưới dạng những acid béo tự do từ mỡ cá là phương pháp tủa urê Đây là một phương pháp sử dụng urê để tạo tủa với các acid béo bão hòa, loại bỏ bớt các acid này ra khỏi hỗn hợp acid acid béo ban đầu Phương pháp này dựa trên hiện tượng urê sẽ tạo thành tinh thể (kết tủa) ở nhiệt độ thấp và các acid. .. trình trích ly, cô lập docosahexaenoic acid ( DHA ) từ mỡ cá ba sa Pangasius bocourti Sauvage Đại học khoa học tự nhiên 2005 Nguyễn Thị Bích Liên Khóa luận tốt nghiệp : Ứng dụng phổ hồng ngoại và sắc ký khí để xác định acid béo omega-3 trong cá ba sa Đại học khoa học tự nhiên 2004 Phạm Thị Anh Khóa luận tốt nghiệp : Phương pháp ly trích, thu nhận và làm giàu acid docosahexaenoic (DHA) từ mỡ cá ba sa... nghiên cứu về thành phần các acid béo trong mỡ cá ba sa và nhận thấy rằng mỡ cá ba sa có chứa DHA với một hàm lượng từ khoảng 0,25 – 0,59% - Huỳnh Kiến Thành sử dụng phương pháp sắc ký cột để tách DHA từ mỡ cá ba sa nhưng kết quả vẫn chưa tốt Nguyên nhân có thể vì các acid béo trong mỡ cá ba sa có độ phân cực tương đối gần bằng nhau nên nếu như dùng phương pháp sắc ký cột để thu nhận và cô lập DHA thì tương... 10,10 5,87 - 37 - Nhận xét: - Mỡ cá ba sa có hàm lượng DHA từ khoảng 0,25% - 0,59% - Các acid béo trong mỡ cá ba sa có độ phân cực tương đối gần bằng nhau nên nếu như dùng phương pháp sắc ký cột để thu nhận và cô lập DHA thì tương đối khó khăn do khó xác định được phân đoạn chính xác có DHA - Phương pháp phân tách các acid béo dựa vào việc hạ nhiệt độ xuống thấp từ -200C đến -700C tuy thu được hàm lượng... acid, 22:5n-3) và DHA có thể được xác định bởi phương pháp này I.2.4.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (proton nuclear magnetic resonance spactroscopy – 1H NMR) [24] Bằng cách sử dụng phổ kế 1H NMR 500MHz, các tác giả đã phát triển một phương pháp định lượng cho việc xác định thành phần của DHA trong dầu cá (mg/g), tỷ lệ mol (mol %) của DHA so với toàn bộ các acid béo khác trong dầu cá, ... các số liệu thu được được trình bày ở bảng trên, phương pháp tủa urê cho thấy khả năng vượt trội so với các phương pháp khác trong thu nhận DHA bởi dễ tiến hành và kết quả đạt được là tương đối tốt III.4.2 So sánh với kết quả đạt được của Phạm Thị Anh [5] III.4.2.1 Phương pháp thực hiện Dầu cá ba sa (hàm lượng DHA 0,34%) Dầu cá ba sa (hàm lượng DHA 0,34%) Methyl trans ester hóa với KOH/methanol - thu ... (tạm gọi là mỡ cá ba sa) có hàm lượng DHA là 0,11% Chúng tôi chọn phần dầu cá ba sa để tiến hành thí nghiệm Dầu cá ba sa được cung cấp bởi công ty thủy hải sản An Giang, sử dụng phương pháp thủy giải lipid trong môi trường kiềm đã thu được các acid béo tự do gồm acid béo bão hòa và bất bão hòa (tạm gọi là A) Từ các acid béo tự do A, chúng tôi đã tiến hành quá trình làm giàu DHA bằng phương pháp tủa urê,... Về thu suất dầu cá thu được : với 5g dầu cá ba sa đem thủy giải, thu được 4,65 g acid béo tự do, hiệu suất 93,2% - Về tính chất của sản phẩm acid béo thu được : acid béo tự do thu được ở dạng rắn ở nhiệt độ phòng, điều này chứng tỏ hàm lượng acid béo bão hòa trong hỗn hợp dầu béo thu được là cao Với hệ dung môi giải ly là benzen : chloroform 8:2, bảng sắc ký lớp mỏng của dầu cá ba sa gồm 2 vết, của acid. .. urê để loại bỏ methyl ester acid béo bão hòa Tuy nhiên, phương pháp này vẫn chưa đem lại một kết quả tốt Nguyên nhân có thể là do phản ứng trans-ester là một phản ứng thu n nghịch nên hiệu suất chưa cao - Phương pháp tủa urê để loại bỏ các acid béo bão hòa trong hỗn hợp acid béo tự do là một phương pháp khá hiệu quả trong việc làm giàu DHA trong mỡ cá ba sa Đây là một phương pháp tiến hành khá đơn giản... VỚI KẾT QUẢ THU ĐƯỢC CỦA CÁC TÁC GIẢ KHÁC III.4.1 So sánh với các kết quả đạt được bởi các tác giả : PGS.TS Hoàng Đức Như [12], Huỳnh [3] [4] [6] Kiến Thành , Nguyễn Thị Bích Liên và Mai Thị Diệu Thảo - Hoàng Đức Như đã phân tích thành phần các acid béo trong mỡ cá ba sa - Nguyễn Thị Bích Liên phân tích các thành phần các acid béo trong mỡ cá ba sa - Huỳnh Kiến Thành thực hiện việc thu nhận các phân đoạn . I.2.3.4. Phương pháp CO 2 siêu tới hạn 9 I.2.3.5. Phương pháp trích bằng chất lỏng siêu tới hạn 9 I.2.3.6. Phương pháp bạc nitrate 9 I.2.4. Phương pháp nhận danh DHA 10 I.2.4.1. Phương pháp. dầu như cá trích, cá thu, cá mòi, cá hồi, cá ngừ, cá tuyết và các loại cá da trơn. Vài loại thực vật nhất định bao gồm dầu đậu nành và dầu cải cũng chứa tiền chất của DHA là α-linolenic acid [36] phospholipid được thu nhận) . I.2.3.5. Phương pháp trích bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid extraction – SFE) [22] Các acid béo được trích ly từ cá bằng cách sử dụng một máy