MỘT SỐ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN STIs Nguyễn Phúc Như Hà Đại cương Có rất nhiều phương pháp, nhiều kỹ thuật để phát hiện các tác nhân gây bệnh có khả năng lây truyền qua quan hệ tình dục. Tuỳ thuộc vào điều kiện cơ sở vật chất, trang thiết bị hiện có mà mỗi phòng xét nghiệm có thể triển khai các kỹ thuật đơn giản hay hiện đại. Kỹ thuật Vi sinh chẩn đoán trực tiếp • Kỹ thuật soi tươi trực tiếp có khả năng phát hiện trùng roi âm đạo, nấm men Candida.… • Khảo sát tiêu bản nhuộm Gram nhận định lậu cầu khuẩn, vi khuẩn gây bệnh hạ cam, quần thể vi khuẩn trong viêm âm đạo do vi khuẩn… • Nuôi cấy – Định danh – KSĐ Lậu cầu khuẩn • Nuôi cấy định danh Candida albicans Kỹ thuật Huyết thanh – Miễn dịch • RPR , VDRL, TPHA và FTA trong chẩn đoán Giang mai • Test nhanh, Serodia, ELISA, Western blot và PCR chẩn đoán HIV • Miễn dịch sắc ký (test nhanh) chẩn đoán Chlamydia Kỹ thuật Sinh học phân tử • PCR, multi-PCR, RFLP… xác định và định loại Chlamydia sp, N.gonorrhoeae, Human Papilloma Virus (HPV), Herpes simplex Virus (HSV), HIV… CÁC KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM TRỰC TIẾP CHẨN ĐOÁN STIs KỸ THUẬT SOI TƯƠI 1. Soi tươi bệnh phẩm dịch âm đạo, niêu đạo phát hiện nấm men và trùng roi Trichomonas vaginalis Soi tươi bệnh phẩm dịch âm đạo, niệu đạo có thể phát hiện nấm men, trùng roi Trichomonas vaginalis và nhận định mật độ tế bào âm đạo và bạch cầu. Nấm men và trùng roi âm đạo Trichomonas vaginalis là một trong nhiều nguyên nhân gây tiết dịch và viêm âm đạo, âm hộ ở phụ nữ. Ở nam giới có thể gặp trong các trường hợp viêm niệu đạo tái phát và tồn lưu sau điều trị lậu và chlamydia. 1.1. Lấy bệnh phẩm và làm tiêu bản: - Đặt mỏ vịt, dùng que tăm bông hoặc khuyên cấy lấy dịch âm đạo ở thành âm đạo, cùng đồ âm đạo. Ở nam giới dùng que tăm bông lấy dịch niệu đạo. - Làm tiêu bản: Nhỏ một giọt nước muối sinh lý NaCl 0,9% vô trùng lên lam, nhúng tăm bông hoặc khuyên cấy đã có bệnh phẩm vào giọt nước nước muối, đậy lamen lên giọt bệnh phẩm. 1.2. Nhận định kết quả bằng quan sát trực tiếp: Khảo sát dưới kính hiển vi vật kính x10, x40.  Nấm men: Dưới KHVcó thể thấy dạng tế bào nấm men, hình bầu dục có nảy búp, có hoặc không có sợi tơ nấm giả. Nếu nhuộm Gram tế bào nấm men bắt màu Gram dương.  Trùng roi âm đạo Trichomonas vaginalis: Đây là loại KST đơn bào, di chuyển nhờ chiên mao, sống trong âm đạo. Trùng roi rất di động, hình ảnh di động rất đặc biệt. Hình dạng giống hình quả lê hoặc hạt đậu, có trục ty. Tê´bào chất có nhiều không bào. Có một sinh mao thể, sinh mao thể có 3-5 chiên mao hướng về phía dưới, nhân to nằm gần đầu. H.1. Nấm men và sợi tơ nam H.2: Trichomonas vaginalis 2. Soi tươi bệnh phẩm dịch âm đạo nhận định tế bào bạch cầu và tế bào biểu mô 2.1. Bạch cầu hay tế bào mủ: Khảo sát bằng vật kính X10 ∗ <25 tế bào/VT (+): Bình thường ∗ 25 – 100 tế bào/VT (++): Theo dõi và nhận định kèm các tác nhân khác. ∗ >100 tế bào/VT (+++): Bất thường 2.2. Tế bào biểu mô âm đạo (Squamous cells): ∗ Mật độ tế bào: Nhiều hay ít phụ thuộc vào thời điểm trong chu kỳ kinh nguyệt và tình trạng viêm nhiễm.