BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ QUANG KHÔI KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NHĨM VI KHUẨN TÍCH LŨY POLY-PHOSPHATE TRONG CHẤT THẢI CHĂN NUÔI HEO VÀ CÁ TRA Ở VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƢỚC AO CÁ TRA TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 01 07 Cần Thơ, 2015 Cơng trình hồn thành Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Ngƣời hƣớng dẫn PGS.TS Trương Trọng Ngôn GS TS Cao Ngọc Điệp Phản biện 1: Phản biện 2: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường tại: ……………………………………………………………………… Vào lúc: ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện  Trung tâm học liệu – Đại học Cần Thơ  Thư viện Quốc gia Việt Nam CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết luận án Ngành chăn nuôi heo cá tra ĐBSCL phát triển theo hướng tập trung kết xu đổi làm tăng cường hiệu sản xuất đơn vị lao động đất đai Bên cạnh phát triển nguy ảnh hưởng đến môi trường sống Các nguồn gây ô nhiễm chủ yếu chất thải tiết cá heo, thức ăn tồn đọng… Thành phần chất gây ô nhiễm chủ yếu protein, lipid, acid béo, phospholipid, carbohydrate, hàm lượng nitơ, chất khống… (Lê Văn Cát, 2007) Thơng qua trình phân hủy vi sinh vật, lượng thức ăn dư thừa chất thải chuyển thành dạng Nitơ (N) phốt-pho (P) vô Hàm lượng N P hịa tan cao mơi trường nước kích thích mạnh mẽ khả tăng sinh khối thủy sinh vật tảo vi khuẩn lam nhân tố chủ yếu gây tượng phú dưỡng hóa tiến trình phân hủy tảo làm cho môi trường nước bị ô nhiễm, thiếu oxy cung cấp cho hoạt động hô hấp cá, cá suy yếu dễ nhiễm bệnh Để xử l‎ P hòa tan, số biện pháp sử dụng xử lý ý hóa học sinh học Trong biện pháp xử lý sinh học, nhóm vi khuẩn có khả hấp thu tồn trữ P nội bào giữ vai trò quan trọng chúng xem vi khuẩn tích lũy poly-phosphate (Poly-phosphate Accumulating Bacteria-PAB) Loại bỏ P hồ tan dạng PO43- thơng qua hoạt động vi khuẩn ngày ứng dụng đặc tính hữu dụng chúng dễ ứng dụng, hiệu mặt kinh tế thân thiện với môi trường sống (Mino et al., 1998) Hiện chưa có nghiên cứu cấu trúc quần thể nhóm vi khuẩn tích lũy poly-phosphate (poly-P) chất thải chất thải chăn nuôi heo qua xử lý biogas (sau gọi chất thải chăn nuôi heo) ao nuôi thâm canh cá tra (sau gọi chất thải ao cá tra) ĐBSCL Chính việc phân lập, tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P có hiệu suất loại bỏ phosphate cao tạo nên sở liệu cho đánh giá tính đa dạng di truyền PAB nghiên cứu cần thiết nhằm đưa giải pháp khai thác sử dụng bền vững nguồn vi khuẩn tích lũy poly-P địa, có lợi tự nhiên để ứng dụng vào xử lý P hòa tan dư thừa nước 1.2 Mục tiêu tổng quát Đánh giá đa dạng di truyền nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập từ chất thải chăn nuôi heo cá tra tỉnh ĐBSCL dựa trình tự gen 16S rRNA tìm nguồn vi khuẩn có khả loại bỏ phosphate cao để ứng dụng việc xử lý phốtpho hịa tan nước ao ni cá tra qui mơ phịng thí nghiệm 1.3 Những điểm ý nghĩa thực tiễn luận án Trong q trình phân lập, tiến trình cấy chuyền làm rịng vi khuẩn thực luân phiên hai môi trường phân lập (có nguồn carbon) mơi trường cấy chuyền (khơng có nguồn carbon) để sàng lọc tuyển chọn nguồn vi khuẩn ban đầu phương pháp để phân lập PAB Sự kết hợp phương pháp vừa định tính định lượng poly-P nội bào nhận diện gen poly-phosphate kinase cặp mồi đặc hiệu phương pháp tin cậy để tuyển chọn vi khuẩn có khả tích lũy poly-P cao Thơng qua phương pháp này, phân lập tuyển chọn 48/439 dịng vi khuẩn phân lập có khả tích lũy poly-P cao làm sở cho việc đánh giá tính đa dạng di truyền chọn lọc dịng vi khuẩn có hiệu suất loại bỏ P hoà tan cao để ứng dụng xử lý phosphate nước ao cá tra Ứ ‎ ng dụng kỹ thuật