ỦY BAN NHÂN DÂN TP HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU Đề tài : TẠO KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA HBV (HEPATITIS B VIRUS) BẰNG KỸ THUẬT GEN VÀ TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG Cơ quan chủ trì: HỘI SINH HỌC TP.HCM Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS TRẦN LINH THƯỚC TP HCM 6/2008 PHẦN I TÓM TẮT THÔNG TIN- MỤC TIÊU - NỘI DUNG ĐĂNG KÝ Tên đề tài: Tạo kháng nguyên bề mặt HBV (Hepatitis B virus) kỹ thuật gen tạo kháng thể đa dòng Tên chủ nhiệm đề tài: TRẦN LINH THƯỚC, PGS.TS Địa liên lạc: 227 Nguyễn Văn Cừ, Q 5, TP Hồ Chí Minh ÑT: 8308557 (CQ) / 9316262 (NR) / Fax: 8308557 / Mobile: 0913-901644 E-mail: tlthuoc@hcmuns.edu.vn; Đơn vị chủ trì đề tài: HỘI SINH HỌC TP.HCM (LIÊN HIỆP CÁC HỘI KH&KT TP.HCM) Danh sách cán trực tiếp tham gia đề tài: TT Họ Tên Học vị 3 Nguyễn Lê Trang Đặng T Phương Thảo Huỳnh Ngọc Vi Ca Đặng Trần Hiền Thảo Lê Thái Hoàng Nguyễn Thị Huỳnh Nga TSKH/PGS ThS Học viên cao học SV SV SV Cơ quan công tác Viện Pasteur TP.HCM Trường ĐH KHTN Trường ĐH KHTN Trường ĐH KHTN Trường ĐH KHTN Mục tiêu đề tài Mục tiêu đề tài ứng dụng kỹ thuật gen để tạo kháng nguyên bề mặt vi rút HBV gây bệnh viêm gan siêu vi B, sản xuất kháng thể đa dòng đặc hiệu quy mô phòng thí nghiệm Nội dung đăng ký 6.1 Tạo dòng E coli biểu kháng nguyên bề mặt PreS1 PreS2 HBV - Thu nhận đoạn gen mã hóa kháng nguyên từ máu bệnh nhân viêm gan siêu vi B phản ứng PCR - Tạo dòng gen mã hóa kháng nguyên E coli (dòng hóa gen vào vectơ tạo dòng, biến nạp vào E coli, chọn lọc kiểm tra dòng E coli mang gen mục tiêu); - Tái tạo dòng E coli (tái tạo dòng gen thu nhận vào vectơ biểu hiện, biến nạp vào E coli, chọn lọc kiểm tra dòng E coli mang gen mục tiêu) 6.2 Biểu tinh chế kháng nguyên tái tổ hợp - Biểu kháng nguyên kiểm chứng (điện di SDS-PAGE, lai miễn dịch) - Tinh chế kháng nguyên sắc ký lực chuyên biệt 6.3 Tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên - Gây miễn dịch chuột kháng nguyên tái tổ hợp - Thu nhận kháng thể đa dòng IgG - Tinh chế IgG sắc ký lực chuyên biệt 6.4 Đánh giá kháng thể: hiệu giá, độ đặc hiệu Thời gian, kinh phí tiến độ thực 7.1 Thời gian kinh phí - Thời gian: 24 tháng, từ 11/2004 – 10/2006 - Kinh phí: 180 triệu đồng 7.2 Tiến độ thực thiện nội dung sản phẩm - Giai đoạn I Từ tháng 11/2004 đến tháng 10/2005 - Kinh phí 120.000.000đ TT Tóm tắt nội dung Thu nhận gen mã hóa Pre-S1 (hoặc PreS2) từ máu bệnh nhân viêm gan siêu vi B PCR Tạo dòng gen mã hóa kháng nguyên E coli Tái tạo dòng E coli Biều kháng nguyên mục tiêu kiểm chứng Tinh chế kháng nguyên sắc ký lực Báo cáo sơ kết giai đoạn I Sản phẩm cần đạt Gen mã hóa Pre-S1 (hoặc PreS2) Các vector mang gen mã hóa kháng nguyên Dòng E coli mang gen mục tiêu Kết điện di SDSPAGE, lai miễn dịch Kháng nguyên tinh chế Báo cáo kết - Giai đoạn II Từ tháng 11/2005 đến tháng 10/2006 - Kinh phí 60.000.000đ TT Tóm tắt nội dung Gây miễn dịch chuột/thỏ kháng nguyên Sản phẩm cần đạt Chuột/thỏ đáp ứng miễn tái tổ hợp Xác nhận hiệu giá kháng thể phản ứng tủa ELISA Thu nhận IgG, tinh chế Báo cáo nghiệm thu dịch Kết đánh giá Kháng thể đa dòng tinh chế Báo cáo kết PHẦN II TÓM TẮT KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯC CỦA ĐỀ TÀI CÁC NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN 1.1 Tạo dòng E coli biểu kháng nguyên bề mặt PreS1 PreS2 HBV Đã tiến hành tạo dòng phương án khác thu dòng E coli mang vector biểu kháng nguyên bề mặt: - Dòng E coli BL21(DE3)/pET-PreS1 mang vector tái tổ hợp pET-PreS1 biểu kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp PreS1 dạng dung hợp 6XHisPreS1 - Dòng E coli BL21(DE3)/pGEX-PreS1 mang vector tái tổ hợp pGEX-PreS1 biểu kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp PreS1 dạng dung hợp GSTPreS1 - Dòng E coli BL21(DE3 plysS)/pGEX-PreS226 mang vector tái tổ hợp pGEX- PreS226 biểu kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp PreS226 dạng dung hợp GST-PreS226 PreS226 kháng nguyên tái tổ hợp chứa 26 axít amin PreS2 - Dòng E coli BL21(DE3)/pET-PreS1-S226 mang vector tái tổ hợp