(H.3) ∗ Tế bào biểu mô âm đạo có biểu hiện khác thường (immature) như xuất hiện các tế bào cận đáy (Parabasal) hiện tượng này có liên quan đến nồng độ nội tiết tố như giảm Oestrogen.(H.4,H.5) H3: Tế bào âm đạo soi tươi đánh giá mật độ H4: Tế bào biểu mô bị li giải còn nhân tự do H5: Các tế bào cận đáy và bạch cầu KỸ THUẬT KHẢO SÁT TIÊU BẢN NHUỘM GRAM Khảo sát tiêu bản nhuộm Gram cho phép nhận định hình dang, cách sắp xếp và tính chất bắt màu gram âm, gram dương của vi khuẩn để định hướng chẩn đoán các tác nhân gây bệnh như: lậu cầu khuẩn, vi khuẩn gây bệnh hạ cam mềm và nhận định tình trạng viêm âm đạo do vi khuẩn … 1. Khảo sát trực tiếp tiêu bản nhuộm Gram chẩn đoán Lậu cầu khuẩn (Neisseria gonorrhoeae) Tuỳ theo biểu hiện lâm sàng, tuổi, giới và chỉ định của bác sỹ, bệnh phẩm được lấy từ chất tiết ở bộ phận sinh dục, lỗ tiểu, hậu môn, mắt… đôi khi ở dịch ngoáy họng, dịch khớp và máu 1.1. Kỹ thuật lấy bệnh phẩm làm phiến phết nhuộm Gram • Dụng cụ: Tăm bông vô trùng, khuyên cấy, mỏ vịt, lam kính… • Đối với phụ nữ: làm ướt mỏ vịt bằng nước ấm, đặt mỏ vịt lấy bệnh phẩm bằng que cấy ở lỗ niệu đạo, lỗ các tuyến Bartholine, Skènes, ống cổ tử cung, dịch cùng đồ, rìa hậu môn là nơi để lấy bệnh phẩm. • Đối với nam giới: nắn dọc niệu đạo để dịch tiết chảy ra, dùng khuyên cay vô trùng lấy sâu vào niệu đạo khoảng 2cm. Cần làm nhẹ nhàng để tránh làm đau bệnh nhân. • Đối với trẻ em viêm kết mạc mắt do lậu lấy bệnh phẩm ở mắt bằng que tăm bông. • Một số trường hợp bệnh phẩm được lấy ở họng. • Phết bệnh phẩm lên lam kính từ khuyên cấy hoặc que tăm bông, để khô tự nhiên, cố định bằng hơi nóng khô qua đèn cồn. • Nhuộm Gram: - Phủ phiến phết bằng dung dịch Crystal Violet, 1 phút - Rửa nước, Phủ dung dịch Glugol, 1 phút. - Tẩy màu bằng cồn acetol cho tới khi giọt cồn không còn màu - Phủ phiến phết bằng dung dịch Safranine , 30 giây. - Rửa nước, để khô tự nhiên 1.2. Nhận định kết qua dưới kính hiển vi vật kính X100 Dười KHV, vi khuẩn hình hat cà phê, đứng thành đôi, gram âm, nằm trong tế bào bạch cầu, đôi lúc nằm ngoài bạch cầu. Khi nhìn thấy những tính chất trên của vi khuẩn chỉ ghi nhận: “Tìm thấy song cầu khuẩn Gram âm, hình hạt cà phê nằm trong tế bào (hay ngoài tế bào) dạng gonocoque” đồng thời ghi nhận thêm sự hiện diện của tế bào mủ và các vi khuẩn khác. Biện luận kết quả: Kết quả nhuộm Gram khảo sát lậu cầu khuẩn có giá trị cao trong trường hợp viêm niệu đạo cấp ở nam giới. Trường hợp viêm niệu đạo biến chứng số lượng lậu cầu thường rất hiếm, không thể xác định chắc chắn nếu chỉ qua kết quả nhuộm Gram, cần thiết làm các chỉ định khác như nuôi cấy hoặc thử nghiệm PCR (Polymerase chain reaction) Ở phụ nữ kết quả nhuộm Gram khảo