báo cáo quy trình phân tích kháng sinh trong tôm

Thông tin tài liệu

Bộ Giáo Dục và Đào Tạo  Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM Bộ Môn Công Nghệ Hóa Học BÁO CÁO QUY TRÌNH PHÂN TÍCH KHÁNG SINH TRONG TÔM Giáo viên hướng dẫn Nhóm thực hiện: Phùng Võ Cẩm Hồng Bùi Nguyễn Hương Duyên Nguyễn Thanh Duy Đặng Quốc Thái Phạm Anh Thư Trần Nhật Trường Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 02/2012 Muc lục A. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay ngành chăn nuôi thủy sản nước ta phát triển rất mạnh nhất là lĩnh vực nuôi tôm sú ở các tỉnh ven biển, tôm càng xanh ở các tỉnh dồng bằng sông cửu long. Tuy nhiên hiện trạng đang xảy ra là dư lượng thuốc kháng sinh được các nhà máy thức ăn bổ sung vào thức ăn công nghiệp quá nhiều, hậu quả chắc ai cũng biết. Sử dụng thuốc và hóa chất trong nghề nuôi tôm ngày càng tăng do chuyển đổi nhanh chóng từ nuôi quảng canh sang thâm canh. Kết quả điều tra 60 hộ nuôi tôm và người phân phối thuốc và hóa chất ở tỉnh Bạc Liêu và Sóc Trăng thấy có 74 loại thuốc và hóa chất trong đó có 19 loại đang đựơc sử dụng trong nghề nuôi tôm. Một vấn đề lớn còn lại cần phải giải quyết là các nhà sản xuất và người bán lẻ các sản phẩm kháng sinh thường không chú ý tới việc cung cấp cho người nuôi tôm những thông tin chính xác về những sản phẩm của họ. Họ cần phải được bắt buộc cung cấp cho người nuôi những thông tin tốt hơn về hàm lượng, độ an toàn và hiệu quả sử dụng sản phẩm. B. KHÁNG SINH I. ĐỊNH NGHĨA Kháng sinh còn được gọi là trụ sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn. Bảng: Một số loại thuốc kháng sinh thường sử dụng trong nuôi tôm Tên kháng sinh Tên thương mại Enrofloxacin (10) Enroxin và Enrofloxacin Norfloxacin (7) Noracin, Anti – white, Anti – WW và N300 Oxolinic acid (8) Oxolin Sulphamethoxazole + Trimethoprim (4) Dai-Trim và Vi- trim Sulfamid + Trimethoprim (4) Cotrim-Fort, Trimesul và Sulfa-Prim 01 Enrofloxacin + Metronidazole + Colistin (3) Enro DC Enrofloxacin + Gentamycin + Colistin (2) Genrodexacol và EGC-mycine Norfloxacin + Sulfamid + Trimethoprim (2) Anti –V Norfloxacin + Colistin + Gentamycin (2) Norlp-Septryl Sorbitol (2) Sorbitol Ampicillin + Furaltadone + Sulfachlorpuridazin (2) Bioxide for shrimp Sơ đồ cơ chế tác động của chất kháng sinh II. DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH? Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm hiện là vấn đề quan ngại của hầu hết các cơ quan kiểm soát thực phẩm trên thế giới. Một số loại kháng sinh bản thân nó (chloramphenicol, malachite green ) có thể gây ra tác động có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng, một số loại khác như các kháng sinh nhóm nitrofurans qua quá trình trao đổi chất trong cơ thể động vật có thể sinh ra những hợp chất có độc tính cao đối với cơ thể sống. Chính vì vậy những kháng sinh này đã bị cấm sử dụng hoàn toàn trong nuôi trồng và bảo quản thực phẩm Tồn dư kháng sinh trong thực phẩm ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ cộng đồng và môi trường, là một trong những nguyên nhân gây những bệnh hiểm nghèo như ung thư, đột biến gen, quái thai, dị ứng và tăng nguy cơ xuất hiện nguồn gen kháng thuốc ở các chủng vi sinh vật, đặc biệt vi sinh vật gây bệnh Enrofloxacin là chất kháng sinh kháng vi khuẩn ảnh hưởng đến mắt dễ gây khiếm thị. Khi vi khuẩn có được sức đề kháng, người ta khó có khả năng tống khứ được chúng đi bằng thuốc kháng sinh. Hơn nữa, một số thuốc