Đang tải... (xem toàn văn)
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Theo định hướng đến năm 2020, thủy sản là ngành xuất khẩu chủ lực của Việt Nam, góp phần quan trọng đưa nền kinh tế nông, lâm, ngư nghiệp phát triển bền vững với tốc độ tăng trưởng khoảng trên 7%/năm, giá trị xuất khẩu dự kiến đạt mức 10-10,5 tỷ USD. Năm 2012, theo thống kê của VASEP (Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers) mặc dù đã đạt được mức độ tăng trưởng cao nhưng giá trị xuất khẩu hàng hóa các sản phẩm thủy sản lại không tăng. Do đó, việc nâng cao giá trị xuất khẩu của các sản phẩm thủy sản đã được đặt ra và cần phải giải quyết, trong đó thức ăn là một khâu quan trọng, mang tính đột phá đối với ngành nuôi trồng thủy sản (NTTS). Hiện nay, ngoài thức ăn nhân tạo thì nguồn thức ăn sống như vi tảo biển (VTB) đóng vai trò vô cùng quan trọng trong sự phát triển của hầu hết các đối tượng nuôi thủy sản. VTB rất giàu dinh dưỡng, rẻ tiền, dễ tiêu hóa và là nguồn cung cấp các axít béo không bão hòa đa nối đôi (PUFAs-Polyunsaturated fatty acids) như axít docosahexaenoic (DHA, C22:6n-3), axít eicosapentaenoic (EPA, C20:5n-3) và axít arachidonic (AA, C20:4n-6) rất cần thiết cho sự phát triển của vật nuôi ở giai đoạn ấu trùng. Một số loài VTB được sử dụng rộng rãi và phổ biến làm thức ăn sống trong NTTS như Isochrysis galbana, Chaetoceros gracilis, Chlorella vulgaris, Nannochloropsis oculata, Tetraselmis chuii. Tuy nhiên, hầu hết các trại NTTS ở Việt Nam đều chưa nuôi chủ động được nguồn thức ăn sống nêu trên mà chủ yếu vẫn là bơm nước biển tự nhiên vào bể nuôi. Ngoài ra, các giống tảo sử dụng trong NTTS đa phần có nguồn gốc nhập ngoại, khó thích nghi với điều kiện khí hậu tự nhiên của Việt Nam. Do đó, các giống này sau một thời gian nuôi trồng không có khả năng nhân nhanh sinh khối, dễ bị tạp nhiễm và cuối cùng bị thoái hóa và mất giống. Để chủ động cung cấp nguồn giống VTB thuần chủng, giàu dinh dưỡng theo định hướng làm thức ăn sống cho các đối tượng NTTS, cần phải phân lập, lựa chọn được các chủng giống thích nghi với khí hậu của Việt Nam, có khả năng nuôi trồng trên quy mô lớn và cho năng suất, chất lượng sinh khối cao. Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số loài vi tảo biển quang tự dƣỡng thuộc hai chi Isochrysis và Nannochloropsis phân lập ở Việt Nam với mục đích ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản” 2. Mục tiêu của đề tài - Phân lập, lựa chọn, định tên khoa học và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của các loài vi tảo biển thuộc hai chi Isochrysis và Nannochloropsis; - Chọn 2 loài vi tảo biển thuộc 2 chi nêu trên có khả năng lưu giữ thuần chủng, nhân nhanh sinh khối, nuôi trồng trên quy mô lớn và sinh khối giàu dinh dưỡng làm thức ăn cho một số đối tượng NTTS. 3. Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập các loài vi tảo biển thuộc 2 chi Isochrysis và Nannochloropsis từ vùng biển của Việt Nam có khả năng sử dụng làm thức ăn sống trong NTTS; 2. Định tên khoa học các chủng vi tảo biển phân lập được dựa trên các đặc điểm hình thái, đọc và so sánh trình tự của đoạn gen 18S rRNA; Đăng ký trình tự đoạn gen 18S rRNA của các chủng này trên Ngân hàng gen (Genbank); 3. Nghiên cứu lưu giữ các chủng giống VTB có được với sự hỗ trợ của một số chất bảo quản ở nhiệt độ thấp hoặc nhiệt độ phòng, xác định khả năng hoạt hóa chúng; 4. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, thành phần dinh dưỡng của chủng Isochrysis galbana HP1 và Nannochloropsis oculata HP2; 5. Đánh giá khả năng chống chịu với điều kiện môi trường nuôi bất lợi của các chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 so với các chủng phân lập ở Singapore; 6. Nhân nuôi sinh khối trong điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài tự nhiên các chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 để làm thức ăn sống cho các loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ như ngao Bến tre (Meretrix lyrata Sowerby, 1851); hầu Thái bình dương (Crassostrea gigas Thunberg, 1793) và tu hài (Lutraria rhyncheana Jonas, 1844). 4. Những đóng góp mới của luận án 1. Phân lập thành công và dựa trên các đặc điểm hình thái và giải mã đoạn gen 18S rRNA đã xác định được tên 2 chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2; 2. Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học chính, thành phần dinh dưỡng và khả năng chống chịu với điều kiện nuôi bất lợi của các chủng tiềm năng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 so với các chủng có nguồn gốc nhập ngoại; 3. Lần đầu tiên đã thành công trong nuôi sinh khối chủng N. oculata HP2 ở hệ thống nuôi kín dạng ống tự thiết kế (với điều kiện không sử dụng bơm chỉ dùng máy nén khí) có dung tích 20 L, đạt mật độ tế bào cao (gần 200 triệu tb/mL); 4. Đã sử dụng sinh khối chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 cùng với sinh khối các loài VTB khác làm thức ăn sống cho một số đối tượng động vật thân mềm hai mảnh vỏ như ngao Bến tre, hầu Thái bình dương và tu hài, góp phần quan trọng trong việc sản xuất giống thủy sản sạch bệnh, chất lượng cao và thúc đẩy nghề nuôi trồng thủy sản phát triển bền vững. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Kết quả nghiên cứu thu được trong luận án này là cơ sở khoa học để nghiên cứu sâu về đặc điểm sinh học của 2 chủng VTB I. galbana HP1 và N. oculata HP2 phân lập được từ vùng biển Việt Nam và bổ sung cơ sở dữ liệu cho tập đoàn giống VTB có nguồn gốc của Việt Nam; cung cấp số liệu khoa học cho phép khẳng định tính chống chịu cao với điều kiện bất lợi của các chủng phân lập được từ Việt Nam so với nhập ngoại; khả năng sử dụng hệ thống nuôi kín tự thiết kế trong việc cung cấp giống ban đầu cho nuôi trồng VTB ở các hệ thống nuôi hở. Các kết quả của luận án có ý nghĩa thực tiễn đối với các trại sản xuất giống NTTS ở Việt Nam trong việc chủ động lưu giữ, nuôi trồng và thu sinh khối 2 chủng I. galbana HP1 và N. oculata HP2 làm thức ăn sống cho một số loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ như ngao Bến tre, tu hài và hầu Thái bình dương. 6. Bố cục của luận án Luận án gồm 133 trang, trong đó phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 30 trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 23 trang, kết quả 57 trang, bàn luận 17 trang, kết luận và kiến nghị 3 trang, danh mục các công trình đã công bố 1 trang, tài liệu tham khảo 12 trang với 167 tài liệu tham khảo, tóm tắt kết quả nghiên cứu bằng tiếng Anh 9 trang. Trong luận án có 30 Bảng và 48 Hình.
MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Theo định hướng đến năm 2020, thủy sản ngành xuất chủ lực Việt Nam, góp phần quan trọng đưa kinh tế nông, lâm, ngư nghiệp phát triển bền vững với tốc độ tăng trưởng khoảng 7%/năm, giá trị xuất dự kiến đạt mức 10-10,5 tỷ USD Năm 2012, theo thống kê VASEP (Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers) đạt mức độ tăng trưởng cao giá trị xuất hàng hóa sản phẩm thủy sản lại khơng tăng Do đó, việc nâng cao giá trị xuất sản phẩm thủy sản đặt cần phải giải quyết, thức ăn khâu quan trọng, mang tính đột phá ngành ni trồng thủy sản (NTTS) Hiện nay, ngồi thức ăn nhân tạo nguồn thức ăn sống vi tảo biển (VTB) đóng vai trị vơ quan trọng phát triển hầu hết đối tượng nuôi thủy sản VTB giàu dinh dưỡng, rẻ tiền, dễ tiêu hóa nguồn cung cấp axít béo khơng bão hịa đa nối đơi (PUFAs-Polyunsaturated fatty acids) axít docosahexaenoic (DHA, C22:6n-3), axít eicosapentaenoic (EPA, C20:5n-3) axít arachidonic (AA, C20:4n-6) cần thiết cho phát triển vật nuôi giai đoạn ấu trùng Một số loài VTB sử dụng rộng rãi phổ biến làm thức ăn sống NTTS Isochrysis galbana, Chaetoceros gracilis, Chlorella vulgaris, Nannochloropsis oculata, Tetraselmis chuii Tuy nhiên, hầu hết trại NTTS Việt Nam chưa nuôi chủ động nguồn thức ăn sống nêu mà chủ yếu bơm nước biển tự nhiên vào bể ni Ngồi ra, giống tảo sử dụng NTTS đa phần có nguồn gốc nhập ngoại, khó thích nghi với điều kiện khí hậu tự nhiên Việt Nam Do đó, giống sau thời gian ni trồng khơng có khả nhân nhanh sinh khối, dễ bị tạp nhiễm cuối bị thối hóa giống Để chủ động cung cấp nguồn giống VTB chủng, giàu dinh dưỡng theo định hướng làm thức ăn sống cho đối tượng NTTS, cần phải phân lập, lựa chọn chủng giống thích nghi với khí hậu Việt Nam, có khả ni trồng quy mô lớn cho suất, chất lượng sinh khối cao Xuất phát từ vấn đề nêu trên, tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học số loài vi tảo biển quang tự dƣỡng thuộc hai chi Isochrysis Nannochloropsis phân lập Việt Nam với mục đích ứng dụng nuôi trồng thủy sản” Mục tiêu đề tài - Phân lập, lựa chọn, định tên khoa học nghiên cứu đặc điểm sinh học loài vi tảo biển thuộc hai chi Isochrysis Nannochloropsis; - Chọn loài vi tảo biển thuộc chi nêu có khả lưu giữ chủng, nhân nhanh sinh khối, nuôi trồng quy mô lớn sinh khối giàu dinh dưỡng làm thức ăn cho số đối tượng NTTS Nội dung nghiên cứu Phân lập loài vi tảo biển thuộc chi Isochrysis Nannochloropsis từ vùng biển Việt Nam có khả sử dụng làm thức ăn sống NTTS; Định tên khoa học chủng vi tảo biển phân lập dựa đặc điểm hình thái, đọc so sánh trình tự đoạn gen 18S rRNA; Đăng ký trình tự đoạn gen 18S rRNA chủng Ngân hàng gen (Genbank); Nghiên cứu lưu giữ chủng giống VTB có với hỗ trợ số chất bảo quản nhiệt độ thấp nhiệt độ phòng, xác định khả hoạt hóa chúng; Nghiên cứu đặc điểm sinh học, thành phần dinh dưỡng chủng Isochrysis galbana HP1 Nannochloropsis oculata HP2; Đánh giá khả chống chịu với điều kiện môi trường nuôi bất lợi chủng I galbana HP1 N oculata HP2 so với chủng phân lập Singapore; Nhân ni sinh khối điều kiện phịng thí nghiệm tự nhiên chủng I galbana HP1 N oculata HP2 để làm thức ăn sống cho loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ ngao Bến tre (Meretrix lyrata Sowerby, 1851); hầu Thái bình dương (Crassostrea gigas Thunberg, 1793) tu hài (Lutraria rhyncheana Jonas, 1844) Những đóng góp luận án Phân lập thành công dựa đặc điểm hình thái giải mã đoạn gen 18S rRNA xác định tên chủng I galbana HP1 N oculata HP2; Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học chính, thành phần dinh dưỡng khả chống chịu với điều kiện nuôi bất lợi chủng tiềm I galbana HP1 N oculata HP2 so với chủng có nguồn gốc nhập ngoại; Lần thành công nuôi sinh khối chủng N oculata HP2 hệ thống ni kín dạng ống tự thiết kế (với điều kiện không sử dụng bơm dùng máy nén khí) có dung tích 20 L, đạt mật độ tế bào cao (gần 200 triệu tb/mL); Đã sử dụng sinh khối chủng I galbana HP1 N oculata HP2 với sinh khối loài VTB khác làm thức ăn sống cho số đối tượng động vật thân mềm hai mảnh vỏ ngao Bến tre, hầu Thái bình dương tu hài, góp phần quan trọng việc sản xuất giống thủy sản bệnh, chất lượng cao thúc đẩy nghề nuôi trồng thủy sản phát triển bền vững Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Kết nghiên cứu thu luận án sở khoa học để nghiên cứu sâu đặc điểm sinh học chủng VTB I galbana HP1 N oculata HP2 phân lập từ vùng biển Việt Nam bổ sung sở liệu cho tập đồn giống VTB có nguồn