sát lậu cầu chỉ có giá trị trong các trường hợp sau: xét nghiệm phết bệnh phẩm lấy ở cổ tử cung cho kết quả dương tính và bệnh nhân có kèm triệu chứng lâm sàng của nhiễm lậu cổ tử cung. Xét nghiệm chỉ có ý nghĩa sàng lọc khi bệnh nhân không có triệu chứng và xét nghiệm trực tiếp ít có giá trị khi tìm thấy lậu cầu ở họng và hậu môn. H6. Song cầu nhuẩn Gram m hình hạt c ph nội tế bo H7: Song cầu nhuẩn Gram m hình hạt c ph ngồi tế bo 2. Khảo sát trực tiếp tiêu bản nhuộm Gram chẩn đoán Heamophilus ducreyi Heamophilus ducreyi là trực khuẩn hình que, bắt màu thuốc nhuộm kém, được xác nhận là một trong những nguyên nhân gây loét sinh dục trong bệnh hạ cam (H.8). 2.2.1. Lấy bệnh phẩm:  Cạo vết loét sinh dục làm phiến đồ  Nhuộm gram hoặc Toluidine Blue 2.2.2. Nhận định kết qua dưới kính hiển vi vật kính X100 - Nhuộm Gram: Heamophilus ducreyi bắt màu hồng nhạt, hình que ngắn có bờ song song, tròn 2 đầu và bắt màu rõ cho hình ảnh đặc biệt so với các loại vi khuẩn khác. Xếp nối đuôi nhau, hay hình đàn cá (H.9) - Nhuộm Toluidine Blue: Heamophilus ducreyi bắt màu xanh, phần giữa sáng nhuộm màu 2 đầu rất điển hình. H8. Vết loét bệnh hạ cam H9. Trực khuẩn gram âm bắt màu đậm 2 đầu, xếp hình đàn cá 3. Khảo sát trực tiếp tiêu bản nhuộm Gram bệnh phẩm dịch âm đạo chẩn đoán viêm âm đạo do vi khuẩn Về phương diện cận lâm sàng kết quả khảo sát trực tiếp phiến phết nhuộm Gram bệnh phẩm dịch âm đạo và cổ tử cung giúp cho các bác sĩ lâm sàng các thông tin cần thiết và hữu hiệu để chẩn đoán, đánh giá và theo dõi điều trị bệnh lý viêm âm đạo do vi khuẩn. 2.3.1. Lấy bệnh phẩm và làm phiến phết, nhuộm gram. 2.3.2. Nhận định kết quả: Vi khuẩn dược đánh giá theo 3 tình trạng ∗ Tình trạng I: Bacterial vaginosis Negative (BVN) Hiện diện một quần thể Bactobacilli đơn thuần, là các trực khuẩn Gram dương hình que dài, lớn. (H.10). ∗ Tình trạng II: Bacterial vaginosis Indeterminate (BVI) Hiện diện nhiều loại vi khuẩn mà đặc điểm là sự giảm quần thể Lactobacilli và gia tăng các quần thể vi khuẩn khác như: Gardnerella spp, Prevotella spp, Bacteroides spp, Mobiluncus spp, Atopobium spp, Fusobacterium spp, Bifidobacterium spp, Clostridium spp….Trên tiêu bản sẽ thấy nhiều hình thái vi khuẩn như trực khuẩn Gram dương, cầu trực khuẩn Gram âm, cầu khuẩn Gram dương xếp chuỗi (Streptococci sp) (H.11, H.12) ∗ Tình trạng III: Bacterial vaginosis Positive (BVP) Là sự mất hẳn quần thể Lactobacilli, hiện diện nhiều hình thái vi khuẩn khác mà đặc biệt là sự hiện diện của Gardnerella vaginalis có thể nhìn thấy tế bào Clue (tế bào biêu mô âm đạo trên đó có bám đầy các trực khuẩn Gram âm nhỏ) trong hầu hết các trường hợp. (H.13) H 10: BVN Quần thể Lactobacilli H11: BVI Nhiều chủng loại VK đa hình thái xâm lấn Lactobacilli H13: BVP Mất hẳn Lacctobacilli Garnerella dày đặc và tế bào Clue H12: BVP Mất hẳn Lacctobacilli, hiện diện cầu khuẩn Gram dương xếp chuỗi 4. Nuôi cấy