PHIẾU ĐĂNG KÝ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KH-CN Tên đề tài: SỬ DỤNG KỸ THUẬT NESTED PCR – RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL CORE PROMOTER CỦA VIRUS VIÊM GAN B Mã số: Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Cơng nghệ Trẻ Địa chỉ: Số 1 Phạm Ngọc Thạch, P. Bến Nghé, Q1, Tp. Hồ Chí Minh Điện thoại: 8233363 Tổng chi phí thực chi: Trong đó: - Từ ngân sách Nhà nước: 50.000.000 VND - Kinh phí của Bộ/Tỉnh: - Vay tín dụng: - Vốn tự có: - Thu hồi: Thời gian nghiên cứu: Thời gian bắt đầu: Thời gian kết thúc 12 Tháng 9/2006 9/2007 Tên cán bộ phối hợp nghiên cứu: 1. PGS. TS Hồ Huỳnh Thùy Dương – Bộ môn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM 2. GS.BSCKII Phạm Hòang Phiệt – Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM 3. ThS. Nguyễn Chí Vinh – Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM 4. CN. Hoàng Ngọc Diễm Mi – Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM 5. CN. Hồ Thò Thanh Thủy – Bộ môn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM Số đăng ký đề tài: Ngày: Số chứng nhận đăng ký KQNC: Ngày: Bảo mật: A. Phổ biến rộng rãi B. Phổ biến hạn chế C. Bảo mật Tóm tắt kết quả nghiên cứu 1. Đã xây dựng Quy trình xác đònh đột biến basal core promoter bằng kỹ thuật Nested PCR - RFLP, khả năng phát hiện đột biến ở 30% (3x10 3 bản sao/ml). 2. Đã xây dựng Quy trình xác đònh đột biến kháng lamivudine rt180, rt204 bằng kỹ thuật Nested PCR – RFLP, khả năng phát hiện đột biến ở 10% (1x10 3 bản sao/ml), độ nhạy 6,25x10 2 bản sao/ml. Đã tạo được các dòng mang đột biến 180M-204V có tỉ lệ tương đồng về trình tự gene 96,3% và dòng 204I có tỉ lệ tương đồng 95,8% trên plasmid pGEM-T. 3. Đã thử nghiệm 2 quy trình trên 127 mẫu huyết thanh bệnh nhân, đột biến basal core promoter chiếm tỉ lệ 32% trên nhóm khảo sát, đột biến kháng lamivudine chiếm tỉ lệ 74,4% trên nhóm khảo sát phổ biến ở 2 dạng 204I và 180M-204V. Các kết quả xác đònh đột biến phù hợp với lâm sàng. Kiến nghị về quy mơ và đối tượng áp dụng kết quả nghiên cứu: 1. Kiến nghò sử dụng quy trình để ứng dụng cho các bệnh nhân viêm gan B đang điều trò lamivudine, trước tiên là các bệnh nhân của Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM. 2. Kiến nghò chuyển giao kết quả nghiên cứu cho Công ty TNHH CNSH Khoa Thương để tiếp tục các nghiên cứu sâu hơn và phổ biến quy trình. 3. Đề nghò mở rộng nghiên cứu về tình hình kháng lamivudine trong bệnh nhân viêm gan B tại TPHCM hiện nay, có thể thực hiện các khảo sát theo thời gian điều trò (1, 2, 3 năm) hoặc theo phân loại thuốc sử dụng (lamivudine, entecavir, telbivudine). Chức vụ Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài Chủ tịch Hội đồng Đánh giá chính thức Cơ quan quản lý đề tài Họ và tên Nguyễn Chí Vinh Nguyễn Cơng Tĩnh Nguyễn Văn Thanh Phan Minh Tân Học vị ThS CN GS. TS PGS.TS Ký tên Đóng dấu SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP.HCM CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ BÁO CÁO NGHIỆM THU (ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG NGHIỆM THU) ĐỀ TÀI SỬ DỤNG KỸ THUẬT NESTED PCR – RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL CORE PROMOTER CỦA VIRUS VIÊM GAN B CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS. NGUYỄN CHÍ VINH CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TT PHÁT TRIỂN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TRẺ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 01/ 2008 SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP.HCM CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ BÁO CÁO NGHIỆM THU (ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG NGHIỆM THU) ĐỀ TÀI SỬ DỤNG KỸ THUẬT NESTED PCR – RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL CORE PROMOTER CỦA VIRUS VIÊM GAN B CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS. NGUYỄN CHÍ VINH CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TT PHÁT TRIỂN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TRẺ CỐ VẤN CHUYÊN MÔN: 1. PGS.TS HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG 2. GS.BSCKII PHẠM HOÀNG PHIỆT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 01/ 2008 THỜI GIAN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI: 09/2006 – 01/2008 ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI: Khoa Xét nghiệm - Bệnh viện Đại học Y Dược TP.HCM Bộ môn Di truyền - Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM THÀNH PHẦN THAM GIA: ThS. Nguyễn Chí Vinh: Khoa Xét nghiệm – Bệnh viện Đại học Y dược CN. Hoàng Ngọc Bảo Mi: Khoa Xét nghiệm – Bệnh viện ĐH Y dược CN. Dương Thò Thanh Hương: Khoa Xét nghiệm – Bệnh viện ĐH Y dược CN. Hồ Thò Thanh Thủy: Bộ môn Di truyền – ĐH Khoa học Tự nhiên CN. Nguyễn Vũ Trung Kiên: Bộ môn Di truyền – ĐH Khoa học Tự nhiên CN. Ngô Thò Thanh Tuyền: Trung tâm xét nghiệm Diag Center CỐ VẤN CHUYÊN MÔN: PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương – Bộ môn Di truyền Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM GS.BSCKII Phạm Hoàng Phiệt – Khoa Xét nghiệm Bệnh viện Đại học Y dược TP.HCM Bảng ghi chú các chữ viết tắt: Antiviral : Thuốc kháng virus BCP : Basal core promoter BET : Ethidium bromide bp : base pair – cặp base DNA : Deoxyribonucleic acid dATP : 2’-deoxyadenosin- 5’- triphosphate dCTP : 2’-deoxycytidin- 5’- triphosphate dGTP : 2’-deoxyguanosin- 5’- triphosphate dTTP : 2’-deoxythymidin- 5’- triphosphate dUTP : 2’-deoxyuridin- 5’- triphosphate dNTP : 2’-deoxynucleosid- 5’- triphosphate DW : Distilled water – nước cất vô trùng EDTA : Ethyldiamin tetra-acetic acid HBV : Hepatitis B Virus, Virus viêm gan B IFN : Interferon LAM : Lamivudine M : Methionine Mut : Mutation – đột biến Nu : Nucleotide OLT : Orthotopic liver transplant – ghép gan PCR : Polymerase chain reaction Phage : Thực khuẩn thể Plasmid : Thể mang DNA mục tiêu – dùng trong kỹ thuật tạo dòng Primer : Mồi – dùng trong phản ứng PCR RFLP : Restriction fragment length polymorphisms – tính đa hình kích thước của các trình tự giới hạn rpm : rounds per minute – vòng trên phút Sequencing : Giải trình tự nucleotide Taq : Thermus aquaticus V : Valine YMDD : Tyrosine Methionine Aspartate Aspartate Wt : Wild type – hoang dại PHAÀN 1: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU PHAÀN 2: NOÄI DUNG – PHÖÔNG PHAÙP PHAN 3: KET QUA BAỉN LUAN MỤC LỤC Trang Bảng ghi chú các chữ viết tắt Mục lục PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Việt Nam thuộc vùng nhiễm và bệnh lý do HBV nặng, số lượng bệnh nhân có chỉ đònh điều trò lớn 1 2. Chẩn đoán được đột biến Basal core promoter và đột biến kháng lamivudine sẽ giúp ích cho việc theo dõi và điều trò bệnh viêm gan B 1 3. Nested PCR-RFLP là kỹ thuật đơn giản và tiện ích để xác đònh đột biến Basal core promoter và đột biến kháng lamivudine 7 PHẦN 2: NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP 1. Tạo vật liệu cho quy trình 1.1. Tạo sản phẩm Nested PCR chứng dương của đột biến Basal core promoter 8 1.2. Tạo dòng lưu trữ các dạng cơ bản của đột biến kháng lamivudine, từ đó tạo các sản phẩm PCR chứng dương 8 2. Thử nghiệm thay