kháng sinh có thể làm cho vi khuẩn tăng sức đề kháng không chỉ với loại kháng sinh đó mà còn với nhiều loại kháng sinh khác nhau. Thêm vào đó, các nguyên tố mã hoá có sức đề kháng có thể di chuyển từ một loài vi khuẩn này sang các loài vi khuẩn khác. Vi khuẩn này có thể gián tiếp trở nên kháng lại một loại kháng sinh mà không cần phải đưa trực tiếp kháng sinh đó vào nó. Một vấn đề quan trọng khác đó là nhiều loại kháng sinh là có hại cho sức khoẻ nghề nghiệp. Hiện nay khi người lao động và nhiều người khác khi xử lý nhiều loại kháng sinh thì phần da để lộ ra ngoài và bụi hít vào từ thuốc bột kháng sinh có thể dẫn đến các vấn đề về sức khoẻ đối với họ. Nhiều loại kháng sinh được sử dụng trong các trại nuôi tôm là có sức sức bền khá cao trong môi trường và có thể lan ra các vùng nước xung quanh qua đường thoát nước, nước thải. Trong môi trường xung quanh chúng có thể thay đổi hệ sinh thái bằng cách thay đổi cấu trúc thông thường của vi khuẩn, và cũng có những ảnh hưởng độc tính rất lớn đối với động vật và thực vật dưới nước. Chúng cũng có thể được các sinh vật hấp thụ, ví dụ như những con vẹm loài thủy sản được nhiều địa phương khai thác và ăn. Ðiều đó có nghĩa là, dư lượng kháng sinh trong thực phẩm không chỉ là một mối đe doạ đối với người tiêu dùng tôm ở những nước nhập khẩu mà còn là một mối đe dọa đối với những người sống trong những vùng nuôi tôm. C. GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHÁNG SINH TRONG TÔM Các phương pháp phân tích sử dụng sắc ký có ghép khối phổ như GC- MS, GC-MS/MS, LC- MS, LC-MS/MS đều đáp ứng được yêu cầu và được các cơ quan thẩm quyền của các nước nhập khẩu chấp nhận. Tuy nhiên những phương pháp này đòi hỏi đầu tư chi phí cao về thiết bị, chi phí vận hành, kỹ năng và trình độ của kiểm nghiệm viên. Do vậy nó không phù hợp cho các phòng kiểm nghiệm qui nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương. Vài năm gân đây, cách tiếp cận mới về phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên-kháng thể (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)) đã trở thành một công cụ khá hữu hiệu và được cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (Screening method). Liên minh châu Âu (Chỉ thị 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư luợng các hóa chất kháng sinh cấm, tuy nhiên có những yêu cầu rất khắt khe về giới hạn phát hiện và độ không đảm bảo đo và các tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả của xét nghiệm. Từ năm 2002 đến nay, phương pháp ELISA đã được sử dụng trong phân tích sàng lọc tại phòng kiểm nghiệm của các Trung tâm Kiểm tra Chất lượng và Thú y Thuỷ sản vùng đối với các chỉ tiêu CAP, AOZ và AMOZ. Tất cả các mẫu phát hiện dương tính trên ELISA được kiểm tra khẳng định trên LC-MS/MS. 2.2.1. Tóm tắt qui trình thử nghiệm Elisa sử dụng trong thực nghiệm a. Kít thử Elisa: Kit thử của các hãng R-Biopharm và TAPB. b. Qui trình chuẩn bị mẫu: Dư lượng CAP trong 3g mẫu đuợc ly trích bằng 6ml ethyl acetate. Dịch chiết đuợc cô đến khô ở 50 o C dưới dòng nitơ. Cặn khô được hoà tan trong 1ml đệm và làm sạch bằng 1ml hexan. Hàm luợng CAP trong dịch chiết đuợc phân tích với kit thử ELISA. c. Qui trình thử nghiệm với ELISA: qui trình xác định hàm lượng CAP trong dịch chiết trên Elisa tuân thủ theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Mỗi loạt thử nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng âm và chứng dương để kiểm soát chất lượng kết quả thử