gốc Việt Nam; cung cấp số liệu khoa học cho phép khẳng định tính chống chịu cao với điều kiện bất lợi chủng phân lập từ Việt Nam so với nhập ngoại; khả sử dụng hệ thống ni kín tự thiết kế việc cung cấp giống ban đầu cho nuôi trồng VTB hệ thống nuôi hở Các kết luận án có ý nghĩa thực tiễn trại sản xuất giống NTTS Việt Nam việc chủ động lưu giữ, nuôi trồng thu sinh khối chủng I galbana HP1 N oculata HP2 làm thức ăn sống cho số loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ ngao Bến tre, tu hài hầu Thái bình dương Bố cục luận án Luận án gồm 133 trang, phần mở đầu trang, tổng quan tài liệu 30 trang, vật liệu phương pháp nghiên cứu 23 trang, kết 57 trang, bàn luận 17 trang, kết luận kiến nghị trang, danh mục công trình cơng bố trang, tài liệu tham khảo 12 trang với 167 tài liệu tham khảo, tóm tắt kết nghiên cứu tiếng Anh trang Trong luận án có 30 Bảng 48 Hình CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Từ lâu vi tảo nói chung VTB nói riêng coi nguồn thực phẩm chức quan trọng cho người động vật; nguồn phân bón; cung cấp chất có hoạt tính sinh học dùng làm thuốc, mỹ phẩm, dược phẩm; có vai trị bảo vệ mơi trường cố định CO2 Trong đó, ứng dụng phổ biến vi tảo làm thức ăn sống cho đối tượng NTTS VTB I galbana N oculata có kích thước nhỏ, dao động 2-4 µm, dễ tiêu hóa, khơng độc, giàu dinh dưỡng nguồn cung cấp PUFAs DHA EPA (Brown et al., 2002) Cụ thể, hàm lượng DHA lồi I galbana dao động 9-11% so với tổng số axit béo (Total fatty acids, TFA), chí lên tới 17,5% so với TFA (Liu et al., 2013), hàm lượng EPA lồi N oculata dao động 24,5-40% so với TFA, hàm lượng PUFAs thay đổi tùy theo điều kiện ni cấy VTB I galbana khơng phải lồi có khả thích nghi với biến động rộng mơi trường cịn N oculata ngược lại, chúng có khả hỗ trợ lẫn mặt sinh trưởng q trình nhân ni, đảm bảo cung cấp sinh khối giàu dinh dưỡng cho đối tượng ni Chính vậy, sinh khối lồi VTB nói sử dụng phổ biến làm thức ăn sống cho hầu hết đối tượng động vật thân mềm hai mảnh vỏ, góp phần nâng cao khả sống sót chất lượng ấu trùng nuôi Hiện nay, nhu cầu sử dụng loài N oculata I galbana làm thức ăn sống cho đối tượng NTTS khác ngày tăng cao giá trị dinh dưỡng chúng, đặc biệt nguồn cung cấp PUFAs Do vậy, cần phải có giải pháp kỹ thuật ni trồng tảo có chất lượng cao với giá thành thấp Trên giới, hệ thống ni kín sử dụng để ni sinh khối hai lồi nêu nhằm nâng cao suất hàm lượng chất có hoạt tính sinh học DHA, EPA (Briassoulis et al., 2010; Feng et al., 2011; Patil et al., 2007) Ở Việt Nam việc nuôi trồng lồi VTB hệ thống ni kín cịn mẻ, chủ yếu nuôi hệ thống nuôi hở (túi nilong, bể composit,…) Do vậy, suất chất lượng sinh khối vi tảo thu không đảm bảo, gây ảnh hưởng không nhỏ đến khả sản xuất trại NTTS Gần đây, nghiên cứu tìm kiếm, lựa chọn, thay chủ động nguồn thức ăn ngoại nhập nguồn nước rẻ tiền, giàu dinh dưỡng tiến hành Việt Nam VTB dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 có khả tổng hợp lượng lớn PUFAs, hàm lượng lipit tổng số chiếm gần 40-70% sinh khối khô, tổng số axít béo chiếm 90% so với lipit tổng số, hàm lượng DHA DPA chiếm đến 50-60% so với TFA (Đặng Diễm Hồng cs., 2008) Do vậy, để chủ động nguồn giống tảo cung cấp cho đối tượng NTTS việc phân lập, lưu giữ, nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng VTB thuộc chi Isochrysis Nannochloropsis Việt Nam với định hướng ứng dụng làm thức ăn sống cho động vật thân mềm hai mảnh vỏ ngao Bến tre (Meretrix lyrata Sowerby, 1851); hầu Thái bình dương (Crassostrea gigas Thunberg, 1793) tu hài (Lutraria rhyncheana Jonas, 1844) cần thiết; kết nghiên cứu thu góp phần đáp ứng yêu cầu thực tế ngành NTTS phát triển bền vững có chất lượng cao đặt Việt Nam CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu - Mẫu VTB thu cảng Bến Bèo, huyện đảo Cát Bà, thành phố Hải Phòng tháng 3/2008, vùng biển Quất Lâm, Nam Định, Quảng Ninh Nha Trang, Khánh Hòa tháng 4/2009 - Các mẫu VTB thuộc chi Isochrysis Nannochloropsis sau phân lập nuôi cấy ổn định điều kiện phịng thí nghiệm, lưu giữ mơi trường thạch, lỏng cung cấp giống để thực nội dung nghiên cứu luận án - Hai chủng VTB N oculata LB2164 I galbana LB2307 phân lập vùng biển Singapore (do TS Đoàn Thị Thái Yên, khoa Khoa học kỹ thuật môi trường, Trường Đại học quốc gia Singapore cung cấp) lưu giữ sưu tập giống Phịng Cơng nghệ Tảo, Viện Cơng nghệ sinh học, VAST - Ngao Bến tre (Meretrix lyrata Sowerby, 1851) thu bãi nuôi vùng biển xã Giao Xuân, huyện Giao Thuỷ, Nam Định doanh nghiệp tư nhân Cửu Dung cung cấp Hầu Thái bình dương (Crassostrea gigas Thunberg, 1793) nuôi trại NTTS phịng Sinh học thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Ni trồng Thủy sản (Nha Trang, Khánh Hòa) Tu hài (Lutraria rhyncheana Jonas, 1844) nuôi trại NTTS Trung tâm phát triển nghề cá đa dạng sinh học vịnh Bắc Bộ thuộc Viện Nghiên cứu Hải sản, thị trấn Cát Bà, huyện Cát Hải, thành phố Hải Phòng - Sinh khối VTB dị dưỡng S mangrovei PQ6 sử dụng làm thức ăn sống cho tu hài bố mẹ hầu Thái bình dương Phịng Cơng nghệ Tảo, Viện CNSH nuôi trồng bảo quản 0ºC sử dụng - Trình tự cặp mồi nhân đoạn gen 18S rRNA với kích thước khoảng 1100 bp Phịng Cơng nghệ Tảo, Viện CNSH thiết kế sử dụng với Primer F: 5’TACCACATCTAAGGAAGGCAGCAG-3’(24 nu) Primer R: 5’GGCATCACAGACCTGTTATTGC-3’ (22 nu) 2.2 Hóa chất Các hóa chất sử dụng nghiên cứu thông dụng phịng thí nghiệm, đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phân lập loài vi tảo biển thuộc chi Isochrysis Nannochloropsis: theo Andersen (2005) có số cải