pETPreS1-S226 biểu kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp PreS1-S226 dạng dung hợp 6XHis-PreS1-S226 PreS1-S226 kháng nguyên tái tổ hợp bao gồm PreS1 26 axít amin PreS2 1.2 Biểu tinh chế kháng nguyên tái tổ hợp 1.2.1 Biểu kháng nguyên tái tổ hợp - Đã cảm ứng biểu kháng nguyên tái tổ hợp IPTG dòng E coli thu nhận (BL21(DE3)/pET-PreS1, BL21(DE3)/pGEX-PreS1, BL21(DE3 plysS) /pGEX-PreS226 BL21(DE3)/pET-PreS1-S226) - Chứng minh biểu kháng nguyên tái tổ hợp điện di SDSPAGE lai Western blot 6XHis-PreS1, GST- PreS226 1.2.2 Tinh chế kháng nguyên tái tổ hợp Đã tiến hành tinh chế kháng nguyên tái tổ hợp: - Kháng nguyên tái tổ hợp 6XHis-PreS1 tinh chế cột sắc ký lực chuyên biệt Ni-NTA agarose - Kháng nguyên tái tổ hợp GST-PreS226 tinh chế cột sắc ký lực chuyên biệt Glutathione sepharose - Kháng nguyên tái tổ hợp 6XHis-PreS1-S226 tinh chế cột sắc ký lực chuyên biệt Ni-NTA agarose 1.3 Tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên Đã tiến hành gây đáp ứng miễn dịch chuột thu nhận kháng thể đa dòng cách sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp 6XHis-PreS1-S226 tinh chế - Sử dụng phương pháp ELISA chứng minh độ pha loãng kháng 1/25.600, kháng huyết chuột nhận diện gắn vào kháng nguyên tái tổ hợp 6XHis-PreS1-S226 - Đã tinh chế kháng thể đa dòng từ kháng huyết thành chuột kháng 6XHisPreS1-S226 (sử dụng cột sắc ký lực chuyên biệt Protein G Sepharose) 1.4 Đánh giá hiệu giá, độ đặc hiệu kháng thể Đã kiểm chứng tính đặc hiệu kháng thể nhận dựa khả nhận biết gắn lên kháng nguyên bề mặt virút HBV phương pháp Sandwich ELISA SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI THEO NỘI DUNG ĐÃ ĐĂNG KÝ TT Nội dung đăng ký Thu nhận gen mã hóa kháng nguyên Pre-S1 (hoặc PreS2) Tạo dòng gen mã hóa kháng nguyên E coli Tái tạo dòng E coli Biều kháng nguyên mục tiêu kiểm chứng Tinh chế kháng nguyên sắc ký Sản phẩm đăng ký Gen mã hóa Pre-S1 (hoặc PreS2) Sản phẩm đạt gen mã hóa kháng nguyên: - Pre-S1 - PreS2-S (kháng nguyên M) - PreS2-S - PreS1-S226 Caùc vector mang gen vector pBlueScript tái tổ hợp mã hóa kháng gen mã hóa kháng nguyên: nguyên - pBlue-PreS1 - pBlue-PreS2-S - pBlue-PreS2-S - pBlue-PreS1-S226 Doøng E coli mang doøng E coli mang gen mã hóa kháng nguyên: gen mục tiêu - BL21(DE3)/pET-PreS1 - BL21(DE3)/pGEX-PreS1 - BL21(DE3 plysS)/pGEXPreS226 - BL21(DE3)/pET-PreS1-S226 Kết điện di SDS- Biểu kháng nguyên kiểm PAGE, lai miễn dịch chứng SDS-PAGE, lai Western dòng E coli Kháng nguyên tinh kháng nguyên tái tổ hợp tinh chế chế: lực Gây miễn dịch chuột/thỏ kháng nguyên tái tổ hợp Xác nhận hiệu giá kháng thể phản ứng tủa ELISA Chuột/thỏ đáp ứng miễn dịch Kết đánh giá Thu nhận IgG, tinh chế Kháng thể đa dòng tinh chế - 6XHis-PreS1 - GST-PreS226 - 6XHis-PreS1-S226 Gây đáp ứng miễn dịch chuột kháng nguyên 6XHis-PreS1S226 - Xác nhận hiệu giá kháng thể phương pháp ELISA - Xác nhận tính đặc hiệu kháng thể phương pháp Sandwich ELISA Kháng thể đa dòng kháng 6XHisPreS1-S226 SẢN PHẨM KHÁC - Kết đào tạo đại học sau đại học: + 03 khóa luận tốt nghiệp đại học * Tạo dòng biểu gen mã hóa kháng nguyên PreS1 virus viêm gan siêu vi B - Hepatitis B virus (HBV) E coli; Traàn Đặng Hiền Thảo, 2004 * Tạo dòng & biểu gen mã hóa kháng nguyên PreS2 virus viêm gan sieâu vi B - Hepatitis B virus (HBV) E coli; Lê Thái Hoàng, 2004 * Tinh chế khảo sát tính miễn dịch nguyên protein tái tổ hợp PreS1S226 virus gây bệnh viêm gan siêu vi B (HBV), Nguyễn Thị Huỳnh Nga, 2006 + 01 luận văn thạc só: * Tạo kháng nguyên tái tổ hợp, kháng thể đa dòng để ứng dụng chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B, Huỳnh Ngọc Vi Ca, 2006 - Bài báo công bố: 01 * Tạo dòng biểu gen mã hóa đoạn peptide PreS226 virus gây bệnh viêm gan B E coli, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2, 149-155, 2004 PHẦN III BÁO CÁO KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 3.1 MỞ ĐẦU Nhiễm siêu vi B vấn đề y tế xã hội quan trọng cho toàn giới, đặc biệt nước phát triển khu vực Á - Phi, chiếm khoảng 3/4 số nhiễm siêu vi B mạn tính toàn giới Theo báo cáo Tổ chức Y tế giới, viêm