sinh học sinh tử đại (thực gen 16S rRNA gen ppk 1) kết hợp phương pháp truyền thống để định danh vi khuẩn cho thấy 48 lồi vi khuẩn tích lũy polyP phân lập thuộc lớp Bacilli, Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Beta-proteobacteria Gamma-proteobacteria Kết chụp TEM PCR cho thấy dịng vi khuẩn có gen đồng hóa phosphate thành dạng hạt poly-phosphate nội bào Các dịng vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập có phong phú lồi đa dạng nucleotide Phân tích số đa dạng di truyền cho thấy tính đa hình (=0,11) đa dạng nucleotide (Pi=0,16) vùng 16S rRNA nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P tương đối cao Sự biến thiên số  Pi tạo nên dạng haplotype khác nhau, có 25 haplotype (kiểu gen) tạo từ 48 trình tự nucleotide Sự khác cấu trúc haplotype tạo nên đa dạng cao chúng (Hd=0,91) Điều làm xuất nhiều kiểu gen có tính biến dị di truyền khả thích nghi với mơi trường sống q trình tiến hóa dịng vi khuẩn có khả tích lũy poly-P Đây sở khoa học việc lựa chọn nguồn mẫu để phân lập tuyển chọn dịng vi khuẩn tích lũy poly-P có khả thích nghi cao với mơi trường Đề tài tuyển chọn dịng vi khuẩn có hiệu suất loại bỏ phốt-pho hòa tan cao Đặc biệt hai dòng vi khuẩn Acinetobacter radioresistens TGT013L Kurthia sp TGT025L cho hiệu suất loại bỏ PO43- đạt 85,1% nước ao nuôi cá tra sau 36 thí nghiệm Kết nghiên cứu mang lại nhiều triển vọng thực tiễn ứng dụng dòng vi khuẩn tích lũy poly-P để xử lý phốt-pho hịa tan mơ hình ni cá tra cơng nghiệp có ứng dụng công nghệ sinh học vi sinh CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trong phần tổng quan tài liệu, luận án lược khảo phân tích vấn đề liên quan đến tác động phốt-pho đến chất lượng mơi trường nước Tình hình nghiên cứu vi khuẩn tích lũy poly-P biện pháp loại bỏ phốt-pho hịa tan, cụ thể là: - Tổng quan tình hình chăn ni heo, cá tra ĐBSCL tác động chất thải chứa phốt-pho đến chất lượng nước - Tổng quan tình hình nghiên cứu ngồi nước phân lập, tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P - Tổng quan tình hình nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn tích lũy poly-P hệ thống xử lý nước thải ao-hồ tự nhiên - Tổng quan chế trao đổi chất vi khuẩn tích lũy polyP điều hòa Các phương pháp định tính định lượng poly-P - Cơ sở khoa học phân tích đa dạng di truyền vi khuẩn tích lũy poly-P dựa gen 16S rRNA gen poly-P kinase - Các biện pháp xử lý phốt-pho hịa tan đường hóa học sinh học CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nguyên liệu Mẫu chất thải chăn nuôi heo sau biogas ao nuôi thâm canh cá tra 13 tỉnh ĐBSCL Môi trường phân lập: acetate (5 g/L), glucose (0,5 g/L), succinate (0,5 g/L), NH4Cl (0,02 g/L), KH2PO4 (0,088 g/L), pepton (0,5 g/L), MgSO4.7H2O (0,01 g/L), CaCl2 (0,005 g/L), agar (20 g/L) Khoáng vi lượng (0,5 mL/L) (Smolders et al., 1994) Môi trường cấy chuyền: NH4Cl (0,02 g/L), KH2PO4 (0,088 g/L), pepton (0,5 g/L), MgSO4.7H2O (0,01 g/L), CaCl2 (0,005 g/L), agar (20 g/L) Khống vi lượng (0,5 mL/L) (Smolders et al., 1994) Mơi trường ni vi khuẩn tích lũy poly-P (Sidat et al., 1999) Môi trường tổng hợp kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate (Filipe et al., 2001) 3.2 Phƣơng pháp 3.2.1 Phân lập Mẫu nước bùn đem phịng thí nghiệm trộn theo tỉ lệ (1 g bùn+50 mL nước mẫu) lắc để tạo huyền phù mẫu Huyền phù mẫu tiến hành pha loãng nhiều nồng độ khác (theo tỷ lệ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4) Dùng micropipet hút 50 µL dịch huyền phù pha loãng nhỏ trải lên bề mặt agar đĩa petri chứa môi trường phân lập Mẫu ủ 30oC tủ ủ vi sinh vật (Incucell 55-Đức) tuần để vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc Các khuẩn