tiến cho phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm Việt Nam 2.3.2 Chụp ảnh hình thái tế bào kính hiển vi quang học (Light Microcope) kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscope –SEM); cố định mẫu glutaradehyde trước chụp ảnh kính JEOL, JSM-6400 (Nhật Bản) 2.3.3 Lưu giữ, bảo quản mẫu vi tảo phân lập nhiệt độ phòng (trong môi trường lỏng môi trường thạch) nhiệt độ thấp (-80C) có sử dụng 10% DMSO 2.3.4 Các phương pháp sinh học phân tử: đọc so sánh trình tự nucleotide đoạn gen 18S rRNA chủng Isochrysis sp HP1 Nannochloropsis sp HP2 tiềm tiến hành theo Sambrook Rusell (2001) Các chương trình phần mềm chuyên dụng DNA Club, ClustalX 1.83, DNASTAR, MEGA4 BLAST sử dụng cho phân tích, so sánh xây dựng phát sinh chủng loại mẫu Isochrysis sp Nannochloropsis sp nghiên cứu 2.3.5 Xác định sinh trưởng chủng Isochrysis sp Nannochloropsis sp đo mật độ quang bước sóng 680nm, đếm mật độ tế bào (MĐTB) sử dụng buồng đếm Burker-Turk (Đức), xác định tốc độ sinh trưởng đặc trưng (Guillard and Sieracki, 2005) sinh khối khô (sấy 105C), hàm lượng chlorophyll a carotenoit 2.3.6 Phân tích thành phần hàm lượng dinh dưỡng, kim loại nặng, lipit axit béo sinh khối chủng I galbana HP1 N oculata HP2 - Xác định hàm lượng lipit sinh khối tảo: theo phương pháp Bligh and Dyer (1959) có số cải tiến cho phù hợp với điều kiện Việt Nam - Thành phần hàm lượng axít béo sinh khối chủng I galbana HP1 N oculata HP2: xác định máy sắc kí khí HP-6890 theo mô tả Đặng Diễm Hồng cs., (2007) - Phân tích thành phần dinh dưỡng kim loại nặng chủng nói tiến hành theo Horwitz (2000) 2.3.7 Xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh trưởng chủng I galbana HP1 N oculata HP2: nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng (với ba môi trường Walne, F/2 Erd), nồng độ muối (dao động từ - 60‰), nhiệt độ (15 40C), ánh sáng (60 - 800 mol/m2/s), pH (3 - 11) lên sinh trưởng phát triển chủng VTB nói (với chu kỳ sáng tối 12:12h) (Durmaz, 2007) 2.3.8 Nghiên cứu khả chống chịu với điều kiện môi trường nuôi bất lợi chủng I galbana HP1 N.oculata HP2 phân lập từ vùng biển Việt Nam Singapore: so sánh khả chống chịu chủng N oculata HP2 LB2164, điều kiện môi trường nuôi cực trị như: nhiệt độ (11 55°C), ánh sáng (500 mol/m2.s), pH (3 11) nồng độ muối (2 70‰) lên sinh trưởng tảo khả phục hồi chúng sau ngày ni điều kiện thích hợp cho sinh trưởng Tương tự, chủng I galbana HP1 LB2307 - nhiệt độ (11 45°C), ánh sáng (400 mol/m2/s), pH (3 11) nồng độ muối (5 70‰) lên sinh trưởng tảo khả phục hồi chúng sau ngày ni điều kiện thích hợp cho sinh trưởng Sinh trưởng chủng đánh giá thông qua xác định mật độ quang bước sóng 680nm đếm MĐTB 2.3.9 Phương pháp nuôi chủng I galbana HP1 N oculata HP2 quy mơ phịng thí nghiệm pilot; thiết kế nuôi thành công chủng N oculata HP2 hệ thống ni kín dạng ống tự thiết kế (20-26 L) 2.3.10 Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm sử dụng sinh khối I galbana HP1, N.oculata HP2, S mangrovei PQ6 để ni số lồi nhuyễn thể hai mảnh vỏ 2.4 Xử lý số liệu Số liệu trình bày dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Sử dụng phương pháp phân tích phương sai yếu tố (oneway – ANOVA) để so sánh khác biệt có ý nghĩa thống kê (P< 0,05) CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân lập nghiên cứu đặc điểm sinh học loài VTB thuộc chi Isochrysis Nannochloropsis 3.1.1 Phân lập loài VTB thuộc chi Isochrysis Nannochloropsis dựa đặc điểm hình thái Từ mẫu nước thu vùng biển Hải Phòng, Nam Định, Quảng Ninh, Nha Trang- Khánh Hịa, chúng tơi phân lập mẫu Isochrysis spp mẫu Nannochloropsis spp Hình thái tế bào mẫu Isochrysis spp có dạng đơn bào, hình cầu elip, màu nâu vàng, có roi nhau, dài 7 µm, có khả chuyển động đứng n, có kích thước chiều dài 4,4 - 5,3 μm; chiều rộng 2,7 – 3,5 μm; chiều dầy 2,1 – 3,0 μm Tế bào mẫu Nannochloropsis spp có dạng đơn bào, dạng hình trứng, khơng có roi, màu xanh, kích thước dao động khoảng 2,6 - 3,6 μm (Hình 3.1 Hình 3.2) x 1500 µm Isochrysis sp HP1 x 1500 µm Isochrysis sp NT1 x 2000 x 1500 Isochrysis sp NĐ1 x 2000 µm µm µm x 2000 µm Nannochloropsis sp HP2 Nannochloropsis sp QN1 Nannochloropsis sp NT2 Hình 3.1 Hình thái tế bào mẫu Isochrysis spp Nannochloropsis spp phân lập vùng biển Việt Nam dƣới kính hiển vi quang học Dựa đặc điểm hình thái (quan sát kính hiển vi quang học kính hiển vi điện tử quét), phân lập chủng Isochrysis spp chủng Nannochloropsis spp vùng biển Hải Phòng, Nam Định, Quảng Ninh Nha Trang - Khánh Hòa năm 2008-2009 x 10000 Isochrysis sp HP1 x 15000 Nannochloropsis sp HP2 x 10000 Isochrysis sp NĐ1 x 15000 x 10000 Isochrysis sp NT1 x 15000 Nannochloropsis sp QN1 Nannochloropsis sp NT2 Hình 3.2 Hình thái tế bào mẫu Isochrysis spp Nannochloropsis spp dƣới kính hiển vi điện tử quét 3.1.2 Lƣu giữ chủng VTB thuộc chi Isochrysis Nannochloropsis 3.1.2.1 Lưu giữ giống nhiệt độ phòng Việc lưu giữ chủng giống Isochrysis spp Nannochloropsis spp sau phân lập điều kiện phịng thí nghiệm có ý nghĩa quan trọng, góp phần bổ sung cho sưu tập giống Phịng Cơng nghệ Tảo Ở nhiệt độ phịng, chúng tơi lưu giữ chủng môi trường lỏng Mẫu cấy chuyển với chu kỳ 1-2 tháng/lần tùy thuộc vào đặc điểm sinh học chủng lưu giữ đợt cấy chuyển liên tiếp (3 hệ) Giữ giống VTB mơi trường lỏng có ưu điểm dễ tiến hành có khả hoạt hóa mẫu nhanh Tuy nhiên, phải cấy chuyển thường xuyên nên khả mẫu bị nhiễm khuẩn, nhiễm chéo lớn, tốn diện tích lưu giữ, mơi trường ni, thời gian cơng sức cấy chuyển Vì vậy, để khắc phục đảm bảo cung cấp nguồn