gan siêu vi B xếp hàng thứ nguyên nhân gây tử vong Con đường lây nhiễm quan trọng từ mẹ sang Ngoài ra, bệnh lây qua đường tình dục, qua dụng cụ bén nhọn có dính máu dịch tiết làm rách da - niêm Nhân viên y tế đối tượng có nguy bị nhiễm cao phải tiếp xúc thường xuyên với loại dịch thể máu Do đó, viêm gan siêu vi B công nhận bệnh nghề nghiệp bệnh lây nhiễm bệnh viện Hiện nay, ước tính có khoảng tỷ người bị nhiễm bị nhiễm HBV, khoảng 350 triệu người bị nhiễm mãn tính, làm chết hàng năm khoảng triệu người Tỷ lệ phát bệnh sau nhiễm thay đổi phụ thuộc vào lứa tuổi Có khoảng 80-90% trẻ sơ sinh năm tuổi nhiễm HBV trở nên mãn tính; tỷ lệ 30-50% lứa tuổi 1-4 tuổi 25% người bị nhiễm mãn tính chết ung thư xơ gan Ở người lớn, 30-50% trường hợp bị nhiễm sau lần tiếp xúc đầu tiên, 2-6% trở thành nhiễm mãn tính 15% số chết bệnh gan (http://www.Who.int/emc) Nước ta thuộc vùng dịch tễ lưu hành viêm gan, đặc biệt viêm gan B Số liệu điều tra năm 1998 1.570 người tỉnh Thanh Hóa cho kết tỷ lệ nhiễm HBV trung bình 17,2%, trẻ em 12,5%, lứa tuổi vị thành niên 20,5% người lớn 18,8% Hiện nay, tỷ lệ lưu hành bệnh viêm gan siêu vi B cao (ước tính khoảng 20% dân số có mang mầm bệnh) thường dẫn đến xơ gan, ung thư gan gây tử vong (http://www.ykhoanet.com) Mức độ phổ biến nguy hiểm nhiễm HBV nêu tạo nhu cầu bách việc tiêm phòng chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B Việc tiêm phòng thực trẻ sinh, nhiên liều lượng thay đổi tùy thuộc vào người mẹ có mang mầm bệnh hay không Đối với lứa tuổi lại, trước tiêm phòng, cần tiến hành chẩn đoán xem bị nhiễm HBV chưa Mặt khác, việc chẩn đoán cần thiết nhằm xác định bệnh thể có biểu bệnh lý gan, để có biện pháp trị liệu thích hợp Do vậy, nhu cầu chẩn đoán viêm gan siêu vi B lớn, ước tính không 100 xét nghiệm/ngày/đơn vị xét nghiệm Sự diện kháng nguyên bề mặt vỏ virút gây viêm gan B (HBsAg) điểm huyết quan trọng chẩn đoán thể bệnh lâm sàng, xét nghiệm để tiến hành tiêm thuốc chủng ngừa theo dõi tiến triển bệnh trình điều trị Ở Việt Nam, phương pháp chủ yếu dùng chẩn đoán HBV ELISA Phương pháp có ưu điểm nhanh, nhạy, rẻ tiền, tiến hành kiểm tra lúc nhiều mẫu, thao tác tương đối đơn giản Tuy nhiên, nay, tất đơn vị xét nghiệm HBV kỹ thuật ELISA Việt Nam phụ thuộc vào hóa chất (Kit) nhập từ nước ngoài, cung cấp nhiều công ty khác (Abott, Bayer, Pharmatech…) Do đó, gây không khó khăn việc thực phải phụ thuộc vào nguồn cung cấp từ nước, đồng thời làm tăng chi phí xét nghiệm Tuy nhiên, nay, chưa có nghiên cứu nước thực nhằm phát triển Kit miễn dịch để chẩn đoán HBV hạn chế khả kỹ thuật việc tạo kháng nguyên để sản xuất kháng thể Đề tài nhằm tạo kháng nguyên HBV tái tổ hợp tạo kháng thể đa dòng tạo sở cho việc phát triển phương pháp ELISA để chẩn đoán bệnh viêm gan siêu B Việt Nam 3.2 TÓM TẮT TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC CÓ LIÊN QUAN Viêm gan siêu vi B vấn đề sức khỏe mang tính toàn cầu Theo thống kê WHO, năm 1994, giới có khoảng tỷ người nhiễm virus viên gan siêu vi B có 350 triệu người nhiễm bệnh thể mãn tính, 25%40% số người nhiễm virus mãn tính chuyển thành xơ gan ung thư tối cấp Ước tính hàng năm có khoảng triệu người viêm gan mãn tính chết xơ gan ung thư gan Hiện nay, sở phân tử cấu trúc, chức phần miễn dịch học bệnh viêm gan siêu vi B biết rõ 3.2.1 Cơ sở phân tử cấu trúc chức thành phần HBV Bộ gen HBV chứa bốn khung đọc mở (Open reading frame – ORF) mã hóa cho protein vỏ (PreS1, PreS2 S); protein lõi (protein tiền lõi PreC, HBeAg HBcAg); polymerase (HBPol) protein X (HBx) Đầu 5’ mạch (+) nằm đầu 5’ mạch (-) khoảng 200bp chứa trình tự DR2 (direct repeat), đầu 5’ mạch (-) chứa trình tự DR1, trình tự có vai trò trình bắt cặp mồi để tổng hợp sợi DNA tương ứng (Hình 1) Đầu 3’ mạch (+) không cố định, gắn với DNA polymerase virus (C Seeger et al., Hepatitis B Virus Biology, Microbio & Mol Bio Reviews, 64, 51-68, 2000) a Caùc protein bề mặt Gồm nhóm protein S (SHBs), M (MHBs) L (LHBs) (Hình 2) Các phần tử HBV có khả gây nhiễm chứa đến 70% S, phần lại M L với thành phần tương đương Đây glycoprotein vỏ tiết dạng không