định danh N.gonorrhoeae Phương pháp tin cậy để chẩn đoán lậu cầu là nuôi cấy, quy trình nuôi cấy đòi hỏi nhiều yếu tố về kỹ thuật lấy bệnh phẩm, môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và các môi trường sinh hoá định danh. 4.1. Lấy bệnh phẩm: như cách lấy làm phiến nhuộm Gram, phải chuyển cấy ngay vì lậu cầu rất dễ chết. 4.2. Môi trường nuôi cấy: - Thích hợp nhất là môi trường chọn lọc Thayer Martin. - Ủ ở nhiệt độ 35 -36 o C, có 3-10% CO 2 , trong 24-48 giờ - Khuẩn lạc điển hình 0,6mm, tròn, lồi, màu xám trắng . 4.3. Các test định danh: - Thử nghiệm Oxidase: dương tính - Nhuộm gram khuẩn lạc mọc trên Thayer Martin - Lên men đường Glucose - ONPG : âm tính - Test Beta-lactamase 4.4. Kháng sinh đồ 5. Nuôi cấy định danh Candida albicans Kết quả soi tươi nhận định nấm men Candida spp khi hình ảnh soi tươi nhìn thấy sự hiện diện cuả tế bào nấm men và sợi tơ nấm giả. Có nhiều loài Candida có khả năng gây bệnh, nhưng có trên 90% trường hợp là do Candida albicans, ở đây chỉ giới thiệu một kỹ thuật định danh Candida albicans bằng phương pháp nuôi cấy và thủ nghiệm sinh ống mầm. • Cấy bệnh phẩm vào môi trường Sabouraud có Chloramphenicol, ủ 35 o C, sau 24 giờ khuẩn lạc mọc, khuẩn lạc có màu trắng đục, nhão. • Trong một ống nghiệm có 0,5ml huyết thanh người hoặc thỏ, hoà tan vào huyết thanh một khúm nấm mọc trên môi trường Sabouraud ủ 37 o C trong 4 giờ. • Lấy một giọt huyết thanh nói trên khảo sát dưới kính hien vi: Nếu thấy tế bào nấm me có sinh ống mầm: Candida albicans. Nếu không thấy có ống mầm là loại Candida khác H13. Tế bào nấm men sinh ống mầm Soi tươi H14. Tế bào nấm men sinh ống mầm Nhuộm gram CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH MIỄN DỊCH CHẨN ĐOÁN STIs CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN BỆNH GIANG MAI Chẩn đoán huyết thanh giang mai có rất nhiều phương pháp khác nhau, từ những kỹ thuật đơn giản có tính chất sàng lọc, không đặc hiệu với kháng nguyên xoắn khuẩn giang mai là cardiolipin như phản ứng cố định bổ thể BW (Border Wasses mainn), kỹ thuật VDRL (Venereal Disease Research laboratory test), kỹ thuật RPR (Rapid Plasma Reagin) đến những kỹ thuật phức tạp, đặc hiệu có tính chất khẳng định, với việc sử dụng kháng nguyên chính là xoắn khuẩn giang mai (Treponema pallidum), như là kỹ thuật bất động xoắn khuẩn giang mai TPI (Treponema pallidum Immobilization) Kỹ thuật huỳnh quang FTA (Fluorescent Treponema Antibody test), kỹ thuật ngưng kết hồng cầu thụ động TPHA (Treponema pallidum heamagglutination) Việc áp dụng các kỹ thuật khác nhau tuỳ vào thiết bị và các điều kiện của phòng xét nghiệm. Ở đây chỉ giới thiệu 2 kỹ thuật RPR và TPHA KỸ THUẬT RPR CHẨN ĐOÁN GIANG MAI 1. Nguyên tắc Kỹ thuật RPR (Rapid Plasma Reagin) là một kỹ thuật huyết thanh học phát hiện bệnh giang mai. Kháng nguyên một huyền dịch gồm các hạt carbon được bao phủ một phức hợp lipid. Kháng thể Reagin có trong huyết thanh bệnh nhân giang mai. Ngưng kết được nhìn thấy là các cụm hạt màu đen khi huyết thanh bệnh nhân có chứa kháng thể kháng reagin, có thể quan sát hạt ngưng kết bằng kính lúp (Macroscope). 2. Hoá chất Hoá chất RPR Carbon antigen Huyền dịch các hạt Carbon trung tính được bao phủ một phức hợp lipid, (dịch có chứa Sodium azide 0,95gl) Positive control. Huyết thanh người (có chứa Sodium azide 0,95gl) Negative control Huyết thanh động vật (có chứa Sodium azide 0,95gl) Kim hút 16µl Lọ hút Phiến nhựa Ống hút Ghi chú: ∗ Các sinh phẩm đã được thử nghiệm cho kết quả âm tính với HBsAg và HIV, HCV, tuy nhiên trong quá trình thao tác cần thiết phải cẩn thận như các mẫu bệnh phẩm có khả năng lây nhiễm. ∗ Hoá chất bảo quản ở 2-8 o C. Phiến nhựa và các ống hút bảo quản ở nhiệt độ phòng. 3. Mẫu bệnh phẩm ∗ Huyết thanh và huyết tương ổn định 48 giờ ở 2-8 o C ∗ Mẫu bệnh phẩm nên tách huyết thanh chống nhiễn khuẩn và tan huyết. ∗ Lipid trong máu không ảnh hưởng đến kết quả trừ khi nó có quá nhiều làm che phủ hạt kháng nguyên. 4. Chuẩn bị hoá chất: ∗ Lắc kỹ huyền dịch hạt carbon, dùng kim hút chuyển một ít sang lọ nhựa cung cấp theo bộ kít, huyền dịch kháng nguyên sau khi chia sang lọ nhỏ nên sử dụng trong vòng 3 tháng. ∗ Thiết bị cần có để thực hiện: máy lắc tròn sử dụng chế độ 100rpm, biên độ lắc là 2cm. 5. Quy trình thao tác: 5.1. Test định tính: ∗ Thuốc thử để ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. ∗ Nhỏ 50 µl huyết thanh bệnh nhân và các chứng âm dương vào mỗi vòng thử nghiệm trên phiến nhựa. ∗ Nhỏ một giọt huyền dịch kháng nguyên vào mỗi vòng thử nghiệm. ∗ Trộn nhẹ nhàng bằng que khuấy, dùng que khuấy riêng biệt cho mỗi mẫu. ∗ Lắc tròn 100rpm trong 8 phút. 5.2. Test định lượng: ∗ Thuốc thử để ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. ∗ Nhỏ 50 µl nước muối sinh lý vào các vòng 2,3,4,5, ∗ Nhỏ 50 µl huyết thanh bệnh nhân vào vòng 1 và 2 . ∗ Dùng pipette trộn đều hỗn dịch ở vòng 2, chuyển 50 µl sang vòng 3, tương tự chuyển sang vòng 4… bỏ 50 µl cuối cùng ∗ Nhỏ một giọt huyền dịch kháng nguyên vào mỗi vòng thử nghiệm. ∗ Trộn nhẹ nhàng bằng que khuấy, dùng que khuấy riêng biệt cho mỗi mẫu. ∗ Lắc tròn 100rpm trong 8 phút. 5.3. Kiểm tra chất lượng: ∗ Mỗi mẫu huyết thanh đều làm cùng lúc với chứng âm và dương 5.4. Các ghi chú: ∗ Sau mỗi ngày kim hút nên được tháo khỏi lọ nhựa đựng hoá chất, rửa sạch bằng nước cất và để khô. ∗ Quy trình kỹ thuật có thể thay đổi tuỳ theo hướng dẫn của nhà sản suất bộ hoá chất. 6. Nhận định kết quả: ∗ Khảo sát dưới kính lúp, quan sát sự hình thành các đám kết cụm nổi trên vòng thử nghiệm ngay sau khi đủ thời gian lắc. Quan sát ngưng kết Đọc kết quả Ghi nhận Kết cụm to và vừa phải Dương tính Có phản ứng Kết cụm nhỏ Dương tính yếu Phản ứng yếu Không ngưng kết Am tính Không phản ứng ∗ Đối với test định lượng: Hiệu giá huyết thanh được ghi nhận tại giếng có