giống ổn định lâu dài, tiến hành lưu giữ chủng giống phân lập mơi trường thạch có bổ sung 1,2% agar (Hình 3.3) Isochrysis sp HP1 Isochrysis sp NĐ1 Isochrysis sp NT1 Nannochloropsis sp HP2 Nannochloropsis sp QN1 Nannochloropsis sp NT2 Hình 3.3 Khuẩn lạc chủng Isochrysis spp Nannochloropsis spp phân lập đƣợc môi trƣờng thạch 3.1.2.2 Lưu giữ giống nhiệt độ thấp Chúng lưu giữ chủng Nannochloropsis sp HP2 - 80°C có bổ sung 10%DMSO Kết sau 24 ngày hoạt hóa trở lại nhiệt độ phịng, chủng có tỉ lệ sống sót cao nhất, đạt 62,45% (ngày thứ 18 sau hoạt hóa) tỷ lệ sống sót tự nhiên chúng đạt có 35,44% (Hình 3.4) Hình 3.4 Tỷ lệ sống sót chủng Nannochloropsis sp HP2 nhiệt độ - 80°C có sử dụng 10% DMSO Kết bảo quản chủng Isochrysis sp HP1 -80°C có bổ sung 10% DMSO cho thấy sau ngày hoạt hóa trở lại nhiệt độ phịng, tỷ lệ sống sót chúng đạt 7,3%; tế bào bị vỡ khơng có khả phục hồi trở lại nhiệt độ phịng Vì vậy, chúng tơi tiến hành lưu giữ chủng Isochrysis sp HP1 phân lập môi trường lỏng nhiệt độ phòng 3.1.2.3 Sàng lọc nhanh chủng tiềm cho nuôi trồng thủy sản Các chủng VTB phân lập vùng biển Việt Nam sử dụng làm thức ăn sống cho NTTS cần phải hội tụ số đặc điểm như: sinh trưởng nhanh, giàu dinh dưỡng có khả ni trồng qui mơ lớn Dựa khả sinh trưởng chủng phân lập môi trường lỏng (đánh giá qua MĐTB, thời gian đạt mật độ cực đại tốc độ sinh trưởng đặc trưng), thành phần dinh dưỡng (hàm lượng protein, lipit hydratcacbon), chọn chủng tiềm Isochrysis sp HP1 Nannochloropsis sp HP2 phân lập từ vùng biển Hải Phòng làm đối tượng nghiên cứu cho thí nghiệm 3.1.3 Định tên khoa học chủng thuộc chi Isochrysis Nannochloropsis kỹ thuật đọc so sánh trình tự nuleotit đoạn gen 18S rRNA * Kết tách dòng đoạn gen 18S rRNA chủng tiềm Isochrysis sp HP1 Nannochloropsis sp HP2 trình bày Hình 3.5 * Trình tự nucleotide đoạn gen 18S rRNA chủng Isochrysis sp HP1 Độ phần trăm tương đồng gen 18S rRNA loài thuộc chi Isochrysis cao từ 81,5% đến 99,5% Hai loài Crypthecodinium cohnii (Seligo) Chatto Fucus distichus Linnaeus sử dụng làm nhóm ngoại chi Isochrysis Trên phát sinh chủng loại chi Isochrysis chia thành nhánh, nhánh thứ lồi C cohnii có độ tương đồng so với loài thuộc chi Isochrysis đạt 81,5%; nhánh thứ chia thành nhánh phụ, nhánh phụ thứ loài F distichus (độ tương đồng đạt 84%) nhánh phụ thứ loài thuộc chi Isochrysis Trong đó, chủng Isochrysis sp HP1 phân lập từ vùng biển Hải Phịng có tỷ lệ phần trăm tương đồng cao 99,5% với loài I galbana Parke (AJ246266), đến loài Isochrysis sp CCAP 927/14 (DQ79859) đạt 99,4% thấp loài Isochrysis sp MIBC 10557 (AB183617) đạt 98,0% Do vậy, dựa đặc điểm hình thái, tỷ lệ phần trăm tương đồng phát sinh chủng loại loài thuộc chi Isochrysis, chúng tơi kết luận chủng Isochrysis sp HP1 phân lập từ vùng biển Hải Phòng lồi Isochrysis galbana Parke 1949 (hình 3.6) A B C D Hình 3.5 Tách dịng đoạn gen 18S rRNA chủng Isochrysis sp HP1 Nannochloropsis sp HP2 A: DNA tổng số chủng HP1 HP2 (lane 2); B: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen 18S rRNA chủng HP1 HP2 (lane 4); C: Sản phẩm PCR tinh chủng HP1 HP2 (lane 6); D: PCR checking chủng HP1 (lane 7, 9) chủng HP2 (lane 10, 11, 12) M: Thang DNA chuẩn Kb Plus Ladder * Trình tự nucleotide đoạn gen 18S rRNA chủng Nannochloropsis sp HP2 Độ tương đồng loài thuộc chi Nannochloropsis dao động từ 84,0% đến 99,0% Trong đó, chúng tơi sử dụng chi Aphanochaete, Bulbochaete, Chaetophora, Oedogonium nhóm ngoại - chi có quan hệ gần gũi với chi Nannochloropsis Chủng Nannochloropsis sp HP2 phân lập Hải Phòng có độ tương đồng cao với lồi N oculata (AF045045) đạt 99,0%, N granulate (AF045043) đạt 98,7% thấp loài N gaditana (AF133819) đạt 97,5% Kết hợp tỷ lệ phần trăm tương đồng phát sinh chủng loại (Hình 3.6), chúng tơi kết luận chủng Nannochloropsis sp HP2 phân lập từ vùng biển Hải Phịng thuộc lồi N oculata chúng có độ tương đồng đạt 99,0% với lồi N oculata (Droop) Hibberd 1981 có mã số (AF045045) 3.1.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng I galbana HP1 N oculata HP2 3.1.4.1 Đặc điểm sinh học chủng I galbana HP1 Điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh trưởng chủng I galbana HP1 môi trường dinh dưỡng F/2, độ mặn 30‰, nhiệt độ 25C, CĐAS 100 μmol/m2/s, pH Thành phần axít béo sinh khối chủng HP1 pha khác đường cong sinh trưởng xác định (Bảng 3.1) B A Hình 3.6 Cây phát sinh chủng loại chủng Isochrysis sp HP1 (A) Nannochloropsis sp HP2 (B) phân lập từ vùng biển Hải Phịng Bảng 3.1 Thành phần hàm lƣợng axít béo chủng I galbana HP1 pha sinh trƣởng khác (% so với TFA) Pha sinh Pha sinh trƣởng Pha cân trƣởng Pha cân Axít béo Tên khoa học theo tuyến sớm hàm số muộn tính mũ (log) C10:0 C12:0 C14:0 C14:1n-5 C15: C15:1n-5 C16:0 C16:1n-7 C17:0 C17:1n-7 C18:0 C18:1n-9 C18:1n-7 C18:2 n-6 0,2±0,0 Vết 7,9±0,9 0,1±0,0 0,2±0,0 0,4±0,0 6,7±0,6 1,9±0,1 Vết 0,4±0,0 0,1±0,0 5,5±0,2 0,7±0,0 1,9±0,1 0,4±0,0 Vết 15,5±1,1 0,2±0,0 0,1±0,0 0,6±0,0 13,1±1,3 2,2±0,1 Vết 0,4±0,0 0,1±0,0 16,0±1,3 0,9±0,1 1,9±0,1 0,6±0,0 Vết 12,0±0,7 0,3±0,0 0,5±0,0 0,8±0,1 11,6±0,8 3,2±0,2 Vết 0,6±0,0 0,2±0,0 18,0±1,1 1,2±0,1 2,5±0,1 0,2±0,0 Vết 17,5±1,3 0,3±0,0 0,4±0,0 0,7±0,1 13,4±1,1 3,1±0,2 Vết 0,3±0,0 0,2±0,0 9,6±0,9 1,0±0,1 2,4±0,1 1,7±0,1 2,1±0,1 2,4±0,1 2,0±0,1 12,9±1,1 24,3±1,4 21,0±1,7 18,6±1,5 1,0±0,1 0,1±0,0 0,9±0,1 0,2±0,0 1,2±0,1 0,1±0,0 1,0±0,1 0,6±0,0 1,5±0,1 0,2±0,0 1,3±0,1 0,4±0,0 1,1±0,1 0,1±0,0 0,9±0,1 0,5±0,0 1,6±0,4 1,9±0,4 2,1±0,9 1,9±0,4 1,0±0,1 1,2±0,1 1,7±0,2 1,5±0,1 Vết 0,2±0,0 Vết 0,5±0,0 Vết 0,4±0,0 Vết 0,5±0,0 