chứa DNA khả gây nhiễm Số lượng protein phong phú vượt trội nhiều so với hạt virion có khả lây nhiễm Những phân tử có hai dạng: hình cầu – chứa chủ yếu protein S M, hình sợi – chứa lượng lớn protein L Những phân tử cho nguyên nhân gây hội chứng miễn dịch phức tạp bệnh nhân nhiễm cấp tính mồi tạo kháng thể trung hòa anti-S 1.1.1.1.1 Hình Cấu trúc gen HBV chiều phiên mã, dịch mã gen Hình Đặc điểm protein bề mặt gen tương ứng HBV - Protein S (SHBs) Còn gọi kháng nguyên Úc (Au antigen) gồm 226 axít amin, hình thành cấu thể S Đây protein nhỏ protein bề mặt HBV, có khối lượng khoảng 24 kDa, có tính kị nước cao, mang vùng xuyên màng, chứa nhiều Hình 25b So sánh trình tự protein PreS1 với trình tự ngân hàng gen Hình 26a So sánh trình tự nucleotide dòng tái tổ hợp pETPreS1/S2(26) với trình tự ngân hàng gen 56 Hình 26b So sánh trình tự protein dòng tái tổ hợp pET-PreS1-S226 với trình tự ngân hàng gen 3.8.5 Tạo kháng nguyên 6XHis-PreS1 tái tổ hợp Để thu nhận kháng nguyên PreS1tái tổ hợp, tiến hành nuôi cấy cảm ứng dòng BL21(DE3)/pET-PreS1 IPTG với nồng độ cuối 0,3mM Ở điều kiện cảm ứng này, PreS1 tái tổ hợp tạo thành dạng dung hợp với 6XHis-PreS1) (Hình 27) Nus-Tag His-Tag S-Tag HSV-Tag His-Tag pET43.1b(+) Nus-Tag His-Tag S-Tag PreS1 HSV-Tag His-Tag pET-PreS1 Hình 27 Cấu trúc gen vector tái tổ hợp gen pET-PreS1 protein dung hợp 6XHis-PreS1 Mức độ biểu gen mục tiêu kiểm tra cách điện di dịch đồng tế bào thu sau xử lý nhiệt kỹ thuật SDS-PAGE Kết phân tích điện di (Hình 28) cho thấy mẫu dịch chiết tế bào từ chủng BL21(DE3) không cảm ứng biểu gen IPTG (giếng 2) hay đượcù cảm ứng (giếng 3), chủng BL21(DE3) mang vector pET43.1b(+) không cảm ứng (giếng 4) chủng BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET-PreS1 không cảm ứng (giếng 6) vạch protein dung hợp PreS1-His-Tag Trong đó, chủng BL21(DE3) mang vector pET43.1b(+) cảm ứng biểu gen IPTG (giếng 5) cho vạch đậm tương ứng với kích thước Nus-Tag (77kDa) 57 thang phân tử lượng (giếng 1) chủng BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp (giếng 7) cho vạch đậm tương ứng với kích thước 91kDa Sự chênh lệch khối lượng hai vạch protein khoảng 14kDa tương ứng với kích thước peptid PreS1 Hơn nữa, hai vạch đậm chứng tỏ biểu vượt trội protein dung hợp so với protein khác tế bào Hình 28 Kết phân tích biểu PreS1 điện di SDS-PAGE 1, Thang phân tử lượng protein; 2, BL21(DE3), IPTG (-); 3, BL21(DE3), IPTG (+); 4, BL21(DE3)/pET43.1b(+), IPTG (-); 5: BL21(DE3)/pET43.1b(+), IPTG (+); 6: BL21(DE3)/pET-PreS1, IPTG (-); 7, BL21(DE3)/pET-PreS1, IPTG (+) Để xác nhận vạch protein dung hợp, tiến hành kiểm chứng phương pháp lai Western Blot với kháng thể kháng 6XHis Do sản phẩm biểu gen ngoại lại vector pET43.1b(+) dạng vừa dung hợp với Nus (có tác dụng làm tăng tính tan protein dung hợp), vừa dung hợp với 6XHis (giúp dễ dàng tinh chế protein dung hợp sắc ký lực chuyên biệt với cột Ni-NTA), nên vạch protein dung hợp tạp vạch lai với kháng thể chuột kháng 6XHis Vạch lại phát kháng thể thứ cấp kháng kháng thể chuột (anti-mouse IgG) đánh dấu horseradish peroxidase Sự phát sáng vạch lai ghi nhận phim chuyên biệt (Hình 29) Kết lai cho thấy có hai lai ghi nhận phim Vị trí khoảng cách hai vạch tương ứng với vị trí khoảng cách protein dung hợp 6XHis-PreS1và protein Nus-6XHis gel Điều giúp khẳng định protein biểu protein dung hợp 6XHis-PreS1 Như vậy, tạo thành công dòng E coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET-preS1 biểu vượt mức gen kháng nguyên PreS1 (21 – 119aa) vi-rút viêm gan sieâu vi B 58 3 Hình 29 Kết kiểm chứng biểu protein dung hợp bằngWestern blot với kháng thể kháng His-Tag A, SDS-PAGE; B, Western blot 1, BL21(DE3)/pET43.1b(+), IPTG (+); 2, BL21(DE3)/pET-PreS1, IPTG (-); 3, BL21(DE3) /pET-PreS1, IPTG (+); A B 3.8.6 Tạo kháng nguyên tái tổ hợp GST-PreS226 Đoạn peptid PreS226 tái tổ hợp tổng hợp dạng protein dung hợp với GST-PreS226 (Hình 30) cách nuôi dòng BL21(DE3 plysS)/pGEXPreS226 đến giai đoạn cuối pha tăng trưởng hàm mũ cảm ứng biểu gen IPTG Sự biểu PreS226 tế bào BL21(DE3 plysS)/pGEX-PreS226 kiểm