lạc có hình thái khác môi trường phân lập cấy chuyền sang môi trường thiếu nguồn carbon (môi trường cấy chuyền) Thao tác lặp lặp lại luân phiên môi trường phân lập cấy chuyền khuẩn lạc rời, đồng Chọn khuẩn lạc riêng biệt cấy chuyền vào môi trường phân lập ống thạch nghiêng ủ 300C, ngày sau trữ ủ lạnh (100C) để kiểm tra độ rịng kính hiển vi quang học (độ phóng đại 400 lần) 3.2.2 Định tính định lƣợng poly-P nội bào 3.2.2.1 Định tính Quan sát diện hạt poly-P nội bào thông qua chụp TEM Dịch huyền phù tế bào xử l‎ theo Boswell et al., (2001) Mẫu ý xem kính hiển vi điện tử (JEOL 1400-Nhật) điện gia tốc 100 kV trường Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh 3.2.2.2 Định lƣợng Xác định hàm lượng poly-P theo Eixler et al., (2005) Buzoleva et al., (2006) 3.2.3 Nhận diện gen poly-phosphate kinase Cặp mồi 5’-GACGAAGAAGCGGTCAAG-3’, 5’-AACGGTCA TCTTGATGGC-3’; 5’- AGTTCAATCTCACCGAGAGC-3’,5’-GGAA CTTCAGGTCGTTGC-3’; 5’-GATACCCAGTTCCTGCTCG-3’, 5’CGGCACGAACTTCAGATCG - 3’ 5’- TCACCACCGACGGCAA GAC-3’, 5‘-CCGGCATGACTTCGCGGAAG-3’ sử dụng khuếch đại gen ppk Phản ứng PCR thực theo He et al., (2007) 3.2.4 Định danh vi khuẩn tích lũy poly-P Ly trích DNA thực theo Carr et al., (2001) Cặp mồi 27F 1492R (Lane et al., 1991) sử dụng khuếch đại 16S rRNA Phản ứng PCR thực theo Ivanov et al., (2005) Sản phẩm PCR tinh với kít Qiagen PCR Trình tự 16S rRNA xác định thông qua phản ứng dideoxy chain termination chemistry máy giải trình tự động ABI 310A (Applied Biosystems, USA) Sử dụng BLASTN để tìm tương đồng trình 16S rRNA dịng vi khuẩn phân lập với trình tự 16S rRNA ngân hàng gien Tất trình tự 16S rRNA dịng vi khuẩn phân lập trình tự 16S rRNA thu nhận từ GenBank so sánh cặp với (multi-aligned) CLUSTALW 1.6 Cây phát sinh loài xây dựng dựa khoảng cách tiến hóa phần mềm phân tích MEGA5 (Tamura et al., 2011) Định danh loài vi khuẩn phân lập dựa loài gần phát sinh loài Phân loại xếp lớp vi khuẩn dựa Bergey’s Manual of determinative Bacteriology, 2nd edition (New York: Springer) (Garrity, 2005) 3.2.5 Phân tích đa dạng di truyền 3.2.5.1 Phân tích đa dạng nucleotide Đa dạng nucleotide đánh giá thông qua nhiều số khác trung bình khác biệt nucleotide tổng số vị trí khác biệt, đa dạng nucleotide (Pi, ) Haplotype đa dạng haplotype Trung bình khác biệt nucleotide (k) chuỗi trình tự tính theo cơng thức (Tajima, 1993) Kij số nucleotide khác biệt trình tự i j, n số trình tự DNA quần thể n = n(n-1)/2 tổng số trình tự DNA so sánh Trị số trung bình biến thiên số k n chuỗi trình tự DNA tính theo cơng thức: , m chiều dài đoạn trình tự DNA Trị số trung bình biến thiên số SNP n trình tự DNA tính theo cơng thức Hall (1999) Trong S số SNPs, n số trình tự DNA quần thể m chiều dài DNA (bp) Kiểm định chênh lệch số Theta () Pi (Tajima, 1993) theo công thức: Trong nghiên cứu này, số k, , Pi (Watterson, 1975; Tajima, 1993; Hall,1999) haplotype xác định phần mềm DNASP 5.10 (Rozas et al., 2003) 3.2.5.2 Phân tích đa dạng lồi Chỉ số đa dạng sinh học loài H′ (Shannon and Weiner’s index, 1963) tính theo cơng thức (Richard, 2005) s H′ = - ∑ Pi * ln(Pi), đó: i=1 Pi: tần số xuất loài thứ i, S: tổng số loài Phân tích định lượng số đa dạng lồi độ đồng phần mềm Biodiversity Pro (Neil McAleece et al., 1997) 3.2.6 Các thí nghiệm ứng dụng vi khuẩn tích lũy poly-P xử lý phosphate nƣớc ao nuôi cá tra Kiểm tra khả loại bỏ phosphate hòa tan Filipe et al., 2001 Kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate hòa tan nước ao ni cá tra (qui mơ 10 lít) Kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate hịa tan nước ao ni cá tra (qui mơ 500 lít) Đánh giá hiệu xử l‎ dịng vi khuẩn ý mơ hình ni cá tra bể Sơ đồ tóm tắt bƣớc ứng dụng vi khuẩn xử lý phosphate nƣớc ao nuôi cá tra 3.2.