2,9±0,3 3,0±0,3 2,7±0,2 3,2±0,4 8,3±1,2 11,3±1,4 14,7±0,8 13,6±1,4 SFAs MUFAs 16,1 10,0 30,4 21,8 26,4 25,6 34,8 16,0 (PUFAs) SFA + MUFA (SFA+MUFA) 30,7 26,1 46,8 52,2 48,2 52,0 44,2 50,8 0,85 1,12 1,10 1,15 C18:3n-6 C18:3n-3 Axít myristic Axít palmitic Axít palmitoleic Axít stearic Axít oleic Axít γ-Linolenic (GLA) Axít -Linolenic (ALA) C20:0 C20:1n-9 C20:1n-7 C20:3n-6 C20:4n-6 C20:5n-3 AA (Axít Arachidonic ) Axít eicosapentaenoic (EPA) C22:0 C22:3n-3 C22:4n-6 C22:5n-3 C22:6n-3 Axít docosapentaeoic (DPA) Axít docosahexaenoic (DHA) 10 /PUFA n-3 PUFA n-6 PUFA n-3/n-6 25,1 5,6 4,5 39,8 7,0 5,69 40,1 7,8 5,14 36,9 7,3 5,06 Ghi chú: - Không phát Kết Bảng 3.1 cho thấy hàm lượng DHA axít béo chiếm ưu myristic (14:0), palmictic (16:0), oleic (18:1n-9) , α-Linolenic (ALA, 18:3n-3) docosapentaenoic (DPA, 22:5n-3) chủng HP1 tăng dần từ pha log đến pha cân sớm giảm dần pha cân muộn Hàm lượng PUFAs chiếm tỉ lệ cao từ 30,7 - 48,2% so với TFA Chủng HP1 có giá trị dinh dưỡng cao pha cân sớm Khi hàm lượng SFA (saturated fatty acid – axít béo bão hòa) MUFA (Mono unsaturated fatty acid – axít béo khơng bão hịa nối đơi) đạt 52,0% so với TFA, PUFAs đạt 48,2% so với TFA Ngoài ra, hàm lượng DHA, EPA DPA đạt giá trị cao 14,7 ± 0,8%; 1,7 ± 0,2% 2,7 ± 0,2% so với TFA, tương ứng Tỷ lệ axít béo n-3/n-6 đạt giá trị 5,14 - xem nguồn dinh dưỡng phù hợp cho loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ giai đoạn sinh trưởng khác Hàm lượng protein tổng số, lipit hydratcacbon chủng HP1 đạt 27,98 ± 0,89%, 9,78 ± 0,12%, 25,26 ± 0,79% sinh khối khô (SKK), tương ứng, giàu khoáng đa vi lượng Hàm lượng kim loại nặng As, Cd, Hg Pb có sinh khối chủng HP1 nằm ngưỡng cho phép mẫu thủy sản sản phẩm thủy sản theo quy chuẩn Việt Nam (2011) 3.1.4.2 Đặc điểm sinh học chủng N oculata HP2 Điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh trưởng chủng N oculata HP2 môi trường dinh dưỡng Erd, độ mặn 30‰, nhiệt độ 25 - 30C, CĐAS 100 μmol/m2/s, pH Thành phần axít béo sinh khối chủng HP2 xác định pha khác đường cong sinh Kết Bảng 3.2 cho thấy axít béo chủng HP2 gồm 14:0 (chiếm 0,54 - 2,42%), 16:0 (14,65–27,68%), 18:1n-9 (7,99 – 10,12%); 18:2n-6 (7,15 - 8,30%), 18:3n-3 (15,92 – 22,65%), 20:4n-6 (0,28 – 1,78%), 20:5n-3 (20,5 – 24,7%) Các PUFAs chiếm ưu ALA EPA Hàm lượng PUFAs chiếm tỉ lệ cao từ 44,10 -53,48% so với TFA Giá trị dinh dưỡng chủng HP2 đạt cao pha cân sớm Cụ thể hàm lượng EPA, SFA+MUFA PUFAs đạt 24,70±1,42%; 45,50% 52,8% so với TFA, tương ứng Tỷ lệ axít béo n-3/n-6 đạt giá trị 4,42 – coi nguồn dinh dưỡng phù hợp cho đối tượng NTTS có lồi động vật thân mềm hai mảnh vỏ Bảng 3.2 Thành phần hàm lƣợng axít béo chủng N oculata HP2 pha sinh trƣởng khác (% so với TFA) Pha sinh trƣởng Pha sinh Pha cân Tên khoa Pha cân Axít béo theo hàm trƣởng học sớm số mũ tuyến tính muộn (log) C10:0 0,45±0,05 0,48±0,05 0,50±0,07 0,46±0,05 11 C12:0 C14:0 Axít myristic C14:1n-5 C15:0 C 15:1n-5 C16:0 C16:1n-7 C17:0 C17:1n-7 C18:0 C18:1n-9 C18:1n-7 C18:2n-6 C18:3n-6 C18:3n-3 C20:0 C20:1n-7 C20:3n-6 C20:4n-6 C20:5n-3 C22:0 C22:6n-3 Khác SFAs MUFAs PUFAs SFA + MUFA (SFA + MUFA)/PUFA n-3/n-6 Axít palmitic Axít palmitoleic Vết 2,42±0,48 Vết 1,05±0,20 Vết 0,60±0,12 Vết 0,54±0,14 0,13±0,03 0,18±0,04 0,21±0,04 0,17±0,03 0,61±0,12 0,51±0,10 0,10±0,02 0,05±0,00 0,50±0,10 0,75±0,15 0,80±0,16 0,63±0,13 14,65±2,93 18,34±2,59 20,10±1,02 27,68±2,22 5,67±1,13 4,91±0,98 4,30±0,65 2,94±0,44 Axít stearic Vết 4,02±0,60 1,83±0,37 Vết 3,79±0,57 2,47±0,37 Vết 0,50±0,08 1,10±2,20 Vết 0,45±0,07 0,98±0,20 Axít oleic 10,12±2,02 9,75±1,95 0,86 0,85 0,86 1,08 4,5 4,53 4,42 4,74 GLA ALA AA EPA DHA 8,90±1,87 7,99±1,84 0,24±0,05 0,35±0,05 0,40±0,05 0,36±0,05 7,50±0,90 8,00±1,43 8,30±1,99 7,15±1,00 Vết Vết Vết Vết 22,65±0,13 21,27±1,32 17,70±1,66 15,92±1,18 1,96±0,39 2,09±0,44 6,90±1,73 4,56±0,78 0,53±0,09 0,82±0,19 1,20±0,24 0,74±0,19 0,53±0,13 0,65±0,16 0,70±0,18 0,25±0,03 1,78±0,45 1,02±0,23 0,60±0,13 0,28±0,06 21,48±5,16 22,54±3,83 24,70±1,42 20,5±1,10 Vết Vết Vết Vết Vết Vết Vết Vết 2,93 1,03 1,70 8,35 21,92 24,94 29,30 34,27 21,21 20,55 16,20 13,28 50,05 53,48 52,80 44,10 43,13 45,49 45,50 47,55 Ghi chú: - Không phát Hàm lượng protein, lipít hydratcacbon đạt 8,20 ± 1,64%; 18,72 ± 1,74% 34,77 ± 2,30% SKK, tương ứng giàu khoáng đa vi lượng Hàm lượng kim loại nặng có sinh khối chủng HP2 nằm ngưỡng cho phép mẫu sản phẩm thủy sản theo quy chuẩn Việt Nam (2011) 3.1.5 So sánh khả chống chịu với điều kiện mơi trƣờng ni bất lợi lồi VTB phân lập từ vùng biển Việt Nam Singapore 3.1.5.1 Khả chống chịu với điều kiện môi trường nuôi bất lợi chủng N oculata HP2 N oculata LB2164 12 Chủng N oculata HP2 có tính chống chịu với điều kiện nuôi trồng bất lợi cao chủng LB2164 (khi xử lý điều kiện cực đoan nhiệt độ 11 55C; CĐAS – 500 mol/m2.s; nồng độ muối 70‰; pH 11) Điều khẳng định ưu chủng N oculata HP2 địa khả thích nghi với biến động rộng mơi trường so với chủng có nguồn gốc ngoại nhập 3.1.5.2 Khả chống chịu với điều kiện môi trường nuôi bất lợi chủng VTB I galbana HP1 I galbana LB2307 Chủng I galbana HP1 chưa chứng tỏ khả chống chịu với điều kiện nuôi bất lợi so với chủng LB2307 (khi xử lý điều kiện cực đoan như: nhiệt độ 11 45C; CĐAS – 400 mol/m2/s; nồng độ muối 70‰; pH 11) Điều giải thích chất di truyền lồi I galbana - khơng phải lồi có khả thích nghi tốt với biến động rộng mơi trường nhiệt độ, ánh sáng, nồng độ muối… 3.2 Nghiên cứu công nghệ nuôi chủng I galbana HP1 N oculata HP2 quy mơ phịng thí nghiệm pilot 3.2.1 Công nghệ nuôi hai chủng I galbana HP1 N oculata HP2 quy mơ phịng thí nghiệm pilot Chúng tơi xây dựng quy trình nuôi chủng I galbana HP1 N oculata HP2 quy mơ phịng thí nghiệm pilốt với điều kiện ni cấy thích hợp: mơi trường (Erd, F/2, Walne), nồng độ muối 30‰, nhiệt độ 30C, CĐAS (100 – 300 µmol/m2.s) pH Ở cấp độ nuôi cấy khác nhau, chọn môi trường dinh dưỡng MĐTB ban đầu phù hợp để sinh trưởng tảo giống pha log, rút ngắn thời gian thích nghi tảo chuyển sang ni cấp độ thể tích lớn 3.2.2 Ni sinh khối chủng N.oculata HP2 hệ thống ni kín dạng ống 20 Lít tự thiết kế * Đặc điểm hệ thống ni kín dạng ống tự thiết kế Hệ thống ni kín (HTNK) dạng ống tự thiết kế có dung tích 20 L với số đặc điểm cấu tạo khác biệt so với HTNK biết trước Theo thiết kế, hệ thống bể chứa tảo nâng cao kết hợp với dịng khí đẩy sinh máy nén khí vừa có tác dụng tạo lực đẩy giúp dịch tảo luân chuyển tuần hoàn hệ thống theo dòng chảy rối với hệ số Renol > 4000, vừa có tác dụng phân tán oxy dịch nuôi mà không gây tổn thương đến tế bào tảo so với việc sử dụng bơm học hạn chế tối đa tế bào tảo lắng xuống đáy ống bám dính Đồng thời, khơng sử dụng bơm để đẩy khí nên khơng gây nên chênh lệch nhiệt độ hệ thống ni ngồi mơi trường, điều thuận lợi cho việc nâng cấp hệ thống nuôi lên quy mô lớn hơn, không cần hệ thống làm mát kèm, giúp làm giảm giá thành sản phẩm (Hình 3.7) Kết nghiên cứu đăng ký giải pháp hữu ích với tên gọi “Hệ thống bể phản ứng quang sinh để nuôi vi tảo biển” Cục Sở hữu trí tuệ, Bộ Khoa học Cơng nghệ chấp nhận đơn hợp lệ theo Quyết định số 609562/QĐ-SHTT ngày 29/10/2012 Nhờ sử dụng HTNK dạng ống tự thiết kế nêu trên, nuôi thành công chủng N oculata HP2 với MĐTB cao đạt 197,2 triệu tb/mL sau 23 ngày nuôi cấy, nhiệt độ dao động 25-30C Sinh khối tảo nuôi HTNK, không bị tạp 13 nhiễm, thời gian vận hành kéo dài làm giảm chi phí ni cấy, suất sinh khối ln ổn định, tiết kiệm diện tích cơng lao động Các kết ni trồng lồi VTB HTNK dạng ống khẳng định công nghệ nuôi trồng VTB Việt Nam bước đầu tiếp cận với công nghệ nuôi trồng HTNK giới để chủ động cung cấp nguồn giống ban đầu cho trại sản xuất giống nhằm nâng cao chất lượng giống góp phần làm giảm giá thành sản phẩm Hình 3.7 Sơ đồ khối hình ảnh hệ thống ni kín dạng ống tự thiết kế (20 L) 3.3 Nghiên cứu sử dụng sinh khối chủng I galbana HP1 N oculata HP2 để ni số lồi động vật thân mềm hai mảnh vỏ 3.3.1 Sử dụng sinh khối vi tảo biển làm thức ăn sống cho sinh sản nhân tạo ngao Bến tre (Meretrix lyrata Sowerby, 1851) 3.3.1.1 Sử dụng chủng VTB I galbana HP1 N oculata HP2 làm thức ăn sống cho nuôi vỗ ngao bố mẹ: Sử dụng sinh khối hỗn hợp chủng HP1 HP2 (với MĐTB đạt 200 x 104 tb/mL) làm thức ăn sống cho ngao bố mẹ góp phần tăng tỷ lệ sống chúng lên khoảng 20% so với công thức đối chứng cho ăn men bánh mỳ (2 g/kg) 3.3.1.2 Ảnh hưởng nguồn thức ăn lên hệ tiêu hóa ấu trùng ngao: ấu trùng ngao giai đoạn chữ D có hệ thống tiêu hóa chứa màu sắc đặc trưng loài VTB tương ứng dùng làm thức ăn Ngoài ra, ấu trùng ngao lô (ăn hỗn hợp I galbana HP1 N oculata HP2) - cung cấp đủ thành phần axít béo AA, EPA, DHA, DPA kích thước hệ thống tiêu hố lơ lớn so với lơ 1, ĐC (đối chứng) (Hình 3.8) Lơ ĐC Lơ Lơ Lơ Hình 3.8 Hình thái hệ thống tiêu hố ấu trùng ngao (ấu trùng chữ D) cho ăn chủng vi tảo khác Lô ĐC (chỉ cho ăn tảo bơm từ nước biển tự nhiên); Lô (chỉ ăn tảo N oculata HP2); Lô (chỉ ăn tảo I galbana HP1); Lô (cho ăn hỗn hợp chủng tảo I galbana HP1, N oculata HP2) 14 Tỉ lệ sống sót ấu trùng ngao sử dụng nguồn thức ăn bơm từ nước biển tự nhiên thấp (dưới 10%) Khi kết hợp sử dụng hỗn hợp sinh khối loài Chaetoceros gracilis, Chlorela vulgaris, I galbana, N oculata Tetraselmis convolutae làm thức ăn sống cho ấu trùng ngao Bến tre giai đoạn 0-40 ngày tuổi nâng tỷ lệ sống sót ấu trùng chân bò (giai đoạn 8-40 ngày tuổi) đạt 25% (Bảng 3.3) Kết cho thấy sử dụng cách chủ động loài VTB giàu dinh dưỡng làm thức ăn sống cho ấu trùng ngao từ ấp trứng đến giai đoạn chân bò nâng tỷ lệ sống sót ấu trùng từ 10% lên 25% Bảng 3.3 Mật độ tỉ lệ sống ấu trùng ngao Bến tre giai đoạn khác sử dụng loài VTB với mật độ khác làm thức ăn sống Thời gian (ngày) Giai đoạn sinh trƣởng Thành phần loài vi tảo biển Mật độ Ấu trùng Phân 15cắt 20ct/mL Ấu 102 - trùng 20ct/mL chữ D Ấu 105 - trùng 15ct/mL chữ D Ấu trùng 3- 8-10 đỉnh vỏ ct/cm2 (Umbo) Ấu 11trùng 1-2 40 chân bò ct/cm2 (Spat) Ghi chú: (+): có sử dụng Mật độ tảo tổng số T convolutae (x104tb /mL) Tỉ lệ sống (%) C gracilis C vulgaris I galbana N oculata 0 0 0 95 0 + + 15 - 20 65 + + + + 30 50 + + + + + 25 >30 + + + + + 30 >25 3.3.1.3 Sử dụng bón phân gây màu nước ao: Năm 2008, trại NTTS Cửu Dung thay nguồn thức ăn VTB ni trồng theo quy trình cơng nghệ chúng tơi chuyển giao cách bón phân để gây màu nước ao Bón phân gây nước màu xanh ao phương pháp bổ sung phân chuồng nước biển tự nhiên vào bể nuôi thời gian 5-10 ngày để quần thể tảo tự nhiên có sẵn nước biển phát triển Sau đó, sử dụng hỗn hợp cho ấu trùng ngao ăn trực tiếp Kết thu cho thấy tỷ lệ sống sót ấu trùng ngao đạt 25%, thấp so với sử dụng hỗn hợp sinh khối loài VTB nói 3.3.1.4 Sử dụng hỗn hợp sinh khối VTB I galbana HP1, N oculata HP2 C gracilis làm thức ăn sống cho ấu trùng ngao Bến tre thực năm 2009 2010 Quy trình phối trộn loài VTB phù hợp với giai đoạn phát triển ấu trùng; cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng cho ấu trùng nuôi nâng tỷ lệ sống 15 sót ấu trùng ngao từ 25% năm 2008 (tương ứng với cá thể/cm2) lên 70% (2-8 cá thể/cm2) năm 2009, lên 75% (9-20 cá