chứng cách thu sinh khối, tạo dịch đồng phân tích diện GST-PreS226 phương pháp SDS-PAGE Western blot với kháng thể kháng GST MCS MCS Ampr Gluththione S-transferase PreS226 Promoter tac + IPTG NH2 COOH GST (29KDa) PreS226 Hình 30 Cấu trúc gen protein dung hợp GST-PreS226 Kết điện di SDS-PAGE (Hình 31) cho thấy mẫu dịch đồng tế bào BL21(DE3 plysS) (giếng 2); BL21(DE3 plysS)/pGEX (giếng 3); BL21(DE3 plysS)/pGEX-PreS226 (giếng 5) không cảm ứng biểu gen IPTG diện vạch đậm tương ứng với GST (29kDa) GSTPreS226 (31kDa) Khi cảm ứng IPTG, tế bào E coli pGEX/ BL21(DE3 plysS), promoter tac kích hoạt, phiên mã hàng loạt vùng gen 59 GST phía sau, làm sản xuất vượt mức protein GST (giếng 4), tạo vạch to đậm có lượng khoảng 29kDa Trường hợp tế bào BL21(DE3 plysS)/pGEXPreS226, cảm ứng IPTG (giếng 6), protein dung hợp GST-PreS226 tổng hợp vượt mức thành vạch protein to, đậm có trọng lượng khoảng 31 KDa, kích thước tính tóan protein dung hợp GST-PreS226 KDa 94 67 43 30 20,1 14,4 Hình 31 Kết phân tích biểu PreS226 điện di SDS-PAGE 1, Thang phân tử lượng protein; 2, BL21(DE3 plysS); 3, BL21(DE3 plysS) /pGEX, IPTG (-); 4, BL21(DE3 plysS) /pGEX, IPTG (+); 5: BL21(DE3 plysS) /pGEX-PreS226, IPTG (-); 6: BL21(DE3 plysS) /pGEX-PreS226, IPTG (+) Để khẳng định vạch protein tổng hợp vượt mức GST-PreS226, tiến hành lai Western blot với kháng thể chuột kháng GST Vạch lại phát kháng thể thứ cấp kháng kháng thể chuột (anti-mouse IgG) đánh dấu horseradish peroxidase Sự phát sáng vạch lai ghi nhận phim chuyên biệt Kết lai Western Blot (Hình 32) cho thấy có hai vạch lai phim có vị trí tương ứng với vị trí protein GST (giếng 4) protein dung hợp GST-PreS226 (giếng 6) điện di gel SDS-PAGE Việc thực kiểm tra phương pháp SDS-PAGE phương pháp lai Western Blot cho phép khẳng định biểu kháng nguyên PreS226 dạng protein dung hợp GST-PreS226 tế bào E coli BL21(DE3 plysS)/ pGEX-PreS226 3.8.7 Tinh chế protein tái tổ hợp 6XHis-PreS1 GST-PreS226 Protein 6XHis-PreS1 tinh chế qua cột Ni-NTA theo nguyên tắc sắc ký lực chuyên biệt Chủng Escherichia coli BL21(DE3) /pET-PreS1 nuôi cấy cảm ứng IPTG 0,4mM Từ 1000ml dịch nuôi cấy vi khuẩn thu 4g sinh khối tươi Sau tinh chế, phân đoạn 3ml sau dung ly điện di Kết điện di SDS-PAGE cho thấy có phân đoạn đầu có xuất vạch có kích thước với kích thước protein PreS1 Gộp phân đoạn có protein quan tâm, tủa protein với ammonium sulfat Thay đổi nồng độ muối dung dịch đệm phương pháp thẩm tích Thể tích cuối 3ml Đo nồng 60 độ protein phương pháp Bradford Nồng độ protein thu 1,3mg/ml (tổng 6XHis-PreS1 3,92mg) A B Hình 31 Kiểm chứng biểu PreS226 Western blot với kháng thể kháng GST A, SDS-PAGE; B, Western blot 1, Thang phân tử lượng protein; 2, BL21(DE3 plysS); 3, BL21(DE3 plysS) /pGEX, IPTG (-); 4, BL21(DE3 plysS) /pGEX, IPTG (+); 5: BL21(DE3 plysS) /pGEX-PreS226, IPTG (-); 6: BL21 (DE3 plysS) /pGEX-PreS226, IPTG (+) Protein GST-PreS226 tinh chế qua cột GSTTrapTMFF theo nguyên tắc sắc ký lực chuyên biệt Chủng Escherichia coli BL21(DE3 plysS)/pGEXpreS226 nuôi cấy cảm ứng IPTG 0,4mM Từ 1000ml dịch nuôi cấy thu 3ml dung dịch chứa GST-PreS226 chứa 0,59mg/ml GSTPreS226 (tổng GST-PreS226 1,77mg) Sau tinh chế, phân đoạn chứa GSTPreS226 cho vạch protein phân tích SDS-PAGE (Hình 32) Hình 32 Kết kiểm tra protein GST-PreS226 tái tổ hợp sau tinh chế cột GSTTrapTMFF 1, Thang phân tử lượng; 2, BL21(DE3 plysS)/ pGEX-PreS226, IPTG (-); BL21(DE3 plysS)/ pGEX-PreS226, IPTG (+); 4, Dịch nạp cột; 5, 6, 7, Các phân đoạn rửa cột; 8, Phân đoạn dung ly cột chứa GST-PreS226 3.8.8 Tạo kháng nguyên GST-PreS1 tái tổ hợp Trong dòng E coli BL21(DE3)/pGEX-PreS1, PreS1 tái tổ hợp tổng hợp dạng protein dung hợp GST-PreS1 (Hình 33) Dòng nuôi đến giai đoạn cuối pha tăng trưởng hàm mũ cảm ứng biểu gen IPTG nồng độ cuối 0,4mM Sự biểu PreS1 tế bào BL21(DE3)/pGEX-PreS1 kiểm chứng cách thu sinh khối, tạo dịch đồng phân tích diện GST-PreS1 phương pháp SDS-PAGE 61 phương pháp lai Western blot với kháng thể kháng GST kháng thể khaùng PreS1 MCS MCS Ampr Gluththione S-transferase PreS1 Promoter tac + IPTG NH2 COOH GST (29KDa) PreS1 Hình 33 Cấu trúc gen protein dung hợp GST-PreS1 Kết điện di SDS-PAGE (Hình 34a) cho thấy sau cảm ứng với IPTG chủng E coli BL21(DE3)/pGEX-PreS1 cho vạch protein lạ có kích thước nhỏ 42kDa với hàm lượng cao Trong đó, dịch chiết tế bào từ chủng E coli BL21(DE3) không cảm ứng hay cảm ứng chủng E coli BL21(DE3)/pGEX-PreS1 không cảm ứng với IPTG vạch protein Ngoài diện protein 42kDa có vạch protein tương ứng với protein GST Sau đó, kết chạy điện di SDS-PAGE tiếp tục phân tích phần mềm Quantity One để tính toán sơ trọng lượng phân tử protein tái tổ hợp mức độ biểu protein tế bào Kết cho thấy protein dung hợp GST-PreS1 có kích thước khoảng 42kDa biểu khoảng 6,9% so với toàn protein tế bào Các protein dung hợp tiếp tục kiểm tra xác nhận phương pháp lai Western Blot với kháng thể kháng GST (Hình 34b) kháng thể kháng PreS1 (Hình 34c) Kết lai Western blot với kháng thể kháng GST (Hình 34b) cho thấy giếng protein tổng số thu nhận từ dòng tái tổ hợp cảm ứng với IPTG (giếng 7) có vạch đen, vạch tương ứng với vạch protein GST (giếng 5), vạch lại có cường độ biểu vị trí tương ứng với vạch protein lạ sau chạy điện di SDS-PAGE Đồng thời, kết lai với kháng thể kháng PreS1 ((Hình 34c) xuất vạch tương ứng với vị trí protein lạ Kết hợp hai kết cho phép khẳng định biểu thành công protein PreS1 dung hợp với GST Tuy nhiên, protein mục tiêu, dòng pGEX-PreS1 có biểu rò rỉ đáng kể protein GST 3.8.9 Tạo kháng nguyên 6XHis-PreS1-S226 tái tổ hợp Trong dòng E coli BL21(DE3)/pET-PreS1-S226, PreS1 tái tổ hợp tổng hợp dạng protein dung hợp 6XHis-PreS1-S226 62 (a) (b) (c) Hình 34 Kết kiểm tra diện protein tái tổ hợp PreS1-GST phương pháp SDS-PAGE (a) Western blot với kháng thể kháng GST (b) kháng PreS1 (c) Thang phân tử lượng thấp; E coli BL21(DE3) không cảm ứng; BL21(DE3) cảm ứng IPTG; pGEX/BL21(DE3) không cảm ứng; pGEX/BL21(DE3) cảm ứng IPTG 0,4mM; pGEX-PreS1/ BL21(DE3) không cảm ứng; pGEX- PreS1/ BL21(DE3) cảm ứng IPTG 0,4 mM Dòng E coli BL21(DE3)/pET-PreS1-S226 nuôi đến giai đoạn cuối pha tăng trưởng hàm mũ cảm ứng biểu gen IPTG nồng độ cuối 0,4mM Sự biểu pET-PreS1-S226 kiểm chứng cách thu sinh khối, tạo dịch đồng phân tích diện PreS1-S226 phương pháp SDS-PAGE phương pháp lai Western blot với kháng thể kháng 6XHis kháng thể kháng PreS1 Kết điện di SDS-PAGE (Hình 35a) cho thấy chủng E coli BL21(DE3)/pET-PreS1-S226 sau cảm ứng với IPTG cho vạch protein với hàm lượng cao Trong đó, dịch chiết tế bào từ chủng BL21(DE3) không cảm ứng hay cảm ứng chủng BL21 BL21(DE3)/pET-PreS1-S226 không cảm ứng với IPTG vạch protein Kết phân tích phần mềm Quantity One cho thấy kháng nguyên tái tổ hợp 6XHis-PreS1-S226 có kích thước khoảng 25kDa, chiếm khoảng 10% protein tổng số Kết lai Western blot với kháng thể kháng thể kháng 6XHis (Hình 35b) kháng thể kháng PreS1 (Hình 35c) cho thấy hai lai xuất vạch lai trường hợp dòng tái tổ hợp cảm ứng với IPTG Vạch lai có đậm độ vị trí tương ứng với vạch protein gel điện di SDSPAGE Điều cho phép khẳng định protein biểu protein mục tiêu 6XHis-PreS1-S226 63 5 (a) (b) (c) Hình 35 Kết kiểm tra diện protein tái tổ hợp 6XHisPreS1-S226 phương pháp SDS-PAGE (a) Western blot với kháng thể kháng histidine (b) kháng PreS1 (c) Thang phân tử lượng thấp; E coli BL21(DE3) không cảm ứng; BL21(DE3) cảm ứng; BL21(DE3)/pET-PreS1-S226 không cảm ứng; BL21(DE3)/pET-PreS1-S226 cảm ứng IPTG 0,4 mM 3.8.10 Tinh chế kháng nguyên tái tổ hợp 6XHis-PreS1-S226 cột sắc ký lực chuyên biệt Ni-NTA agarose Như vậy, kết kiểm tra SDS-PAGE lai Western blot cho phép kết luận tạo dòng biểu thành công protein bề mặt HBV GST-PreS1 6XHis-PreS1-S226 Trong hai protein 6XHis-PreS1-S226 chọn để tiếp tục tinh chế tạo kháng thể đa dòng lý sau đây: - Protein 6XHis-PreS1-S226 biểu với hiệu suất cao GST-PreS1; - Tỷ lệ khối lượng phần dung hợp 6His 6XHis-PreS1-S226 thấp nhiều so với GST GST-PreS1; - 6XHis có tính miễn dịch nguyên thấp nhiều so với GST; - PreS1-S226 bao gồm PreS1 PreS2 nên tiềm ứng dụng cao Protein 6XHis-PreS1-S226 tinh chế qua cột Ni-NTA theo nguyên tắc sắc ký lực chuyên biệt Chủng E coli