Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 163 PHÂN LẬP CÁC THÀNH PHẦN CÓ TÁC DỤNG CHỐNG OXI HÓA TRONG LÁ CHÙM NGÂY (MORINGA OLEIFERA LAM.) Salihah*, Bùi Thế Vinh*, Trần Công Luận* TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Xác định và phân lập các thành phần hóa học có tác dụng chống oxi hóa trong lá Chùm ngây Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Lá Chùm ngây tươi thu hái tại Tri tôn, An Giang được chiết bằng phương pháp ngâm với cồn 96% thu được cao cồn toàn phần. Chiết phân đoạn với dung môi có độ phân cực tăng dần: Dietyl eter, cloroform, etyl acetat, thu được các cao phân đoạn. Định lượng phenolic toàn phần trong cao cồn toàn phần và các cao phân đoạn bằng phương pháp Folin – Ciocalteu với chất chuẩn là acid gallic. Xác định các thành phần có hoạt tính oxi hóa trong cao etyl acetat bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng và phát hiện bằng cách phun thuốc thử DPPH. Sau đó phân lập các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp sắc ký nhanh – cột khô và sắc ký cột cổ điển. Xác định cấu trúc của các chất phân lập được bằng các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, phổ MS và so sánh với các thông số phổ NMR của các hợp chất đã công bố. Kết quả: Từ 10 kg lá tươi, thu được 600g cao cồn toàn phần. Chiết phân đoạn thu được 168 g cao eter, 2,63 g cao cloroform, 28,4 g cao etyl acetat và 120g cao nước. Hàm lượng phenolic toàn phần trong cao cồn toàn phần là 108,011  g/mg. Hàm lượng phenolic toàn phần trong cao eter, cao cloroform, cao etyl acetat và cao nước lần lượt là 44,528  g/mg, 110,914  g/mg, 271,822  g/mg và 90,881  g/mg tính theo acid gallic chuẩn. Trong phân đoạn etyl acetat, xác định được 6 vết chất có hoạt tính chống oxi hóa với giá trị Rf lần lượt là 0,45; 0,29; 0,27; 0,16; 0,12; 0,1 với hệ dung môi: Etyl acetat – metanol – nước (100: 17: 13). Từ phân đoạn etyl acetat phân lập được 2 hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa là chủ yếu là isoquercitrin (200 mg) và vitexin (25 mg). Kết luận: Lá Chùm ngây chứa nhiều hợp chất phenolic có hoạt tính chống oxi hóa. Trong đó đã phân lập được 2 hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa chủ yếu là vitexin và isoquercitrin. Vitexin là một flavon C- glycosid được tìm thấy lần đầu tiên từ lá cây này. Từ khoá: chùm ngây, chống oxy hoá. ABSTRACT ISOLATING THE ANTIOXIDANT COMPOUNDS FROM LEAVES OF MORINGA OLEIFERA LAM. Salihah, Bui The Vinh, Tran Cong Luan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 - Supplement of No 1 – 2012: 163 - 168 Objects: To define and isolate the antioxidants from leaves of Moringa oleifera Lam. Materials and Methods: Moringa oleifera fresh leaves collected from Tri ton - An Giang province were extracted with 96% alcohol. The crude alcohol extract was separated using three solvents: Diethyl ether, chloroform, and ethyl acetate. Total phenolic contents of extracts were measured with Folin-Ciocalteu reagent using gallic acid as a standard. Defining the antioxidants from ethyl acetate extract using thin layer chromatography with DPPH reagent.  Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. HCM – Viện Dược Liệu Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trần Công Luận, ĐT: 0903671323, Email: congluan53@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 164 Then, those antioxidants were isolated by dry-column flash chromatography method and open- column chromatography method. The structure elucidations were based on analyses of spectroscopic data including 1D- and 2D-NMR, and MS. Results: 600 g crude alcohol extract macerated from 10 kg fresh leaves of M. oleifera was fractionated to 168 g diethyl ether, 2.63 g chloroform, 28.4 g ethyl acetate and 120 g water fraction, respectively. Total phenolic contents of extracts were (1)- alcohol crude extract: 108.011  g GAE/mg, (2)- diethyl ether extract: 44.528  g GAE/mg, (3)- chloroform extract: 110.914  g GAE/mg, (4)- ethyl acetate extract: 271.822  g GAE/mg, (5)- water extract: 90.881  g GAE/mg. Six spots on chromatogram having antioxidant activity were defined in ethyl acetate fraction with Rf values of 0.45, 0.29, 0.27, 0.16, 0.12 and 0.1 with solvent system as etyl acetat – metanol – water (100: 17: 13). Two antioxidants isolated from ethyl acetate fraction were isoquercitrin (200 mg) and vitexin (25 mg). Conclusion: Two antioxidants of phenolic compounds islolated from M. oleifera leaves are vitexin and isoquercitrin, in which vitexin is found from those leaves at the first time. Keywords: Moringa oleifera, antioxidant. ĐẶT VẤN ĐỀ Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) được gọi là cây “Thần Diệu” vì nó chứa rất nhiều chất dinh dưỡng quan trọng như: Vitamin C, β- caroten, protein, các acid amin, và nhiều hợp chất có tác dụng sinh học như: Zeatin, flavonoid (quercetin, kaempferol ), α-sitosterol, axit caffeoylquinic, niazirinin, niaziminin A và B, benzyl isothiocyanat (7,8) . Chính vì thế, nó đã được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong thực phẩm, y dược học tại nhiều quốc gia trên thế giới như: Ấn Độ, Pakistan, Ghana, Malaysia, Thái Lan (4,6) . Nhưng tại Việt Nam, Chùm ngây chưa được quan tâm và nghiên cứu nhiều, chúng chỉ mọc hoang ngoài tự nhiên, sống rải rác ở một số vùng từ Quảng Nam đến Phú Quốc, các bộ phận của cây như quả, lá non, hoa các nhánh non chỉ dùng làm rau ăn trong dân gian (8) . Gần đây người ta cũng đã quan tâm và tổ chức trồng ở một số nơi như Tri tôn - An Giang, Long Khánh - Đồng Nai và đã có một số chế phẩm ở dạng thực phẩm chức năng được lưu hành trên trị trường. Nhằm góp phần phát triển cây Chùm ngây như là một nguồn nguyên liệu tiềm năng cho các dạng thuốc hay thực phẩm chức năng trong chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng, chúng tôi tiến hành phân lập các hợp chính có tác dụng chống oxy hóa trong lá Chùm ngây. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Lá Chùm ngây được thu hái tại Tri Tôn, An Giang vào đầu tháng 8/2010. Mẫu sử dụng bao gồm cả cuống lá và lá chét còn tươi. Chiết xuất dược liệu 10 kg lá tươi được chiết bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng, với dung môi chiết là cồn 96%, theo tỉ lệ 6: 1 và chiết 6 lần. Cô dưới áp suất giảm thu được cao cồn toàn phần, chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: Dietyl eter, cloroform, etyl acetat, nước thu được các cao phân đoạn: Cao eter, cao cloroform, cao etyl acetat và cao nước. Định lượng phenolic toàn phần Bằng phương pháp Folin – Ciocalteu theo Waterman và Mole (1994) (2) . Dựng đường chuẩn acid gallic với giai mẫu 10 g, 20 g, 30 g, 40 g, 50g, dựa và phương trình đường chuẩn để xác định hàm lượng phenolic toàn phần trong mẫu thử. Hàm lượng phenolic toàn phần được tính bằng g đương lượng acid gallic có trong 1 mg mẫu thử (g GAE/ mg). Tiến hành thí nghiệm như sau: Hút một thể tích xác định mẫu (Chất chuẩn acid gallic hoặc mẫu cần định lượng được pha loãng ở nồng độ thích hợp) cho vào bình định mức 10 ml.Thêm 6 ml nước cất, lắc đều. Cho vào bình 0,5 ml thuốc thử Folin- Ciocalteu, lắc đều. Để yên