nghiệm. d. Giới hạn phát hiện: 0,1ppb 2.2.2. Tóm tắt qui trình thử nghiệm LC-MS/MS sử dụng trong thực nghiệm Các mẫu phát hiện dương tính trên ELISA (phần 2.2.1) được phân tích khẳng định trên LC- MS/MS theo qui trình tóm tắt như sau: a. Thiết bị: Hệ thống LC-MS/MS: Waters Quattro-micro API (tripple quadrupole, ESI(-) b. Qui trình chuẩn bị m ẫ u: Dư lượng CAP trong 3g mẫu đuợc ly trích bằng 6ml ethyl acetate. Dịch chiết đuợc cô đến khô ở 50 o C dưới dòng nitơ. Cặn khô được hoà tan trong 1ml NaCl 4%, làm sạch sơ bộ bằng 1ml hexan và sau đó được làm tinh sạch bằng cột C18. Hàm luợng CAP trong dịch giải hấp đuợc phân tích trên LC- MS/MS c. Phân tích trên LC-MS/MS: Các thông số chính: LC: Pha động: ACN: H20 (80:20) Tốc độ dòng: 0,3ml Thể tích tiêm:10ul MS/MS: ESI (-) MRM : 321->152 321->194 321->256 326->157 Mỗi loạt thử nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng âm và chứng dương để kiểm soát chất lượng kết quả thử nghiệm. Nội chuẩn CAP-d5 được sử dụng 6 để hạn chế tối đa ảnh hưởng của nền mẫu (biological maxtrices) đối với kết quả phân tích. Ngoài ra, hàng năm phòng kiểm nghiệm đều tham gia các chương trình thử nghiệm thành thạo do FAPAS tổ chức (thuộc Phòng Thí nghiệm Trung tâm của Vương quốc Anh - Central Science Laboratory, UK) và đạt kết quả tốt (Z score < 2). Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi đầu tư chi phí cao về thiết bị, chi phí vận hành, kỹ năng và trình độ của kiểm nghiệm viên. Do vậy nó không phù hợp cho các phòng kiểm nghiệm qui nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương. Vài năm gân đây, cách tiếp cận mới về phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên-kháng thể (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)) đã trở thành một công cụ khá hữu hiệu và được cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (Screening method). Liên minh châu Âu (Chỉ thị 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư luợng các hóa chất kháng sinh cấm, tuy nhiên có những yêu cầu rất khắt khe về giới hạn phát hiện và độ không đảm bảo đo và các tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả của xét nghiệm. D. PHƯƠNG PHÁP ELISA I . GIỚI THIỆU CHUNG ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay_ Xét nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết với enzyme) dựa trên sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu, phản ứng tạo sản phẩm có màu hay phát sáng. Trong đó tính chất họat hóa của enzyme và độ đặc hiệu của kháng thể là không đổi. Kit thử của các hãng R-Biopharm và TAPB II. NGUYÊN TẮC Sử dụng KT đơn dòng (Mabs) phủ bề mặt những đĩa giếng. Nếu có sự hiện diện của KN trong mẫu,KN sẽ tạo phức hợp với KT cố định trên giếng và KT tự do có gắn enzyme tạo thành một phức hợp kép(sandwich).Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng,enzyme xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. 7 III. ỨNG DỤNG Trong thực phẩm ►Phương pháp Elisa có thể phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh. ►Phát hiện độc tố trong tảo. ►Phát hiện vi khuẩn E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus,sán lá gan… trong thực phẩm. ►Phát hiện chất chloramphenicol (chất không được phép có trong tôm, cá và các sản phẩm thuỷ sản khác) ►Kiểm tra dư lượng kháng sinh trong thực phẩm,tàn dư thuốc diệt cỏ,thuốc trừ sâu… Trong y học ►Là một trong các kĩ thuật xét nghiệm HIV nhằm phát hiện kháng nguyên p24. ►Chuẩn đóan và điều trị bệnh viêm gan siêu vi B và C,bệnh ung thư. ►Ứng dụng để phát hiện bệnh A. cantonensis (bệnh viêm màng não) do loại giun kí sinh ở phổi chuột gây ra. ►Xác định tỉ lệ nhiễm kí sinh trùng sốt rét ở miền Trung-Tây Nguyên. IV. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ELISA ĐỂ PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH TRONG TÔM Nhóm QUINOLONE trong tôm tại một số tỉnh ven biển khu vực phía Bắc Dung dịch kháng sinh chuẩn: tất cả 5 kháng sinh thuộc nhóm quinolones được sử dụng trong nghiên cứu này gồm enrofloxacin, flumequin, norfloxacin, 8 Ciprofloxacin và sarafloxacin ở dạng bột và đều là sản phẩm của Sigma- Aldrich (St Louis, MO, USA). Dung dịch gốc 1 mg/ml: hoà tan trong methanol với sự có mặt của NH 4 OH 2M. Dung dịch dùng củng cố mẫu được pha loãng từ dung dịch gốc (1 mg/ml) bằng nước cất. Hỗn hợp methanol/PBS (50/50) pH 7,4 (dung dịch PBS pH 7,4 là hỗn hợp 9 gam NaCl, 7,78 gam Na 2 HPO 4 .2HO và 0,75 gam KH 2 PO 4 pha trong 1 lít nước cất). Kít ELISA phân tích quinolone: 10 bộ kít thuộc 5 lô khác nhau do phòng thí nghiệm Hormonologie - CER, Marloie, Vương quốc Bỉ cung cấp. Cách lấy mẫu Chín mươi mẫu tôm được lấy ngẫu nhiên 6 đợt độc lập vào 6 tháng khác nhau trong năm (tháng 5, 6, 7, 10, 11 và 12 năm 2006) tại các chợ 4 địa phương đại diện gồm Hà Nội, Quảng Ninh, Nam Định và Nghệ An. Mỗi địa phương, mỗi đợt lấy 3 mẫu tại các quầy ở các chợ khác nhau. Riêng Hà Nội, ngoài chợ mẫu còn được lấy ở ba siêu thị. Các mẫu đều có nguồn gốc từ các đầm nuôi ở các địa phương đại diện, riêng mẫu được lấy tại Hà Nội được xác định nguồn gốc từ Quảng Ninh, Hải Phòng và Nam Định. Mẫu sau khi lấy được bảo quản lạnh chuyển về phòng thí nghiệm loại bỏ đầu và vỏ. Sau khi nghiền đồng nhất bằng máy moulinex, mẫu được lưu giữ ở âm 80°C. Tính ổn định của kít được đánh giá qua kết quả phân tích đường chuẩn của 10 bộ kít thuộc 5 lô vào các ngày khác nhau, mỗi nồng độ khi thử trên một bộ kít được lặp lại 2 lần. Đường chuẩn được xây dựng trên cơ sở phân tích 6 dung dịch chuẩn sarafloxacin có nồng độ tương ứng là 0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 và 1,0 ng/ml. Để đánh giá khả năng phát hiện và khả năng ứng dụng của kít trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam, các tham số liên quan đến khả năng phát hiện của phương pháp được đánh giá theo tiêu chuẩn châu Âu. Mỗi kháng sinh thử 20 mẫu trắng (được xem như mẫu thực sự âm tính) và 20 mẫu củng cố các quinolone đại diện ở nồng độ bằng nồng độ giới hạn phát hiện (0,7 ppb). Các tham số độ xác thực và độ mạnh của phương pháp được tính toán theo các công thức sau: 9 Trong đó : N là tổng số mẫu phân tích = N + + N - N + là số mẫu thực sự dương tính (mẫu củng cố) N - là số mẫu thực sự âm tính (mẫu trắng) PA là số mẫu dương tính theo kết quả phân tích trong số N + mẫu FN là số mẫu âm tính theo kết quả phân tích trong số N + mẫu FP là số mẫu dương tính theo kết quả phân tích trong số N - mẫu NA là số mẫu âm tính theo kết quả phân tích trong số N - mẫu 10 [...]