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử ý sơ Excel phân tích thống kê Minitab 16 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập xác định đặc điểm sinh học vi khuẩn 4.1.1 Kết phân lập Kết phân lập 439 dòng vi khuẩn từ 261 mẫu chất thải chăn nuôi heo ao nuôi cá tra thuộc 13 tỉnh ĐBSCL Kết kiểm tra hàm lượng poly-P nội bào có 391/439 dịng vi khuẩn phân lập có khả tích lũy poly-P với hàm lượng từ 0-19,5 mg/L (chiếm 89,1%) Chỉ có 48/439 dịng vi khuẩn phân lập có hàm lượng poly-P tích lũy nội bào từ 19,6-149,5 mg/L (trong có 29/439 dịng tích lũy từ 19,6-50 mg/L, 14/439 dịng có hàm lượng từ 50-100 mg/L dịng tích lũy từ 100-149,5 mg/L) Các dòng tuyển chọn cho nghiên cứu đặc tính sinh học vi khuẩn tích lũy poly-P 4.1.2 Đặc điểm sinh học dịng vi khuẩn tích lũy poly-P Kết nhuộm Gram cho thấy đa số vi khuẩn tích lũy poly-P có dạng Gram dương (37/48 dòng chiếm 77,1%), lại Gram âm (5/48 dòng chiếm 22,9%) Hình dạng tế bào dịng vi khuẩn có khả tích lũy polyP có dạng que với nhiều trạng thái khác que chuyển động có kích thước từ 0,3-1,3 m; que thẳng cong chuyển động có kích thước từ 0,6-1,3 m; que ngắn có kích thước từ 0,4-0,9 m chuyển động; que thẳng cong khơng chuyển động; que đơn dính cặp (Hình 4.3) Hình 4.3: Hình dạng kích thước dòng vi khuẩn phân lập Ghi chú: Ảnh chụp SEM ngày 2/5/2012 phịng thí nghiệm chun sâu-Trường Đại học Cần Thơ (a) dòng CTT002L (x10,000), (b) dòng BTT003L (x15,000), (c) dòng LAH002L (x15,000) (d) dòng CTH008L (x15,000) Khuẩn lạc vi khuẩn có nhiều màu sắc khác Khuẩn lạc thường có dạng trắng nhạt, trắng đục, trắng sữa trắng xám Một vài khuẩn lạc có sắc tố bắt màu vàng sáng, rìa sáng hồng cam, cam sáng, vàng nhạt Chi tiết màu sắc khuẩn lạc vi khuẩn phân lập minh họa Hình 4.4 Hình 4.5) Hình 4.5: Khuẩn lạc số dịng vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập chất thải chăn ni heo Hình dạng khuẩn lạc dịng đa số có dạng trịn, lồi nhẵn với kích thước khác Bìa khuẩn lạc có dạng ngun khơng Một số khuẩn lạc có bề mặt nhày ẩm ướt Chi tiết hình dạng khuẩn lạc 22 dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải ao ni cá tra 26 từ chất thải Hình 4.4: Khuẩn lạc số dịng vi chăn ni heo minh họa khuẩn tích lũy poly-P phân lập trong Hình 4.4 Hình 4.5 chất thải ao ni cá tra Để nghiên cứu mối liên quan đặc điểm hình dạng cấu trúc hạt poly-P nội bào, dòng vi khuẩn xác định thông qua chụp TEM Chụp TEM thực theo Boswell et al 12 Bảng 4.8: Hàm lượng poly-P nội bào dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn ni heo Tên dịng vi khuẩn phân lập AGH005L AGH006L BLH002L BLH006L BTH008L BTH014L CMH002L CMH012L CTH008L CTH015L CTH020L DTH004L DTH006L KGH007L KGH008L LAH002L LAH003L STH008L STH009L TGH001L TGH003L TGH021L TVH002L TVH003L VLH002L VLH013L Dòng tham khảo Acinetobacter calcoaceticus Bacillus cereus ATCC Hàm lượng poly-P (mg/L) Mật số (CFU/mL) Hàm lượng poly-P (mg/tế bào) 22,7 21,8 92,1 149,1 30,5 28,7 44,3 148,1 149,5 46,8 97,9 32,7 44,7 87,1 35,4 148,4 92,3 30,2 28,9 97,5 53,5 53,1 30,4 22,5 25,8 25,5 PO43- hấp thu (mg/L) 1,70x109 1,02x1010 1,11x108 6,80x108 1,53x108 8,5x107 1,62x108 9,35x109 8,50x107 9,35x107 4,25x107 7,65x109 1,62x109 5,95x108 8,50x109 1,02x109 1,11x108 6,80x108 1,53x108 8,50x107 1,62x108 9,35x109 4,25x107 2,55x107 7,65x109 1,62x1010 Mật số (CFU/mL) 1,34x10-11 2,14x10-12 8,33x10-10 2,19x10-10 1,99x10-10 3,38x10-10 2,74x10-10 1,58x10-11 1,76x10-9 5,01x10-10 2,30x10-9 4,27x10-12 2,77x10-11 1,46x10-10 4,16x10-12 1,45x10-10 8,35x10-10 4,44x10-11 1,89x10-10 1,15x10-9 3,31x10-10 5,68x10-12 7,15x10-10 8,82x10-10 3,37x10-12 1,58x10-12 