trong 5 phút.Thêm 1,5 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 165 ml Na 2 CO 3 , lắc đều. Thêm nước cho vừa đủ 10ml. Để yên trong tối 2h. Sau đó tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 758 nm. Xác định các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa trong phân đoạn etyl acetat Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển: etyl acetat – metanol – nước (100: 17: 13) (1) . Sau khi khai triển, bản mỏng được quan sát dưới đèn UV 254 nm và UV 365 nm. Sau đó phun thuốc thử DPPH 0,05% lên bề mặt của bản mỏng và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Những thành phần có hoạt tính chống oxi hóa sẽ tạo những vạch màu vàng trên nền tím của bản mỏng, do chất chống oxi hóa làm mất màu tím của thuốc thử DPPH. Chứng dương là vitamin C. So sánh bằng mắt thường độ mất màu của vạch chứng dương và các vạch có hoạt tính khác để xác định mức độ mạnh yếu của hoạt tính. Những vạch có hoạt tính chống oxi hóa được ghi nhận lại bằng giá trị Rf của chúng. Sắc ký nhanh – cột khô (7) Sử dụng phễu Buchner thành cao đường kính trong 10 cm, bình tam giác, máy hút chân không áp suất 70 mmHg. Chất hấp phụ là silicagel hạt vừa 40 – 60 m. Chiều cao cột chất hấp phụ 5 cm. Nạp mẫu ở dạng bột khô, khối lượng mẫu 20 g. Hệ dung môi rửa giải: Cloroform 100%, etyl acetat 100%, etyl acetat – metanol (50: 50). Thể tích phân đoạn rửa giải: 500 ml. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi etyl acetat – metanol – nước (100: 17: 13). Các phân đoạn giống nhau được gộp chung. Cô đến cắn và cân khối lượng. Sắc ký cột cổ điển Chất hấp phụ là silicagel hạt vừa (40 – 60 m). Khối lượng chất hấp phụ 350g. Quy cách cột 4 x 50 cm. Khối lượng mẫu 6 g. Nạp mẫu bằng phương pháp nhồi bột khô. Dung môi rửa giải là etyl acetat: metanol. Tốc độ dòng 20 giọt/ phút. Thể tích mỗi phân đoạn 20 ml. Xác định cấu trúc của các chất phân lập được bằng phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, và phổ MS. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chiết xuất dược liệu Từ 10 kg lá Chùm ngây tươi, chiết bằng cồn 96% thu được 600 g cao cồn toàn phần, độ ẩm cao là 19,8 %. Hiệu suất chiết là 5,88 %. Kết quả lắc phân đoạn thu được khối lượng cao theo bảng 1 Bảng 1: Kết quả thu cao phân đoạn Phân đoạn Khối lượng cao (g) Độ ẩm cao (%) Hiệu suất chiết Cao eter 168 10,53 28% Cao cloroform 2,63 15,62 0,44 % Cao etyl acetat 28,40 18,25 4,7 % Cao nước 120 19,42 20 % Định lượng phenolic toàn phần Hình 1: Phương trình đường chuẩn acid gallic Dựa vào đường chuẩn acid gallic để xác định hàm lượng phenolic toàn phần với phương trình hồi quy: y = 0,014x – 0,0021 và R2 = 0,9955 Bảng 2: Hàm lượng phenolic toàn phần trong cao cồn toàn phần và cao phân đoạn Mẫu Khối lượng cao (mg) OD 758 nm Hàm lượng phenolic toàn phần (g GAE/mg) Cao toàn phần 0,4 0,483 108,011 Cao eter 0,4 0,221 44,528 Cao cloroform 0,4 0,522 110,914 Cao etyl acetat 0,1 0,309 271,822 Cao nước 0,4 0,408 90,881 Ghi chú: GAE: Gallic acid equivalent (tương đương với acid gallic) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 166 Hàm lượng phenolic toàn phần trong cao cồn toàn phần là 108,011 g GAE/ mg. và trong các cao phân đoạn: Cao eter, cao cloroform, cao etyl acetat và cao nước lần lượt là 44,528 g GAE/mg, 110,914 g GAE/mg, 271,822 g GAE/mg và 90,881 g GAE/mg. Trong đó cao etyl acetat là phân đoạn có hoạt tính chống oxi hóa nhất và được lựa chọn để tiếp tục phân lập các chất có hoạt tính chống oxi hóa trong lá Chùm ngây. Xác định các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa trong phân đoạn etyl acetat UV 254 nm UV 365 nm Thuốc thử FeCl 3 Thuốc thử DPPH 0,05% Hình 2: Kết quả sắc ký lớp mỏng phân đoạn etyl acetat, hệ EtOAc – MeOH – H 2 O (100:17:13) Khi bắt đầu phun thuốc thử DPPH lên bản mỏng, vitamin C ngay lập tức làm mất màu của DPPH và tạo vết vàng trên sắc đồ. Đối với các vết chất trong phân đoạn etyl acetat cũng có tình trạng tương tự, không cần ủ 10 phút mà các vết ngay lập tức làm mất màu DPPH. Điều này cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của các thành phần trong phân đoạn này là rất cao. Trong phân đoạn etyl acetat có 6 vết chất có màu vàng, thể hiện hoạt tính chống oxy hóa. Chúng có giá trị Rf lần lượt là 0,45 ; 0,29 ; 0,27 ; 0,16 ; 0,12; 0,1 ở hệ EtOAc – MeOH – H 2 O (100:17:13) và đều hiện màu với thuốc thử FeCl 3. Sắc ký nhanh – cột khô Bảng 3: Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký nhanh – cột khô Hệ dung môi Phân đoạn tập hợp Phân đoạn Khối lượng cao (g) Thành phần Ghi chú CHCl 3 C1 1 – 6 0,2 Tạp C2 7 – 10 0,3044 Tạp Có các hợp chất phenolic kém phân cực EtOAc E1 11 1,0 Vết X1 + tạp E2 12 1,2552 X2 E3 13 0,5537 X2 + tạp E4 14 – 30 8,5278 X3 + X4 Thành phần có hoạt tính chống oxy hóa EtOAc – MeOH (5: 5) EM 31 – 36 8,3309 Thành phần có hoạt tính chống oxy hóa Cao EtOAc Cao EtOAc Cao EtOAc Cao EtOAc Vitamin C Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 167 Phân đoạn E4 được chọn để tiến hành sắc ký cột cổ điển, phân tách các hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa trong lá Chùm Ngây. Sắc ký cột cổ điển Bảng 4: Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển Hệ dung môi Phân đoạn tập hợp Phân đoạn Khối lượng cao (g) Thành phần EtOAc 100% MO1 1 – 40 0,56 Tạp MO2 41 – 49 0,35 Tạp + chất 1 MO3 50 – 54 0,11 chất I + ít tạp MO4 55 – 80 0,65 chất I + chất II MO5 81 – 160 2,19 chất II + tạp phía dưới EtOAc – MeOH (95:5) MO6 136 – 208 1,55 chất II MO7 209 – 258 1,92 chất II + chất III Từ phân đoạn MO3, để qua đêm, xuất hiện tủa màu vàng lắng dưới đáy. Tách riêng tủa và rửa tủa bằng metanol, thu được chất I. Từ phân đoạn MO5 và MO6 để qua đêm, xuất hiện kết tinh hình kim màu vàng. Tách riêng kết tinh, làm sạch bằng cách cho tái kết tinh trong dung môi etyl acetat, thu được chất II Xác định cấu trúc của hợp chất phân lập được Chất I và chất II được đo và giải phổ NMR (phổ H, phổ C, DEPT, HSQC, COSY, HMBC) và khối phổ MS. Dựa vào kết quả phổ NMR một chiều và 2 chiều, dự đoán cấu trúc của chất I là vitexin và chất II là isoquercitrin. Phổ H và phổ C của chất I và chất II được đối chiếu với phổ của chất chuẩn đã được công bố. Bảng 5: Thông số phổ 1 H (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) của chất I đối chiếu với vitexin (9) Chất I Vitexin C 13C 1H 13C 1H δ (ppm) δ (ppm) δ (ppm) δ (ppm) 2 163,85 102,37 181,97 155,90 98,08 164,98 Chất I Vitexin 162,49 104,55 160,32 103,96 121,54 128,81 115,73 161,03 115,73 128,81 73,31 70,82 78,62 70,54 81,72 61,26 3 102,37 6,77 102,51 6,94 (1H, s, H-3) 4 181,97 182,73 5 155,90 13,16 155,64 13,17 (1H, s, 5-OH) 6 98,08 98,45 6,44 (1H, s, H-6) 7 162,49 162,31 10,83(1H, s, 7-OH) 8 104,55 104,56 9 160,32 160,28 10 103,96 104,07 1’ 1 121,54 122,07 2’ 128,81 8,03 128,99 8,26 (1H, d, J = 8,7 Hz, H-2’) 3’ 115,73 6,90 115,01 7,05 (1H, d, J= 8,7 Hz, H-3’) 4’ 161,03 161,32 10,35 (1H, s, 4’-OH) 5’ 115,73 6,88 115,01 7,05 (1H, d, J= 8,7 Hz, H-5’) 6’ 128.81 8,01 128,99 8,26 (1H, d, J = 8,7 Hz, H-6’) 1” 73,31 4,93 73,93 4,94 (1H,d, J = 9,8 Hz, H-1’’) 2” 70,82 71,03 3” 78,62 79,01 4” 70,54 70,20 5” 81,71 81,29 6” 61,26 61,36 Bảng 