đổi một số yếu tố 2.1. Tách chiết DNA bằng phương pháp tủa thay cho phương pháp Boom 9 2.2. Nested PCR thay cho PCR 1 bước 10 2.3. Phản ứng ủ thích hợp cho các enzyme giới hạn 11 2.4. Điện di microfluidic thay cho điện di agarose 3% 12 3. Thử khả năng phát hiện đột biến trong huyết thanh có hỗn hợp HBV đột biến/hoang dại 3.1. Khả năng phát hiện đột biến Basal core promoter trong huyết thanh hỗn hợp 12 3.2. Khả năng phát hiện đột biến kháng lamivudine trong huyết thanh hỗn hợp 13 3.3. Độ nhạy của quy trình xác đònh đột biến kháng lamivudine 13 4. Thực hiện 2 quy trình đã được cải tiến trên huyết thanh bệnh nhân 4.1. Xác đònh đột biến Basal core promoter trên huyết thanh bệnh nhân 14 4.2. Xác đònh đột biến kháng lamivudine trên huyết thanh bệnh nhân 14 PHẦN 3: KẾT QUẢ – THẢO LUẬN 1. Kết quả về việc tạo vật liệu cho quy trình 1.1. Tạo sản phẩm Nested PCR chứng dương của đột biến Basal core 15 [...]... vì phát < /b> hiện < /b> được các trường hợp hỗn hợp hoang dại và < /b> đột < /b> biến < /b> 3 Nested PCR-< /b> RFLP là kỹ < /b> thuật < /b> đơn giản và < /b> tiện ích để < /b> xác đònh đột < /b> biến < /b> Basal < /b> core < /b> promoter và < /b> đột < /b> biến < /b> kháng < /b> lamivudine < /b> Hiện < /b> nay trên thế giới có 4 nhóm kỹ < /b> thuật < /b> được dùng để < /b> phát < /b> hiện < /b> các đột < /b> biến < /b> kháng < /b> lamivudine < /b> và < /b> Basal < /b> core < /b> promoter, đó là: Phân tích trình tự chuỗi DNA (DNA sequencing), PCR < /b> đặc hiệu mẫu dò (PCR < /b> probe), PCR-< /b> RFLP và.< /b> .. lượng b nh nhân viêm < /b> gan < /b> B có chỉ đònh điều trò rất lớn [4], [6] 2 Chẩn đoán được Đột biến < /b> Basal < /b> core < /b> promoter và < /b> Đột biến < /b> kháng < /b> lamivudine < /b> sẽ giúp ích cho việc theo dõi và < /b> điều trò b nh viêm < /b> gan < /b> B 2.1 Đột biến < /b> basal < /b> core < /b> promoter Thông thường khi một b nh nhân viêm < /b> gan < /b> B mạn tính có sự chuyển huyết thanh từ HBeAg sang HbeAb là tình hình b nh ổn đònh, sự nhân b n của < /b> virus < /b> viêm < /b> gan < /b> B bò ức chế Tuy nhiên,... Khảo sát khả năng phát < /b> hiện < /b> đột < /b> biến < /b> trong trong huyết thanh có hỗn hợp HBV huyết thanh có hỗn hợp HBV đột < /b> biến < /b> và < /b> hoang dại và < /b> đột < /b> biến < /b> Mục tiêu là hoang dại Khẳng đònh quy trình có thể xác phát < /b> hiện < /b> được đột < /b> biến < /b> ở tỉ lệ 30% đònh đột < /b> biến < /b> trong huyết thanh hỗn hợp với tỉ lệ 10% đột < /b> biến < /b> (đối với B kháng < /b> lamivudine)< /b> và < /b> 30% đột < /b> biến < /b> (đối với B Basal < /b> core < /b> promoter) Xây dựng quy trình kháng < /b> Đã xây dựng... khai kỹ < /b> thuật < /b> PCR-< /b> RFLP để < /b> chẩn đoán đột < /b> biến < /b> chính kháng < /b> lamivudine < /b> ở Việt Nam Trong thực hành lâm sàng, kỹ < /b> thuật < /b> PCR-< /b> RFLP cũng được sử < /b> dụng < /b> nhiều nhất để < /b> xác đònh kháng < /b> lamivudine < /b> Có thể nói, việc hình thành quy trình PCR-< /b> RFLP để < /b> xác đònh đột < /b> biến < /b> kháng < /b> lamivudine < /b> và < /b> đột < /b> biến < /b> Basal < /b> core < /b> promoter có ý nghóa ứng dụng < /b> vì vừa đơn giản về kỹ < /b> thuật,< /b> vừa tiết kiệm về giá thành 7 Trên cơ sở là quy trình của.