độ pha loãng lớn nhất còn cho kết quả ngưng kết 7. Các yếu tố liên quan: ∗ Các kỹ thuật giống như Cardiolipin không đặc hiệu với bệnh giang mai, vì vậy khi mẫu có kết quả dương tính cần thiết phải thử lại với các kỹ thuật khác như TPHA, FTA-Abs. ∗ Tuy nhiên khi RPR âm tính cũng không loại trừ khả năng đã mắc bệnh giang mai. ∗ Các dương tính giả thường gặp trong các bệnh nhiễm đơn nhân, bệnh phổi do virus và Toxoplasma, có thai và bệnh tự miễn. KỸ THUẬT TPHA TRONG CHẨN ĐOÁN GIANG MAI 1. Nguyên tắc: TPHA là kỹ thuật ngưng kết hồng cầu gián tiếp đủ nhạy cảm và đặc hiệu để phát hiện kháng thể kháng Treponema pallidum. Hồng cầu được gắn kháng nguyên là thành phần của Treponema pallidum gây bệnh (chủng Nichol’s). Phản ứng ngưng kết hồng cầu xảy ra khi huyết thanh người bệnh có chứa kháng thể kháng Treponema pallidum, sự ngưng kết được nhìn thấy bằng hình dạng của một “bánh” hồng cầu trong đĩa vi lượng. 2. Hoá chất: Bộ hoá chất bao gồm: ∗ TPHA Test cell (chứa HC có gắn kháng nguyên) ∗ TPHA Control cell (chứa HC không gắn kháng nguyên) ∗ Diluent (dung dịch pha loãng) ∗ Positive control (chứng dương, hiệu giá 1:2560) ∗ Negative control (chứng âm) Các lọ sinh phẩm và hoá chất lưu giữ ở nhiệt độ từ 2-8 o C ở tư thể để đứng . Tất cả hoá chất sinh phẩm sử dụng ngay không phải pha chế. Test và Control cell nên lắc trộn nhẹ nhàng và thật kỹ trước khi sử dụng. Để ở nhiệt độ phòng trước khi dùng. Các dụng cụ cần thiết chuẩn bị: ∗ Micropipette các thể tích 10µl, 25µl, 75µl, 190µl. ∗ Đĩa vi lượng có giếng đáy tròn. 3. Bệnh phẩm: ∗ Huyết thanh không nhiễm khuẩn, không bị tan huyết. ∗ Mẫu có thể giữ 24 giờ ở nhiệt độ 2-8oC ∗ Có thể giữ một thời gian dài ở nhiệt độ âm 20oC. 4. Quy trình kỹ thuật: 4.1. Kỹ thuật định tính: ∗ Mỗi mẫu yêu cầu sử dụng 3 giếng. ∗ Thêm 190µl dung dịch pha loãng vào giếng I. ∗ Thêm 10µl huyết thanh vào giếng I, trộn đều bằng pipette. ∗ Chuyển 25µl hỗn dịch từ giếng I sang giếng II và giếng III. ∗ (Test cell và control cell phải được lắc đều). ∗ Thêm 75µl control cell vào giếng số II. ∗ Thêm 75µl Test cell vào giếng số III. ∗ Gõ nhẹ phiến nhựa để trộn đều các thành phần trong giếng. ∗ Đậy nắp phiến nhựa để yên ở nhiệt độ phòng từ 45-60 phút hoặc qua đêm, tránh ánh sáng trực tiếp và dịch chuyển. 4.2. Kỹ thuật định lượng ∗ Mỗi mẫu cần 9 giếng vi lượng ∗ Thêm 190µl dung dịch pha loãng vào giếng I. ∗ Thêm 25µl dung dịch pha loãng vào giếng số 4 đến giếng số 9 ∗ Thêm 10µl huyết thanh vào giếng 1, trộn đều bằng pipette. ∗ Chuyển 25µl hỗn dịch từ giếng I sang giếng số 2, 3 và 4 . ∗ Trộn đều hỗn dịch ở giếng số 4 chuyển 25µl sang giếng số 5. ∗ Lặp lại thao tác pha loãng như trên từ giếng số 5 đến giếng số 9 ∗ (Test cell và control cell phải được lắc đều). ∗ Thêm 75µl control cell vào giếng số II. ∗ Thêm 75µl Test cell vào giếng số 3,4,5,6,7,8 và 9. ∗ Gõ nhẹ phiến nhựa để trộn đều các thành phần trong giếng. ∗ Đậy nắp phiến nhựa để yên ở nhiệt độ phòng từ 45-60 phút hoặc qua đêm, tránh ánh sáng trực tiếp và dịch chuyển. 