PO43- hấp thu (mg/tế bào) 18,4 13,7 20,6 1,00x108 4,30x108 6,00x108 1,84x10-10 3,19x10-11 3,43x10-11 Ghi chú: Acinetobacter calcoaceticus, Bacillus cereus ATCC (Acinetobacter calcoaceticus var Iwoffi, ATCC No 23055) (Sidat et al., 1999) 4.2 Định danh phân tích đa dạng PAB 4.2.1 Nhận diện gen 16S rRNA gen ppk 13 Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA (Ivanov et al., 2005) sử dụng cặp mồi tổng 27F 1492R (Lane et al., 1991) để nhận diện vi khuẩn Các dịng vi khuẩn có khả tích lũy poly-P cao sử dụng để nhận diện gen tích lũy poly-P Phổ điện di sản phẩm PCR nhân lên từ gen 16S rRNA gen pkk 48 dịng vi khuẩn tích lũy poly-P trình bày Hình 4.12 4.14 Hình 4.12: Phổ điện di (5) sản phẩm PCR (a) gen 16S rRNA (b) gen PPK1 gel agarose 1,2 % dịng vi khuẩn tích lũy poly-P [(3) TGT025L, (4) BTT006L, (5) TGT013L, (6) AGH006L (7) VLH013L] có băng tương ứng vị trí 1,500 bp gen ppk hai dòng (10) TGT013L (11) TGT025L có băng tương ứng vị trí 105 bp so với thang chuẩn DNA 100 bp ladder marker (1); (2, 9) đối chứng âm Hình 4.14: Phổ điện di sản phẩm PCR gen PPK1 gel agarose 1,2 % dịng vi khuẩn tích lũy poly-P [(3) STT011L, (4) BTT003L, (5) CTH010L, (6) DTT021L (7) VLH002L) có băng tương ứng vị trí 207 bp so với chuẩn DNA 100 bp ladder marker (L); (1) đối chứng âm Sản phẩm PCR gen 16S rRNA 48 dòng vi khuẩn tích lũy poly-P, sau kiểm tra kỹ thuật điện di gửi giải trình tự mồi xuôi công ty Macrogen (Hàn Quốc) 4.2.2 Định danh phân tích phát sinh lồi PAB phân lập chất thải chăn nuôi heo ao ni cá tra Định danh lồi dựa trình tự 16S rRNA dịng vi khuẩn có độ tương đồng cao (>97%) với trình tự 16S rRNA ngân hàng gen NCBI cho thấy 22 dòng vi khuẩn phân lập chất thải ao nuôi cá tra chia thành nhóm chiếm tỉ lệ phần trăm sau: Gram dương với hàm lượng G+C thấp thuộc lớp Bacilli (12 dòng; 54,6%), Gram dương với hàm lượng G+C cao thuộc lớp Actinobacteria (5 dòng; 22,7%), Gram âm thuộc lớp Gammaproteobacteria (3 dòng; 13,6%) Beta-proteobacteria (2 dòng; 9,1%) (Bảng 4.9) 26 dòng vi khuẩn phân lập chất thải chăn nuôi heo nằm lớp (Bảng 4.10): Bacilli (15 dòng; 14 57,7%), Actinobacteria (4 dòng; 19,2%), Gamma-proteobacteria (1 dòng; 3,9%) Alpha-proteobacteria (5 dòng; 19,2%) Giống Bacillus lớp Bacilli chiếm tỉ lệ cao số lượng địa điểm lấy mẫu Bảng 4.9: Kết định tên dòng vi khuẩn phân lập chất thải ao ni cá tra có khả tích lũy poly-P cao theo trình tự gen 16S rRNA Nhóm xếp Tỉ lệ tương Chiều dài Lồi có quan hệ gần gũi loại dòng đồng (%) (bp) Bacilli Bacillaceae DTT021L Bacillus megaterium (JQ229803) 99 1249 DTT001L Bacillus megaterium (JQ229803) 99 1227 BTT003L Bacillus megaterium (DQ365564) 97 923 AGT005L Bacillus megaterium (FJ976535) 99 1274 STT009L Bacillus megaterium (FJ976535) 98 1304 VLT003L Bacillus aryabhattai (HQ908708) 98 1344 STT011L Bacillus aryabhattai (JN084155) 99 1248 BTT006L Bacillus aryabhattai (HQ242767) 98 1352 AGT004L Bacillus sp (HQ024491) 99 1202 CTT002L Bacillus sp (DQ275185) 98 1345 TVT005L Bacillus ginsengihumi (FJ357590) 98 1275 Planococcaceae TGT025L Kurthia sp (JQ398850) 99 1114 Actinobacteria Micrococcaceae HGT005L Arthrobacter sp (AB638330) 98 1150 KGT004L Arthrobacter sp (EU571174) 99 1226 VLT002L Arthrobacter protophormiae (AB210984) 98 1366 Mycobacteriaceae TGT018L Mycobacterium phocaicum (EF551407) 98 1053 Gordoniaceae HGT018L Gordonia polyisoprenivorans (DQ154925) 98 1155 Gamma-proteobacteria Moraxellaceae TGT013L Acinetobacter radioresistens (GU145275) 99 1277 CTT004L Acinetobacter sp (AJ633641) 98 1268 Xanthomonadaceae KGT005L Stenotrophomonas maltophilia (AJ295671) 99 784 Beta-proteobacteria Burkholderiaceae TVT003L Burkholderia vietnamiensis (JF922108) 98 1182 DTT025L Cupriavidus sp (AB266608) 99 1148 15 Bảng 4.10: Kết định tên dòng vi khuẩn phân lập chất thải trại chăn ni heo có khả tích lũy poly-P cao theo trình tự gen 16S rRNA Nhóm xếp loại Tỉ lệ tương Chiều dài Lồi có quan hệ gần gũi dòng đồng (%) (bp) Bacilli Bacillaceae Bacillus aryabhattai (HQ908708) 99 1096 AGH005L Bacillus aryabhattai (HQ908708) 99 1017 DTH006L Bacillus aryabhattai (JN084155) 99 1254 DTH004L Bacillus aryabhattai (JN084155) 99 1273 STH008L Bacillus aryabhattai (JN128236) 99 1315 KGH007L Bacillus barbaricus (JN700207) 99 845 VLH002L Bacillus cereus (JN676164) 99 1250 TGH003L Bacillus cereus (JX544748) 99 1119 TVH003L Bacillus megaterium (GU257960) 99 1181 BTH014L Bacillus megaterium (JQ229803) 97 1170 KGH008L Bacillus megaterium (JQ996420) 99 1139 CMH002L Bacillus sp (AB733531) 99 1181 BLH002L Bacillus sp (AB733531) 98 1345 LAH003L Bacillus sp (AB733531) 98 1410 TGH021L Bacillus subtilis (HQ647257) 98 1172 VLH013L Actinobacteria Nocardiaceae Rhodococcus sp (EU912458) 97 1363 BLH006L Rhodococcus sp (HM004214) 99 1384 CTH008L Rhodococcus sp (GU357742) 98 1151 CTH015L Rhodococcus pyridinivorans (JQ229777) 98 1243 LAH002L Corynebacteriaceae Corynebacterium sp (JX290304) 98 1069 AGH006L Gamma-proteobacteria Moraxellaceae Acinetobacter sp (AJ633641) 98 1269 CMH012L Alpha-proteobacteria Hyphomicrobiaceae Xanthobacter flavus (AB680656) 99 1130 BTH008L Xanthobacter sp (HQ235023) 98 1041 TVH002L Rhizobiaceae Agrobacterium tumefaciens (JX110605) 98 1248 STH009L Brucellaceae Ochrobactrum tritici (AM490636) 97 1099 CTH020L Ochrobactrum tritici (AM490636) 98 1324 TGH001L 16 Qua tiến trình phân lập, tuyển chọn mơ tả đặc tính sinh học dịng vi khuẩn tích lũy poly-P chất thải trại chăn nuôi heo ao nuôi cá tra; kết nghiên cứu tạo nguồn vi khuẩn có khả tích lũy poly-P cao bao gồm 48 dịng với đặc tính chủ yếu như: chúng có dạng hình que dài que ngắn; chuyển động, dao động chổ khơng chuyển động; có diện hạt poly-P bắt màu đen quan sát tế bào kính hiển vi điện tử truyền quét; tích lũy poly-P hoạt động gen ppk1 chủ yếu thuộc hai dạng IIA IIC; khả tích lũy poly-P nội bào với hàm lượng từ 10-9 đến 10-12 mg/tế bào Thành phần giống loài đa dạng thuộc nhiều lớp vi khuẩn khác Bacilli, Actinobacteria, Gramma-proteobacteria, Beta-proteobacteria, Alphaproteobacteria Bên cạnh đó, thành phần số lượng lồi vi khuẩn tích lũy poly-P cao có khác địa điểm thu mẫu chất thải trại chăn nuôi heo ao nuôi cá tra 4.2.3 Phân tích đa dạng di truyền PAB Đánh giá đa dạng di truyền thông qua phân tích số đa dạng nucleotide số đa dạng lồi Shannon Việc sử dụng trình tự gen 16S rRNA để nghiên cứu phát sinh loài, phân loại dấu hiệu (marker) di truyền sử dụng rộng rãi (Janda Abbott, 2007) Phân tích tính đa hình đa dạng nucleotide vùng gen 16S rRNA phần mềm DNASP 5.10 (Rozas et al., 2003) kết hợp với chương trình BioEdit (Hall, 1999) kết trình bày Bảng 4.11 Bảng 4.11: Đa dạng nucleotide vùng gen 16S rRNA 48 dòng vi khuẩn Giá trị Chỉ số 48 Số trình tự 16S rRNA Đoạn nucleotide phân tích 1-988 Số vị trí nucleotide bắt cặp 716 Số vị trí đa hình nucleotide tỉ lệ (%) so với chiều dài DNA 364 (50,8%) Số Haplotype (h) 25 Đa dạng (gen) Haplotype (Hd) 0,90 Trung bình khác biệt nucleotide (k) 116,60 Số vị trí nucleotide khác biệt (số SNPs) 82,02 Pi (π) 0,16 0,11 Theta () Tajima’s D -0,41 17 Kết từ Bảng 4.11 cho thấy số vị trí đa hình/chiều dài trình tự gen 16S rRNA 364/716 (chiếm 50,8%) Số vị trí đa hình khác biệt (SNPs) quần thể 82,02 với số đa hình trung bình =0,11 có biến thiên tương đối cao đoạn trình tự từ vị trí 100 đến 816 (Hình 4.20) Đoạn nucleotide từ vị trí 112 đến 236 có tính đa