< /b> .. giảm biểu hiện < /b> HBeAg tùy thuộc vào loại đột < /b> biến < /b> trên Basal < /b> core < /b> promoter và < /b> sự phối hợp của < /b> chúng (b ng 1.1) Ngoài ra, đột < /b> biến < /b> này được xem là có liên quan đến ung thư gan,< /b> hiện < /b> diện ở 74,3 % các trường hợp b nh nhân ung thư gan < /b> [48], [49] B ng 1.1: Mức độ giảm biểu hiện < /b> HBeAg do các đột < /b> biến < /b> điểm phối hợp Loại đột < /b> biến < /b> trên Mức độ tăng Mức độ biểu hiện < /b> Mức độ giảm Basal < /b> core < /b> promoter sao chép b HBeAg... dõi điều trò có một số b nh nhân HBeAg âm tính mà virus < /b> vẫn hoạt động (biểu thò qua HBV DNA) Các b nh nhân này vẫn tiến triển b nh nhanh và < /b> cần được tiếp tục điều trò Một số trong các b nh nhân này có mang HBV đột < /b> biến < /b> – liên quan đến sự giảm biểu hiện < /b> của < /b> HBeAg, là 2 kiểu đột < /b> biến < /b> sau: 1 - Đột biến < /b> Basal < /b> core < /b> promoter: do đột < /b> biến < /b> kép A1762T/ G1764A - Đột biến < /b> Precore: do đột < /b> biến < /b> G1896A, hình thành... HBV đột < /b> biến/< /b> hoang dại 3.1 Khả năng phát < /b> hiện < /b> đột < /b> biến < /b> trong huyết thanh hỗn hợp 3.1.1 Khả năng phát < /b> hiện < /b> đột < /b> biến < /b> Basal < /b> core < /b> promoter trong huyết thanh hỗn hợp 3.1.2 Khả năng phát < /b> hiện < /b> đột < /b> biến < /b> kháng < /b> lamivudine < /b> trong huyết thanh hỗn hợp 3.2 Độ nhạy của < /b> quy trình xác đònh đột < /b> biến < /b> kháng < /b> lamivudine < /b> 4 Kết quả về việc thực hiện < /b> 2 quy trình đã được cải tiến trên huyết thanh b nh nhân 4.1 Xác đònh đột < /b> biến.< /b> .. rt204 b ng 3 phương pháp khác nhau: PCR-< /b> sequencing, PCR-< /b> probe, PCR-< /b> RFLPø Sau khảo sát, Allen MI đề nghò sử < /b> dụng < /b> hai phương pháp sau vì có ưu điểm hơn so với phương pháp PCR-< /b> sequencing, đặc biệt khi khảo sát trên số lượng mẫu lớn Kỹ < /b> thuật < /b> PCRRFLP phát < /b> hiện < /b> được đột < /b> biến < /b> trong dạng hỗn hợp đột < /b> biến < /b> và < /b> hoang dại với tỉ lệ đột < /b> biến < /b> là 10% Dan Yang H [12] cũng khảo sát đột < /b> biến < /b> rt180 và < /b> rt204 b ng kỹ < /b> thuật < /b> PCRRFLP... của < /b> đột < /b> biến < /b> Basal < /b> core < /b> promoter 1762T/1764A Chọn huyết thanh b nh nhân có HBV đột < /b> biến < /b> Basal < /b> core < /b> promoter, thực hiện < /b> Nested PCR < /b> với tổng thể tích lớn (200 μl), giải trình tự kiểm chứng, b o quản để < /b> làm chứng dương 1.2 Tạo dòng lưu trữ các dạng cơ b n của < /b> đột < /b> biến < /b> kháng < /b> lamivudine,< /b> từ đó tạo các sản phẩm PCR < /b> chứng dương Chọn huyết thanh b nh nhân có HBV mang các đột < /b> biến < /b> L180M/M204V, M204I, thực hiện.< /b> .. của < /b> Allen MI và < /b> K Takahashi, ứng dụng < /b> 2 quy trình cải tiến trên huyết thanh b nh nhân để < /b> xác đònh: - Đột biến < /b> kháng < /b> lamivudine < /b> - Đột biến < /b> Basal < /b> core < /b> promoter Nội dung: Đề tài đạt được các nội dung như đã đăng ký Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện < /b> Tạo vật liệu cho quy trình Đã tạo được: - Sản phẩm PCR < /b> chứng dương của < /b> đột < /b> biến < /b> kháng < /b> lamivudine < /b> (rt180, rt204) - Sản phẩm PCR < /b> chứng dương của < /b> đột < /b> biến . được đột biến Basal core promoter và đột biến kháng lamivudine sẽ giúp ích cho việc theo dõi và điều trò b nh viêm gan B 1 3. Nested PCR- RFLP là kỹ thuật đơn giản và tiện ích để xác đònh đột biến. SỬ DỤNG KỸ THUẬT NESTED PCR – RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL CORE PROMOTER CỦA VIRUS VIÊM GAN B Mã số: Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và. khả năng phát hiện đột biến trong huyết thanh có hỗn hợp HBV đột biến/ hoang dại 3.1. Khả năng phát hiện đột biến trong huyết thanh hỗn hợp 3.1.1 Khả năng phát hiện đột biến Basal core promoter