6: Kết quả phổ 1 H (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13 C- NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) của chất II đối chiếu với isoquercitrin (3) Chất II isoquercitrin C 13C 1H 13C 1H δ (ppm) δ (ppm) δ (ppm) δ (ppm) 2 156,16 156,0 3 133,35 133,2 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 168 Chất II isoquercitrin 4 177,39 177,2 5 161,18 161,0 6 98,58 6,20 98,6 6,18 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-6) 7 164,03 164,0 8 93,42 6,40 93,5 6,39 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-8) 9 156,27 156,1 10 103,95 103,9 1’ 1 121,15 121,0 2’ 115,15 7,56 115,1 7,56 (1H, br s, H-2′) 3’ 144,72 144,6 4’ 148,37 148,3 5’ 116,19 6,83 116,1 6,83 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5′) Chất II isoquercitrin 6’ 121,51 7,58 121,5 7,58 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-6′) 1” 100,96 5,45 100,8 5,45 (1H, d, J = 6,9 Hz, H-1″) 2” 74,06 74,1 3” 76,49 76,5 4” 69,94 70,0 5” 77,42 77,5 6” 60,97 61,0 Cấu trúc chất I là vitexin (C 21 H 20 O 10 : (1S)-1,5-anhydro- 1-[5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-4H- chromen-8-yl]-D-glucitol) và chất II là isoquercitrin (C 21 H 20 O 12 : 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4- oxo-4H-chromen-3-yl β-D-glucopyranosid). Cấu trúc của chất I - vitexin Cấu trúc của chất II - isoquercitrin Hình 3: Cấu trúc của vitexin và isoquercitrin KẾT LUẬN Lá Chùm ngây chứa nhiều hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa, các hợp chất này liên quan đến nhóm hợp chất phenolic. Trong đó hai hợp chất flavonoid có hoạt tính chống oxi hóa chủ yếu của lá đã được xác định là vitexin và isoquercitrin. Vitexin là một flavon C- glycosid được phân lập từ lá cây này lần đầu tiên. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bhattarai H. D., Babita P., Hong S.G., Lee H.K., Yim J.H. (2008), Thin layer chromatography analysis of antioxidant constituents of lichens from Antarctica, Journal of Natural Medicine, 62, pp. 481 – 484. 2. Chumark P., Panya K., Yupin S., Srichan P., Noppawan M. (2008), The in vitro and ex vitro antioxidant properties, hypolipidaemic and antitherosclerotic activities of water extract of Moringa oleifera Lam. leave, Journal of Ethnopharmacology, 119, pp. 439 – 436. 3. Deepralard K., Kawanishi K., Moriyasu M., Thitima P., Suttisri R. (2009), Flavonoid glycosides from the leave of Uvaria rufa with advanced glycation end – products inhibitory activity, Thai J. Pharm. Sci., 33, pp. 84 – 90. 4. Fahey J.W. (2005), Moringa oleifera: A Review of the Medical Evidence for Its Nutritional, Therapeutic, and Prophylactic Properties. Trees for Life Journal,1: pp. 5. 5. Monzon R.B. (1995), Traditional medicine in the treatment of parasitic diseases in the Philippines, Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health, 26(3): pp. 421-428. 6. Sabale V., Patel V., Paranjape A., Arya C., Sakarkar S. N. and Sabale P.M. (2008), Moringa Oleifera (Drumstick): An Overview, Pharmacognosy Reviews, 2(4), pp. 7-13. 7. Trần Hùng (2006), Phương pháp chiết xuất dược liệu, Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược- Đại học Y Dược, Tp. HCM, tr. 119 - 127. 8. Võ Văn Chi, (1999), Tự điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y Học, tr. 248. 9. Zhou X., Peng J., Fan G.(2005), Isolation and purification of flavonoid glycosides from Trollius ledebouri using high-speed counter-current chromatography by stepwise increasing the flow-rate of the mobile phase, J Chromatoqr A., 1092 (2), pp. 216 – 221.