hình cao =0,17 đoạn từ vị trí 277 đến 377 có tính đa hình thấp =0,06 100 816 100 816 Vị trí đa hình cao (a) Hình 4.20 Sự biến thiên số  vùng nucleotide từ có vị trí 100 đến 816 trình tự 16S rRNA 48 dịng vi khuẩn Vị trí đa dạng cao (b) Hình 4.23: Sự biến thiên số Pi vùng nucleotide có vị trí từ 100 đến 816 trình tự 16S rRNA 48 dịng vi khuẩn Sự biến thiên dấu SNP dẫn đến biến đổi số đa dạng Pi (Hình 2.23) Bảng 4.11 cho thấy trung bình khác biệt nucleotide, k=116,60 với số đa dạng trung bình Pi=0,16 có biến động lớn từ vị trí 100 đến 816 (Hình 4.23) Đoạn có đa dạng nucleotide cao Pi=0,3 nằm khoảng từ 112 đến 236 đoạn có đa dạng nucleotide thấp Pi=0,07 nằm khoảng 277 đến 377 Kết kiểm định Tajima’s D có số D= - 0,41 Điều cho thấy cấu trúc quần thể vi khuẩn tích lũy poly-P chất thải chăn ni heo ao nuôi cá tra khu vực ĐBSCL có phong phú lồi mức độ tương đồng gen số lồi cao tần số xuất đột biến nucleotide gen quần thể thấp Dựa kiểu nhóm dấu SNPs để xác định dạng haplotype phần mềm DNASP 5.10 (Rozas et al., 2003) Kết phân tích có tổng cộng 25 haplotype khác tạo từ 48 trình tự nucleotide Phân tích đa dạng 25 dạng haplotype tạo từ 48 trình tự DNA cho thấy chúng có đa dạng cao (Hd=0,9, Bảng 18 4.11) Điều cho thấy quần thể vi khuẩn tích lũy poly-P ĐBSCL có đa dạng haplotype (đa dạng gen) cao Bảng 4.12: Đa dạng nucleotide vùng gen 16S rRNA Chỉ số Số trình tự 16S rRNA Đoạn nucleotide phân tích Số vị trí nucleotide bắt cặp Số vị trí đa hình nucleotide tỉ lệ (%) so với chiều dài DNA Số Haplotype (h) Đa dạng (gen) Haplotype (Hd) Trung bình khác biệt nucleotide (k) Số vị trí nucleotide khác biệt (số SNPs) Pi (π) Theta () Tajima’s D Giá trị Ao nuôi cá tra Trại chăn nuôi heo 22 26 1-919 1-981 766 729 387 (50,5%) 308 (42,2%) 16 0,91 139,20 106,16 0,18 0,14 - 0,59 14 0,91 115,48 80,71 0,16 0,11 - 0,02 So sánh tính đa hình đa dạng nucleotide gen 16S rRNA nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập hai địa điểm lấy mẫu, kết trình bày Bảng 4.12 Ao ni cá tra Trại chăn ni heo 22 trình tự gen 16S rRNA có số 26 trình tự gen 16S rRNA có số vị trí đa hình/chiều dài trình tự vị trí đa hình/chiều dài trình tự gen 387/766 (chiếm 50,5%) gen 308/729 (chiếm 42,2%) 100 866 Vị trí đa hình cao Hình 4.27: Sự biến thiên số  vùng có vị trí từ 100 đến 866 Hình 4.27 cho thấy trị số trung bình =0,14 có biến thiên tương đối cao đoạn trình tự từ vị trí 100 đến 866 Đoạn nucleotide từ 119 đến 229 có 100 829 Vị trí đa hình cao Hình 4.28: Sự biến thiên số  vùng có vị trí từ 100 đến 829 Hình 4.28 cho thấy trị số trung bình =0,11 có biến thiên tương đối cao đoạn trình tự từ vị trí 100 đến 829 Đoạn nucleotide từ 108 đến 230 có tính 19 tính đa hình cao =0,33 đoạn 270 đến 369 có tính đa hình thấp =0,084 Bảng 4.12 cho thấy trung bình khác biệt nucleotide, k=139,20 với số Pi=0,18 có biến động lớn chuổi trình tự từ vị trí 100 đến 866 (Hình 4.29) Đoạn có đa dạng nucleotide cao Pi=0,32 nằm khoảng từ 119 đến 229 đoạn có đa dạng nucleotide thấp Pi=0,08 nằm khoảng 270 đến 369 đa hình cao =0,28 đoạn 271 đến 371 có tính đa hình thấp =0,072 Trung bình khác biệt k=115,48 với số Pi=0,16 có biến động lớn chuổi trình tự từ vị trí 100 đến 829 (Hình 4.30) Đoạn có đa dạng nucleotide cao Pi=0,28 nằm khoảng từ 108 đến 230 đoạn có đa dạng nucleotide thấp Pi=0,07 nằm khoảng 271 đến 371 100 100 866 Vị trí đa dạng cao Hình 4.29: Sự biến thiên số Pi vùng có vị trí từ 100 đế 866 Kết phân tích có tổng cộng 16 haplotype khác tạo từ 22 trình tự nucleotide Phân tích đa dạng 16 dạng haplotype cho thấy chúng có đa hình đa dạng cao [Hd=0,91 Điều cho thấy quần thể vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập từ chất thải