... nay hoá chất vào tôm trong khi xử lý bằng kháng sinh - Dùng đúng liều và thời gian chữa trị Không được dùng nhiều hơn hay ít hơn chỉ dẫn - Sử dụng và cất trữ các sản phẩm kháng sinh một cách cẩn thận, xem xét các rủi ro với con người Sử dụng các công cụ và găng tay để tránh da tiếp xúc nếu các loại kháng sinh được trộn với thức ăn - Các loại tôm không nên được điều trị bằng kháng sinh trong ít nhất hai... không được phép có trong thức ăn động vật Cách sử dụng: 13 - Cần nắm được các thông tin chi tiết về tất cả các loại kháng sinh sử dụng - Sử dụng kháng sinh phòng bệnh cần tránh càng xa càng tốt Sử dụng phòng bệnh là nguyên nhân chính sau sự tăng sức đề kháng - Tránh sử dụng lặp lại cùng một loại kháng sinh, để tránh làm tăng độ kháng thuốc - Không được sử dụng nhiều hơn một loại kháng sinh tại cùng một... thực phẩm bị nhiễm quá nhiều thuốc kháng sinh, gây hại cho người tiêu dùng Khi nào nên sử dụng kháng sinh ? - Chỉ sử dụng kháng sinh để xử lý khi nhiễm vi khuẩn, không đýợc sử dụng cho bất kỳ một nguyęn nhân nŕo khác - Kháng sinh không thể chữa trị các bệnh về virút như virút đốm trắng hay bệnh đầu vàng Cần biết rằng một số sản phẩm kháng sinh sẵn có cho người nuôi tôm ở Thái Lan được bán trên thị trường... phương pháp 11 Kết quả phân tích mẫu tôm trên thị trường một số địa phương phía Bắc Kít ELISA của hãng CER Vương quốc Bỉ có khả năng phát hiện tốt các kháng sinh thuộc nhóm quinolone trong tôm ở nồng độ lớn hơn hoặc bằng 0,7 ppb Khả năng phát hiện, hiệu lực của kít trong điều kiện phòng thí nghiêm ở Việt Nam đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp bán định lượng qui định trong Quy t định số 2002/657/CE... Việt Nam và Uỷ ban Châu Âu E KẾT LUẬN Để có thể hạn chế được các chất kháng sinh thì ta phải áp dụng tối đa các biện pháp phòng tránh các chất kháng sinh, mà đặc biệt nhất là cấm sử dụng dư chất kháng sinh trong nuôi trồng gia súc, gia cẩm, thủy hải sản Ngoài ra, phải tăng cường phổ biến thông tin, nâng cao năng lực của người nông dân trong vấn đề chăn nuôi, cũng như ý thức của người nông dân và doanh... không có khả năng để điều trị các bệnh về virut Các loại kháng sinh nên sử dụng: - Sử dụng các loại kháng sinh sạch từ nguồn đáng tin cậy Thông tin về các loại thành phần tác dụng cần được ghi rõ trên nhãn - Phải bảo đảm kháng sinh đạt tiêu chuẩn về dược phẩm Không được sử dụng hoá chất, do chúng có chất lượng kém hơn - Tránh sử dụng các loại kháng sinh được sử dụng điều trị cho người - Không được sử dụng... loại tôm không nên được điều trị bằng kháng sinh trong ít nhất hai tuần trước khi thu hoạch, tốt nhất là lâu hơn để tránh các dư lượng kháng sinh để lại - Nếu tôm không ăn tốt do nhiễm bệnh, cũng không được sử dụng thuốc kháng sinh cùng với thức ăn - Sử dụng kháng sinh tốt nhất nên được giám sát về mặt thú y 14 ... (CE, 2002) Tuy 12 nhiên, muốn định danh loại kháng sinh quinolone và xác định nồng độ chính xác cần phải khẳng định lại bằng các phương pháp khẳng định lý hoá khác Tất cả các địa phương nghiên cứu đều phát hiện mẫu bị nhiễm quinolone với nồng độ dư lượng cao nhất là 145 ppb và thấp nhất là 0,4 ppb (tỷ lệ nhiễm 10%) Trong đó có 4 mẫu không đạt yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm theo qui định của Việt . phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn. Bảng: Một số loại thuốc kháng sinh thường sử dụng trong nuôi tôm Tên kháng sinh. của chất kháng sinh II. DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH? Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm hiện là vấn đề quan ngại của hầu hết các cơ quan kiểm soát thực phẩm trên thế giới. Một số loại kháng sinh bản. chúng đi bằng thuốc kháng sinh. Hơn nữa, một số thuốc kháng sinh có thể làm cho vi khuẩn tăng sức đề kháng không chỉ với loại kháng sinh đó mà còn với nhiều loại kháng sinh khác nhau. Thêm

Ngày đăng: 08/04/2015, 11:08

Xem thêm: báo cáo quy trình phân tích kháng sinh trong tôm