4.3. Hấp phụ các kháng thể không đặc hiệu: ∗ Có rất nhiều trường hợp huyết thanh bệnh nhân có chứa nhiều loại kháng thể không đặc hiệu nên xảy ra hiện tượng ngưng kết hồng cầu ở cả 2 giếng Test cell và control cell. Trong trường hợp này mẫu huyết thanh phải được làm lại sau khi được hấp phụ theo quy trình sau: o Cho 100µl huyết thanh vào 1 ống nghiệm nhỏ o Thêm vào 400µl control cells. o Lắc kỹ, để ở nhiệt độ phòng 18-25 o C trong 1 giờ. o Ly tâm 100 rpm trong 15 phút, tách lấy phần dịch nổi và sử dụng như quy trình kỹ thuật định tính. o Ghi nhớ rằng trong trường hợp này mẫu huyết thanh đã được pha loãng 5 lần. o Trong trường hợp kết quả vẫn còn ngưng kết không đặc hiệu mẫu cần thiết nên làm với một kỹ thuật khác. 4.4. Kiểm tra chất lượng: Mỗi lần thực hiện nên kiểm tra đồng thời với một mẫu chứng âm và chứng dương. 5. Nhận định kết quả:  (4+) Dương tính mạnh, ngưng kết tạo thành bánh hồng cầu tròn đầy đáy giếng, đôi khi viền ngoài gấp lại nhiều nếp.  (3+) Dương tính, ngưng kết tạo thành bánh hồng cầu tròn đầy đáy giếng.  (2+) Dương tính, ngưng kết tạo thành bánh hồng cầu tròn đều, có viền hồng cầu xung quang vòng ngưng kết  (1+) Dương tính yếu, ngưng kết tạo thành bánh hồng cầu nhỏ hơn, có viền hồng cầu xung quang vòng ngưng kết lắng sát đáy giếng.  (+/-) Không xác định, hồng cầu lắng sát đáy giếng, tạo một vòng sáng rõ ở trung tâm.  (-) Am tính, hồng cầu lắng sát đáy giếng, tạo nút hồng cầu trung tâm đáy giếng. 6. Cac lưu ý khác: Chứng âm không có ngưng kết ở cả 2 giếng test cells và control cells. Chứng dương chỉ ngưng kết ở giếng Test cells. Hiện tượng ngưng kết với Control cells cho biết có sự hiện diện các kháng thể không đặc hiệu. Kỹ thuật hấp phụ phải được làm, sau đó mẫu phải được làm lại. Mẫu huyết thanh dương tính nếu cần thiết thì làm kỹ thuật định lượng hiệu giá kháng thể. Quy trình kỹ thuật có thể thay đổi tuỳ theo hướng dẫn của nhà sản suất bộ hoá chất. 7. Hạn chế của kỹ thuật: o Kháng thể giang mai tồn tại một thời gian dài sau khi hoàn thành điều trị thành công. o Để theo dõi điều trị, các kỹ thuật định lượng RPR và VDRL được khuyến cáo sử dụng TPHA không dùng để theo dõi điều trị. o Để chẩn đoán xác định kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp nên làm phối hợp để phân biệt lớp kháng thể IgM và IgG. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH SẮC KÍ CHẨN ĐOÁN CHLAMIDIA Chlamydia là một nhóm vi sinh vật đặc biệt, hình que, nhuộm gram bắt màu gram âm, ký sinh nội bào bắt buộc chúng tồn tại cạnh nhân tế bào chủ, tạo nên những hạt vùi Chlamydia chứa 2 loại AND và ARN. Hiện nay nhóm vi sinh vật này được chia vào họ Chlamydiaceae và giống Chlamydia với 2 loài C.psittaci và C.trachomatis. C.trachomatis ngoài vai trò là căn nguyên gây bệnh mắt hột mà còn đóng vai trò chính trong