thể/cm2) đặc biệt lên tới 90% (57-86 cá thể/cm2) năm 2010 (Bảng 3.4) Bảng 3.4 Mật độ cá thể tỉ lệ sống sót ấu trùng ngao Bến tre thu đƣợc năm 2008-2010 Đợt thí Mật độ cá thể Tỷ lệ sống Loại thức ăn nghiệm /cm2 (ct/cm2) sót (%) 2008 Bón phân gây màu nước ao 70 galbana HP1, N oculata HP2 C gracilis 2010 Kết hợp hỗn hợp sinh khối chủng I -20 >75 galbana HP1, N oculata HP2 C gracilis 3.3.2 Sử dụng sinh khối VTB làm thức ăn sống nuôi vỗ hầu Thái bình dương (Crassostrea gigas Thunberg, 1793) 3.3.2.1 Ảnh hưởng loại thức ăn khác đến tăng trưởng chiều dài hầu TBD: Trong suốt thời gian thí nghiệm, chiều dài vỏ hầu khơng tăng lên khơng có sai khác có ý nghĩa thống kê sinh học (P>0,05) lơ thí nghiệm (từ 8,5-8,8 cm) Điều giai đoạn kích thước hầu tăng chậm chúng tích lũy chất dinh dưỡng để chuẩn bị cho trình thành thục sinh dục 3.3.2.2 Ảnh hưởng loại thức ăn khác đến tăng trưởng khối lượng hầu: Các loại thức ăn khác có ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng khối lượng; Cụ thể khối lượng lô (cho ăn I galbana HP1, N oculata HP2 S mangrovei PQ6) đạt 94,82 ± 7,12 gram Tiếp đến lô (ăn I galbana HP1, N oculata HP2) đạt 90,5 ± 9,2 gram thấp lô (ăn tảo bơm từ nước biển tự nhiên) đạt 88,81 ± 9,67 gram 3.3.2.3 Ảnh hưởng loại thức ăn khác đến độ béo hầu: Độ béo hầu tăng theo thời gian nuôi cao lô > lô > lô sai khác có ý nghĩa mặt thống kê sinh học (P0,05) Ngồi ra, chúng giàu khống đa vi lượng Hàm lượng kim loại nặng As, Cd, Hg Pb lô mức cho phép sản phẩm động vật thân mềm hai mảnh vỏ theo QCVN8-1:2011/BYT Kết phân tích thành phần axít béo hầu TBD: hàm lượng lipit tổng số lô lô đạt 0,50; 0,51% SKT, tăng 4% tương ứng so với lô Hàm lượng SFA lô 2, lô đạt 26,19% 26,34% so với TFA, tăng 6,48 7,1% tương ứng so với lô Hàm lượng PUFAs lô 2, lô đạt 73,81% 73,66% so với TFA, giảm 2,12 2,32%, tương ứng so với lô Hàm lượng DHA lô lô đạt 13,01±0,39 12,08±0,36% so với TFA, tăng 17,5 9,06%, tương ứng so với lô Hàm lượng EPA lô 2, lô đạt 11,52±0,34% 11,50±0,32% so với TFA, tăng 0,46 0,26%, tương ứng so với lô (Bảng 3.5) Bảng 3.5 Hàm lƣợng lipit tổng số thành phần axít béo hầu Thái bình dƣơng lơ thí nghiệm sau tháng ni STT Axít béo Tên khoa học Hàm lƣợng axít béo (% so với axít béo tổng số) Lô Lô Lô C4: 4,15 ±0,12 1,72±0,05 1,63±0,04 C10: 0,52±0,01 - - C12: 0,66±0,01 - - C14: 1,48±0,04 1,84±0,05 1,70±0,05 C15: 1n – 0,89±0,02 1,13±0,03 - C16: 11,50±0,34 15,00±0,45 16,26±0,48 C16: 1n – 0,84±0,02 0,71±0,02 - C16: 1n – 0,83±0,02 - - C18 : 6,29±0,18 7,63±0,22 6,76±0,20 10 C18: 1n – 5,98±0,17 6,66±0,19 8,02±0,24 11 C18: 2n – –c 0,58±0,01 - - 12 C20: 1n – 4,62±0,13 5,13±0,15 4,54±0,13 13 C20: 1n – 2,84±0,08 3,43±0,10 3,40±0,10 14 C20: 4n – AA 9,46±0,28 10,69±0,32 12,46±0,37 15 C20: 5n – EPA 11,47±0,34 11,52±0,34 11,50±0,32 16 C22: 1n- 10,76±0,32 9,74±0,29 9,78±0,29 17 C22: 4n – 9,41±0,28 3,88±0,11 2,78±0,08 18 C22: 3n – 1,99±0,05 2,06±0,06 2,46±0,07 19 C22: 5n – 2,06±0,06 3,09±0,09 4,54±0,13 Axít myristic Axít palmitic Axít palmitoleic DPA 17 20 C22: 5n – DPA 2,60±0,07 2,750±0,08 2,11±0,06 21 C22: 6n - DHA 11,07±0,33 13,01±0,39 12,08±0,36 (SFAs) 24,60 26,19 26,34 (PUFAs) 75,40 73,81 73,66 % Lipit tổng số (sinh khối tươi) 0,49 0,50 0,51 Ghi chú: - không phát hiện, lơ thí nghiệm lặp lại lần (n=3) Như vậy, hầu TBD nuôi vỗ hỗn hợp tảo quang tự duỡng (I galbana HP1và N oculata HP2) kết hợp với tảo dị dưỡng S mangrovei PQ6 (lô 2) hỗn hợp tảo quang tự dưỡng (lô 3) có hàm lượng lipit, EPA, DHA đạt 0,50% SKT; 11,52±0,34 13,01±0,39% so với TFA; 0,50% SKT; 11,50±0,32% 12,08±0,36% so với TFA, tương ứng, cao so với lơ đối chứng (lơ 1) ăn lồi vi tảo bơm từ nước biển tự nhiên (là 0,49% SKT; 11,47±0,34; 11,07±0,33% so với TFA, tương ứng) 3.3.3 Sử dụng sinh khối vi tảo biển làm thức ăn sống cho tu hài bố mẹ (Lutraria rhyncheana Jonas, 1844) 3.3.3.1 Ảnh hưởng chất lượng thức ăn lên tăng trưởng tu hài bố mẹ: Sau 15 ngày nuôi vỗ tu hài bố mẹ ăn với chế độ ăn khác cho thấy có khác biệt kích thước trọng lượng tu hài bố mẹ lô ĐC (ăn tảo bơm từ nước biển tự nhiên), lô TN1 (ăn I galbana HP1 N oculata HP2) TN2 (ăn hỗn hợp I galbana HP1, N oculata HP2 S mangrovei PQ6) Kết cho thấy trọng lượng, chiều dài, chiều rộng chiều dầy tu hài bố mẹ lô TN2 tăng 63,79; 10,37; 11,41 11,94%, tương ứng, so với lô TN1 sai khác có ý nghĩa thống kê (P0,05) Kết cho thấy việc sử dụng thức ăn kết hợp sinh khối VTB dị dưỡng S mangrovei PQ6 với chủng I galbana HP1 N oculata HP2 có hiệu cao so với tu hài bố mẹ sử dụng nguồn thức ăn loài VTB quang tự dưỡng truyền thống 3.3.3.2 Phân tích thành phần dinh dưỡng kim loại nặng tu hài bố mẹ: Hàm lượng protein tu hài bố mẹ lô TN2 (đạt 43,98% sinh khối tươi) cao lô TN1 (đạt 41,93% sinh khối tươi) 5% ĐC (đạt 40,12% sinh khối tươi) 9,6% Thành phần khoáng đa lượng vi lượng lô TN2 cao so với lô TN1 ĐC khoảng 10% 5-40%, tương ứng Hàm lượng kim loại nặng lô mức cho phép sản phẩm động vật thân mềm hai mảnh vỏ theo QCVN8-1:2011/BYT Hàm lượng lipit tổng số thành phần axít béo: Hàm lượng lipít tổng số lơ TN2, TN1 0,55% 0,5% sinh khối tươi tăng 11,46 10% so với lô ĐC (đạt 0,48% sinh khối tươi) Hàm lượng SFAs lô TN2 TN1 đạt 48,95%; 64,15% so với TFA, giảm 26,44 3,60% tương ứng so với lô ĐC (64,55% so với TFA) Trong đó, hàm lượng MUFA + PUFAs lơ TN2 tăng so với lô TN1 ĐC 43,43% 44,00%, tương ứng; tỷ lệ MUFA + PUFAs/ SFA lô ĐC, TN1, TN2 0,53; 0,55 1,04, tương ứng Đồng thời, nhận thấy rõ lơ TN2 có hàm lượng PUFAs ALA, GLA, AA, DPA cao so với lô TN1 lô ĐC sai khác 18 có ý nghĩa thống kê sinh học (P