BL21(DE3) /pET-PreS1-S226 nuôi cấy cảm ứng IPTG 0,4mM Sau đó, ly tâm thu sinh khối, rửa sinh khối đệm PBS Đồng tế bào sóng siêu âm, ly tâm thu nhận phân đoạn dịch phần không tan, chạy điện di gel polyacrylamide 12,5% để kiểm tra protein mục tiêu biểu dạng hòa tan hay thể vùi Kết cho thấy protein 6XHis-PreS1-S226 nằm pha không tan Do biểu dạng thể vùi nên protein tái tổ hợp xử lý urea 6M trước qua cột Độ tinh protein sau tinh chế kiểm tra phương pháp SDS-PAGE (Hình 36) 64 Hình 36 Kiểm tra độ tinh khiết 6XHis-PreS1-S226 sau tinh chế cột Ni-NTA agarose Thang phân tử lượng thấp ; pET-PreS1/S2(26)/BL21(DE3) không cảm ứng; pET-PreS1/S2(26)/BL21(DE3) cảm ứng IPTG 0,4 mM; Phần dịch sau phá màng; Phần tủa sau phá màng; Phân đoạn đoạn dung ly E3; Phân đoạn dung ly E4; Phân đoạn đoạn dung ly E5 Kết chạy điện di (Hình 36) cho thấy protein 6XHis-PreS1-S226 thu tinh sạch, vạch protein mục tiêu không thấy vạch protein khác Nồng độ protein thu 500µg/ml Từ 1000ml dịch nuôi cấy thu 2ml dung dịch chứa 6XHis-PreS1-S226 với hàm lượng 0,50mg/ml (tổng 6XHis-PreS1S226 1mg) 3.8.11 Gây đáp ứng miễn dịch chuột, thu nhận tinh chế kháng thể kháng PreS1-S226 a Kiểm tra diện kháng thể kháng PreS1-S226 kháng huyết chuột Sử dụng PreS1-S226 tinh chế để chích chuột nhằm kiểm tra tính gây đáp ứng miễn dịch Thực chuột/lô Huyết thu nhận từ chuột sau tiêm nhắc với kháng nguyên mục tiêu sử dụng để kiểm tra diện kháng thể kháng kháng nguyên mục tiêu phương pháp ELISA Trong đó, nồng độ kháng nguyên phủ giếng cố định 1µg/ml, huyết khảo sát độ pha loãng khác để đánh giá lượng kháng thể mục tiêu huyết nhiều hay Thử nghiệm tiến hành đồng thời với mẫu chứng âm, tức giếng không phủ với kháng nguyên, tiến hành tương tự giếng phủ với kháng nguyên Kết đọc bước sóng 65 492nm, sau trừ tín hiệu nền, số OD đo giếng có dung dịch phát OPD H2SO4, thu kết trình bày Bảng Hình 37 Bảng Kết ELISA đo bước sóng 492nm huyết thu từ chuột lô Độ pha Chuột Chuoät Chuoät Chuoät Chuoät Chuoät loaõng (-) (-) (-) 200 3,104 0,019 2,963 0,037 3,045 0,043 400 2,9955 0,034 2,8325 0,023 2,967 0,022 800 2,8775 0,03 2,5075 0,044 2,8275 0,016 1.600 2,5395 0,032 2,182 0,031 2,453 0,034 3.200 1,9395 0,059 1,8775 0,038 2,1535 0,04 6.400 1,59 0,058 1,1015 0,018 1,9395 0,018 12.800 1,3345 0,047 0,8538 0,023 1,3345 0,018 25.600 0,054 0,829 0,037 0,062 0,566 51.200 0,06 0,32 0,042 0,829 0,044 0,4805 102.400 0,4805 0,031 0,228 0,022 0,2805 0,021 204.800 0,2675 0,034 0,1105 0,023 0,1745 0,037 509.600 0,1025 0,03 0,0805 0,021 0,1035 0,028 Ghi chuù: chuột (-): số OD492 đạt kiểm tra huyết chuột ELISA giếng không phủ kháng nguyên 3,5 Chuột 1 chuot chuot Chuột 2 chuot Chuoät 3 chuot (-) Chuoät 1 (-) chuot (-) Chuoät 2 (-) chuot (-) Chuoät 3 (-) OD 492nm 2,5 1,5 0,5 51 20 10 24 00 20 48 00 40 96 00 25 60 64 00 12 80 32 00 16 00 80 40 20 0 pha loang Độ pha loãng Hình 37 Kết kiểm tra diện kháng thể kháng protein tái tổ hợp PreS1-S226 huyết chuột ELISA 66 Trị số OD để xem dương tính phương pháp ELISA cần phải cao gấp 10 lần so với số chứng âm (có giá trị cao 0,062), tức OD cao 0,62 Kết cho thấy huyết chuột độ pha loãng 25.600 cho giá trị OD492 > 0,5 Kết khẳng định PreS1-S226 có tính miễn dịch nguyên mạnh, gây đáp ứng miễn dịch chuột tạo kháng thể nhận diện PreS1-S226 b Thu nhận tinh chế kháng thể kháng PreS1-S226 cột protein G Kháng thể kháng protein tái tổ hợp PreS1-S226 tiến hành tủa muối ammonium sulfate bão hòa 50% tinh chế cột protein G Sau đó, chạy điện di SDS-PAGE để kiểm tra độ kháng thể (Hình 38) kDa 66 45 30 ~50kDa ~25 kDa 20,1 Hình 38 Kết tinh chế kháng thể kháng PreS1-S226 1: Thang protein 2: Phân đoạn kháng huyết tủa 50% SAS 3: Phân đoạn không hấp thu cột protein A 4: Phân đoạn hấp thu cột protein A, dung ly Kết điện di cho thấy, phần dịch ly giải thu nhận phân đoạn hấp phụ cột gồm protein có kích thước khoảng 50kDa 23-25kDa tương ứng với chuỗi nặng chuỗi nhẹ kháng thể Như vậy, kháng thể sau tinh chế qua cột protein G có độ tinh cao Kháng thể dùng để kiểm tra tính đặc hiệu HBV 3.8.12 Kiểm tra tính đặc hiệu kháng thể kháng PreS1-S226 sandwich