trong nhóm bệnh lây truyền qua đường tình dục, ở nam giới biểu hiện hội chứng viêm niệu đạo, ở nữ biểu hiện viêm cổ tử cung có mủ, phù kèm viêm lộ tuyến. Loài Chlamydia có vách tế bào có chung một nhóm kháng nguyên là chất Lipopolisacharide. Chlamydia trachomatis được chia làm 15 serotype, trong đó serotype L1, L2, L3 gây bệnh ở đường sinh dục. Chẩn đoán phòng thí nghiệm dựa vào các kỹ thuật xác định trực tiếp kháng nguyên và huyết thanh học. Chúng tôi giới thiệu một kỹ thuật miễn dịch sắc ký, phát hiện kháng nguyên Chamydia. 1. Kỹ thuật lấy bệnh phẩm: 1.1. Bệnh phẩm lấy từ niệu đạo: dùng tăm bông nhỏ đưa vào lỗ niệu đạo, xoay nhẹ tăm bông và giữ nguyên trong niệu đạo 30 giây – 1 phut. 1.2. Bệnh phẩm lấy từ cổ tử cung: Sau khi đặt mỏ vịt, lau sạch cổ tử cung cho hết dịch, rồi đưa tăm bông vào lỗ cổ tử cung, xoay và miết nhẹ cho phần tăm bông chạm vào thành cổ tử cung, giữ nguyên khoang 10-30 giây, lấy tăm bông ra không để tăm bông chạm vào thành âm đạo. 2. Xử lý bệnh phẩm và thao tác: Cho tăm bông có bệnh phẩm vào dung dịch li giải tế bào, trộn kỹ để bệnh phẩm hoà trong dung dịch li giải, để yên 10 phút. Lấy phần nước nổi cho vào giếng thử nghiệm trên phiến thử nghiệm, dung dịch sẽ được hấp thụ và lan nhanh vào vùng thử nghiệm. 3. Nhận định kết quả: Nếu trong mẫu thử có Chlamydia vùng thử nghiệm sẽ xuất hiện 2 vach hiện màu, vạch C-Control và vạch T-Test, mẫu thử Dương tính. Nếu trong mẫu thử không có Chlamydia vùng thử nghiệm sẽ xuất hiện 1 vạch hiện màu duy nhất tại vạch C-Control , mẫu thử Âm tính. MỘT SỐ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM LÀM ĐƯỢC TẠI CÁC PHÒNG XÉT NGHIỆM CƠ SỞ ĐỂ CHẨN ĐOÁN STD STIs Kỹ thuật Phòng XN Cơ sở Phòng XN huyện, TT PCBXH Phòng XN tuyến tỉnh, TW Bệnh lậu Nhuộm Gram + + + Nuôi cấy - + + PCR - - + Kháng sinh đồ - - + C.trachomatis ELISA - + + Nuôi cấy - - + Huyết thanh chẩn đoán - + + PCR - - + Giang mai Kính hiển vi nền đen - + + RPR + + + TPHA - + + Miễn dịch huỳnh quang - - + IgM (ELISA) - - + Herpes sinh dục Phát hiện kháng nguyên - - + Nuôi cấy - - + Huyết thanh chẩn đoán - - + PCR - - + Bệnh do Trichomonas Soi tươi + + + Nuôi cấy - - + Bệnh do Candida Soi tươi + + + Nuôi cấy - - + Viêm âm đạo do vi khuẩn Soi tươi, nhuộm Gram, pH, thử nghiệm KOH sniff. + + + . MỘT SỐ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN STIs Nguyễn Phúc Như Hà Đại cương Có rất nhiều phương pháp, nhiều kỹ thuật để phát hiện các tác nhân gây bệnh có. gram CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH MIỄN DỊCH CHẨN ĐOÁN STIs CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN BỆNH GIANG MAI Chẩn đoán huyết thanh giang mai có rất nhiều phương pháp khác nhau, từ những kỹ thuật đơn. áp dụng các kỹ thuật khác nhau tuỳ vào thiết bị và các điều kiện của phòng xét nghiệm. Ở đây chỉ giới thiệu 2 kỹ thuật RPR và TPHA KỸ THUẬT RPR CHẨN ĐOÁN GIANG MAI 1. Nguyên tắc Kỹ thuật RPR