ao ni cá tra có đa dạng haplotype (đa dạng gen) cao 829 Vị trí đa dạng cao Hình 4.30: Sự biến thiên số Pi vùng có vị trí từ 100 đến 829 Kết phân tích có tổng cộng 14 haplotype khác tạo từ 26 trình tự nucleotide Phân tích đa dạng 14 dạng haplotype cho thấy chúng có đa hình đa dạng cao [Hd=0,91 Điều cho thấy quần thể vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập từ chất thải chăn ni heo có đa dạng nucleotide đa dạng haplotype thấp tính bảo tồn gen cao nhóm vi khuẩn phân lập từ chất thải ao nuôi cá tra 20 So sánh tính đa dạng lồi hai quần thể vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập từ hai địa điểm thu mẫu chất thải chăn nuôi heo ao nuôi cá tra (Bảng 4.13) cho thấy tổng số dịng vi khuẩn phân lập có khả tích lũy poly-P cao khác hai địa điểm lấy mẫu số đa dạng (H′) giống Bảng 4.13: Chỉ số H′ J′ quần thể vi khuẩn tích lũy poly-P nước ao ni cá tra chất thải trại chăn nuôi heo Địa điểm thu mẫu Ao nuôi cá tra Chất thải trại nuôi heo Tổng số dòng vi khuẩn 22 26 H′ J′ 1,07 1,07 0,933 0,928 Chỉ số đa dạng loài (H′) hai quần thể vi khuẩn tích lũy poly-P nước ao nuôi cá tra chất thải trại chăn nuôi heo tương đối cao [H′=1,07; (Bảng 4.13)] Kết có tương đồng với nghiên cứu He et al., (2007) nghiên cứu đa dạng vi khuẩn tích lũy poly-P hệ thống xử lý nước thải Hoa kỳ, có số đa dạng loài Shannon H′ dao động từ 0,2 đến 1,45 số độ đồng J′ biến thiên từ 0,25 đến 0,95 Nhìn chung, dịng vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập thể phong phú loài đa dạng gen tương đối cao tần số xuất đột biến nucleotide lồi thấp Bên cạnh đó, trình tự 16S rRNA vi khuẩn trích lũy poly-P phân lập chất thải chăn ni heo có tính bảo trồn gen cao nhóm vi khuẩn trích lũy poly-P phân lập chất thải ao nuôi cá tra 4.3 Tuyển chọn ứng dụng dòng vi khuẩn xử lý phosphate nƣớc ao nuôi cá tra Thông qua trình tuyển chọn ban đầu từ 20 dịng vi khuẩn phân lập, dịng có khả làm giảm nhanh hàm lượng phosphate với hiệu suất loại bỏ từ 55,3% tới 76,6% sau 36 (Bảng 4.14) chủng vi khuẩn bổ sung vào mơi trường Năm dịng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu khả loại bỏ phosphate môi trường tổng hợp (môi trường Fillipe et al., 2001) Chỉ số OD dịch huyền phù vi khuẩn đo bước sóng 600nm Thơng qua xác định mật số tế bào [CFU/mL-Hoben Somasegaran (1982)], phương trình tuyến tính số OD.600 nm mật số vi khuẩn (CFU) thiết lập, làm sở để tính tốn mật số vi khuẩn dựa số OD.600 nm [Hình 4.3 (f)] 21 Bảng 4.14: Hiệu suất loại bỏ phosphate môi trường dòng vi khuẩn Hàm lượng PO43- Hàm lượng PO43- Tên dòng Hiệu suất bỏ (%) ban đầu mg/L lại 36 (mg/L) TGT025L VLH013L TGT013L AGH006L BTT006L DTT001L 19,8 19,1 19,7 20,3 20,7 20,5 4,6 8,2 5,6 9,2 13,6 76,6 57,3 71,3 55,8 55,3 33,5 Năm dòng vi khuẩn tăng sinh tốt môi trường Filipe et al., (2001) đạt mật số >108 sau 25 ni cấy (Hình 4.33) (f) Hình 4.33: Sự biến đổi hàm lượng PO43- số OD.600 nm Ghi chú: (a) dòng TGT025L, (b) dòng AGH006L, (c) dòng TGT013L, (d) dòng BTT006L, (e) dòng VLH013L (f) trương quan số OD.600 nm mật số vi khuẩn dòng TGT025L 22 Trong 10 đầu dòng TGT013L, TGT025L AGH006L tăng sinh nhanh (OD.600 nm>0,4; tương đương mật số>106 CFU/mL) khác biệt (P0,2; tương đương mật số>104 CFU/mL) Sự tăng nhanh sinh khối dòng TGT013L, TGT025L AGH006L kéo theo hàm lượng phosphate lại mơi trường thấp (hàm lượng PO43-0,6; tương đương mật số >108 CFU/mL) sau 25 nuôi cấy Khi so sánh hiệu suất loại bỏ phosphate dịng vi khuẩn thí nghiệm, Hình 4.33 cho thấy dịng TGT025L TGT013L có lực cao khả hấp thu PO43-dẫn đến hiệu suất loại bỏ phosphate cao đạt 85,3% dòng TGT025L 76,6% dòng TGT013L sau 25 cấy bổ sung vi khuẩn, khác biệt có ý nghĩa thống kê (P