ELISA Tính đặc hiệu kháng thể kháng PreS1-S226 sau tinh chế kiểm chứng thông qua khả nhận biết gắn lên kháng nguyên bề mặt virút HBV phương pháp Sandwich ELISA Kháng thể phủ lên đáy giêng microplate Sau huyết xác định dương tính âm tính HbsAg 67 bổ sung vào giếâng Khả nhận biết bắt giữ kháng nguyên kháng thể kháng PreS1-S226 phát cách sử dụng kháng thể sơ cấp kháng thể đơn dòng (chuột) kháng HbsAg kháng thể thứ cấp kháng thể kháng IgG chuột công hợp với horse radish peroxidase Kết qaủ kiểm chứng mẫu dương tính năm mẫu âm tính (do Bệnh viện Đại học Y Dược cung cấp) trình bày Bảng Kết cho thấy kháng thể kháng PreS1-S226 có khả phát HBsAg mẫu dương tính không cho kết dương tính mẫu âm tính Như vậy, kết luận khược có tính đặc hiệu với HbsAg Bảng Kết ELISA kiểm tra tính đặc hiệu kháng thể kháng PreS1S226 Kết luận Tình trạng mẫu Maãu OD592 3,2475 + + 3,596 + + 2,445 + + 4,388 + + 2,252 + + 0,5085 0,149 0,083 0,1845 10 0,0705 - 68 PHẦN IV KẾT LUẬN Đề tài hoàn thành mục tiêu, nội dung đăng ký bao gồm: - Thu nhận tạo dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt virút gây viêm gan siêu vi B PreS1, M, PreS226, PreS1-S226 Mặc dù đăng ký kháng nguyên PreS1 PreS2, trình triển khai, đề tài linh động thực thêm nội dung khác nhằm tăng khả thành công đề tài - Đã thực việc thiết kế vector biểu cho kháng nguyên khác PreS1, PreS226, PreS1-S226; kháng nguyên PreS1 thực hệ thống biểu khác - Đã thu nhận dòng E coli mang vector biểu kháng nguyên PreS1, PreS226, PreS1-S226 - Đã biểu thành công kháng nguyên tái tổ hợp 6XHis-PreS1, GSTPreS1, GST-PreS226 6XHis-PreS1-S226 - Đã tinh chế kháng nguyên tái tổ hợp 6XHis-PreS1, GST-PreS226 6XHis-PreS1-S226 - Đã thu nhận tinh chế kháng thể đa dòng trường hợp 6XHisPreS1-S226 chuột - Đã đánh giá hiệu giá kháng thể xác nhận tính đặc hiệu kháng nguyên HBs kháng thể đa dòng thu nhận Đề tài tạo đủ vượt sản phẩm đăng ký Ngòai đề tài góp phần đào tạo cử nhân sinh học 01 thạc só 01 báo công bố tạp chí chuyên ngành Các sản phẩm đề tài ứng dụng theo hướng : - Phát triển sinh phẩm chẩn đoán viêm gan siêu vi B - Tài liệu tham khảo liên quan đến phát triển kháng nguyên tái tổ hợp virút HBV - Tài liệu tham khảo cho thí nghiệm tạo dòng sản xuất protein tái tổ hợp khác 69 PHẦN V CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI Trần Đặng Hiền Thảo Tạo dòng biểu gen mã hóa kháng nguyên PreS1 virus viêm gan siêu vi B E coli Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân ngành Công nghệ Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP.HCM, 09/2004 Lê Thái Hoàng Tạo dòng biểu gen mã hóa khánng nguyên PreS2 virus viêm gan siêu vi B E coli Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân ngành Công nghệ Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP.HCM, 09/2004 Nguyễn Thị Huỳnh Nga, Tinh chế khảo sát tính miễn dịch nguyên protein tái tổ hợp PreS1-S2(26) virus gây bệnh viêm gan siêu vi B (HBV) Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân ngành Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP.HCM, 09/2006 Huỳnh Ngọc Vi Ca Tạo kháng nguyên tái tổ hợp, kháng thể đa dòng để ứng dụng chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B Luận văn Thạc só chuyênngành Vi sinh, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP.HCM, 12/2006 Trần Linh Thước cs Tạo dòng biểu gen mã hóa đoạn peptide PreS226 virus gây bệnh viêm gan B E coli Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2, 149-155, 2004 70 ... nguyên b? ?? mặt vi rút HBV gây b? ??nh viêm gan siêu vi B, sản xuất kháng thể đa dòng đặc hiệu quy mô phòng thí nghiệm Nội dung đăng ký 6.1 Tạo dòng E coli biểu kháng nguyên b? ?? mặt PreS1 PreS2 HBV -... triển Kit miễn dịch để chẩn đoán HBV hạn chế khả kỹ thuật việc tạo kháng nguyên để sản xuất kháng thể Đề tài nhằm tạo kháng nguyên HBV tái tổ hợp tạo kháng thể đa dòng tạo sở cho việc phát triển phương... tái nhiễm HBV, mà biểu mắc HBV B? ??ng Các dấu ấn thị nhiễm HBV Dấu aán HBsAg HBeAg anti-HBs anti-HBc IgM anti-HBc IgG anti-HBe HBV DNA ALT Cấp tính + ban đầu +, sau + + ban đầu -, sau ban đầu +,