Đang tải... (xem toàn văn)
Từ xa xưa nhân loại đã trải qua biết bao các loại dịch bệnh, nhất là các bệnh do virus gây ra. Ngày nay, khi nền kinh tế ngày càng phát triển, xã hội ngày càng văn minh thì vấn đề sức khoẻ của con người lại càng được quan tâm hơn trước, bởi sự xuất hiện liên tục của hàng loạt các loại dịch bệnh mới cùng sự diễn biến phức tạp của chúng. Mặc dù khoa học công nghệ đều có những tiến bộ vượt bậc nhưng nhiều bệnh nan y như ung thư, AIDS, viêm đường hô hấp (SARS), bệnh bò điên, bệnh than…vẫn là mối đe doạ của toàn nhân loại. Điều này đòi hỏi phải có sự phối hợp của nhiều ngành thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trong một quốc gia cũng như giữa các quốc gia với nhau trong công tác phòng chống bệnh tật. Việc sử dụng enzyme ribonuclease làm thuốc chữa bệnh đã được phôi thai cách đây hàng nửa thế kỉ. Đó là vào cuối những năm 50 của thế kỉ XX một số nhà khoa học đã phát hiện ra hoạt tính gây độc tế bào (hay hoạt tính cytotoxin) của các ribonuclease và nghĩ tới khả năng sử dụng nuclease để chữa bệnh do virus.
Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học đặt vấn đề Từ xa xa nhân loại đã trải qua biết bao các loại dịch bệnh, nhất là các bệnh do virus gây ra. Ngày nay, khi nền kinh tế ngày càng phát triển, xã hội ngày càng văn minh thì vấn đề sức khoẻ của con ngời lại càng đợc quan tâm hơn trớc, bởi sự xuất hiện liên tục của hàng loạt các loại dịch bệnh mới cùng sự diễn biến phức tạp của chúng. Mặc dù khoa học -công nghệ đều có những tiến bộ vợt bậc nhng nhiều bệnh nan y nh ung th, AIDS, viêm đờng hô hấp (SARS), bệnh bò điên, bệnh thanvẫn là mối đe doạ của toàn nhân loại. Điều này đòi hỏi phải có sự phối hợp của nhiều ngành thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trong một quốc gia cũng nh giữa các quốc gia với nhau trong công tác phòng chống bệnh tật. Việc sử dụng enzyme ribonuclease làm thuốc chữa bệnh đã đợc phôi thai cách đây hàng nửa thế kỉ. Đó là vào cuối những năm 50 của thế kỉ XX một số nhà khoa học đã phát hiện ra hoạt tính gây độc tế bào (hay hoạt tính cytotoxin) của các ribonuclease và nghĩ tới khả năng sử dụng nuclease để chữa bệnh do virus. Hiện nay một trong những hớng nghiên cứu quan trọng đang đợc tiến hành trên thế giới là kiếm tìm nguồn RNase tự nhiên có hoạt tính gây độc tế bào (hay hoạt tính cytotoxin) và chuyển các RNase từ dạng không hoạt tính cytotoxin thành các dạng có hoạt tính cytotoxin, nhất là với các enzyme tip tụy, để làm thuốc điều trị ung th. Hơn nữa, ngày càng có nhiều nghiên cứu thông báo về vai trò của nhiều loại ribonuclease trong hệ thống phòng thủ và tự vệ của cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh là vi khuẩn và virus. Tuy nhiên ribonuclease từ nội tạng của động vật còn ít đợc nghiên cứu. Để góp phần tìm hiểu thêm về các nguồn RNase tự nhiên ở nớc ta, trong nội dung giới hạn của khoá luận này tôi xin đợc đề cập tới ribonuclease tách từ nội tạng của một số động vật. Khoá luận mang tiêu đề: Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01 1 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Nghiên cứu điều tra nguồn Ribonuclease từ nội tạng của động vật nhằm tìm hiểu khả năng khai thác để sử dụng làm thuốc Mục đích của khoá luận là: nghiên cứu xác định phân bố hoạt tính ribonuclease trong các nội tạng của một số động vật nhằm tìm hiểu về các nguồn enzyme động vật này và khả năng tách chiết để tạo các chế phẩm RNase phục vụ cho các mục đích sử dụng khác nhau. Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01 2 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Chơng I Tổng quan tài liệu 1.1. KháI quát chung về nhóm ribonuclease 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu Ribonuclease là nhóm enzyme có phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của acid nucleic, thực hiện chức năng tiêu hoá, chống virus, tham gia vào phản ứng miễn dịch của cơ thể V o n m 1950, ba nh khoa h c: Salganik (Liên Xô), Bernet (c) v Clerk (B) ã tin h nh nh ng th nghim u tiên v kh nng cha các bnh virus bng RNase [21]. Kt qu bc u cho thy các enzyme n y có kh nng kìm hãm s phát trin ca mt s loi virus gây bnh nh ospovaxin, herpes, adenovirus (cha ADN) hay virus viêm não, viêm ty, virus cúm (cha ARN) Nhng nm 1960 -1970, RNase ty bò (RNase A, EC 3.1.27.5) tr th nh mô hình m u trong các công trình nghiên cu enzyme hc nh u th v ngun tip cn, kh nng tinh ch d d ng c ng nh kích thc phân t nh (~14 kDa). RNase A cng l enzyme u tiên c xác nh trình t amino acid (Stein, Moor v c ng s, 1960) v l enzyme th ba c xác nh cu trúc (sau Lysozyme v Carboxypeptidase A). N m 1972, gii thng Nobel hóa hc c trao cho Stanford Moore, William Stein v Christian Anfinsen vi nhng công trình nghiên cu v RNase ca h. Nm 1984, Bruce Merrifield vinh d nhn gii thng cao quý n y v i công trình nghiên cu cng liên quan n RNase A [20]. T nhng nm cui thp kỉ 80 tới nay, nhiều nghiên cứu cơ bản v nghiên cứu theo h ớng ứng dụng RNase đã đợc tiến h nh song song v phối hợp chặt chẽ với nhau, đặc biệt l sau khi có các bằng chứng khoa học cho thấy enzyme n y có biểu hiện hoạt tính gây độc tế Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01 3 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học b o (Cytotoxin). 1.1.2. Tính đặc hiệu cơ chất Tính đặc hiệu cơ chất là điểm khác biệt chủ yếu giữa enzyme với các chất xúc tác khác cũng nh giữa enzyme này với enzyme khác. Nhóm nuclease tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất của các acid nucleic. Chúng đợc đặc trng bởi tính đặc hiệu cơ chất rộng và che phủ (chồng chéo) nhau. Hầu hết các RNase tìm thấy ở động vật có xơng sống đều có tính đặc hiệu pyrimidine. Nó phân cắt liên kết C5-O-P ng sau pyrimidine (ca base cytocil v uracil u tiên) m không phân cắt liên kết C5-O-P đứng sau purine để tạo thành dẫn xuất pyrimidine-2,3-phosphate vòng. Sau ó các sn phm vòng n y c tích ly hoc b thy phân th nh các nucleotide-3'- phosphate bng cách phân ct liên kt C2'-O-P. RNase cng xúc tác thy phân tạo nên các phosphate vòng cytidin-2,3-phosphate và uridin-2,3-phosphate. Nhng phosphate vòng n y l ti n cht ca các mononucleotide pyrimidine c tìm thy trong quá trình tiêu hóa ARN. Phù hp vi tính chất c hiu n y l các RNase không tác ng n các phosphate vòng adenosin-2',3'- phosphate v guanosin-2',3'-phosphate. C ng xut phát từ tính đặc hiệu pyrimidine, RNase chỉ thuỷ phân các acid polythymidylic, polyuridylic, polypseudouridylic v acid polyguanylic [7, 24]. 1.1.3 Cấu trúc phân tử Trong thế kỉ XX, RNase từ tụy bò (RNase A) đợc coi là mô hình mẫu và đợc nghiên cứu nhiều nhất, đầy đủ nhất về cấu trúc hoá học, tính bền vững, quá trình bao gói, cơ chế xúc tác cũng nh hớng tiến hoá phân tử. Nhờ vậy chúng ta có thêm thông tin về các enzyme thành viên thuộc siêu họ RNase ngoại tiết (hay siêu họ RNase A). Hiện nay hơn 100 thành viên thuộc siêu họ RNase A đã đợc biết đến bao gồm tất cả các RNase ngoại tiết thuộc ngành động vật có xơng sống, từ lớp lỡng c cho đến lớp thú. Hầu hết các enzyme thành viên thuộc siêu họ này khác nhau ít nhiều về trình tự amino acid nhng lại giống nhau về cấu trúc không gian (dạng monomer), trung tâm hoạt động Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01 4 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học và các tính chất xúc tác [20, 24]. RNase A đợc tiết từ các tế bào ngoại tiết tuyến tụy bò để phân huỷ một lợng lớn ARN đợc tạo bởi những vi sinh vật khu trú trong dạ cỏ. Nó có khi lng phân t nh (~14 kD) vi 124 gc amino acid trong các chui polypeptide, 19 trong tổng số 20 loại amino acid có trong protein có mặt trong cấu trúc n y (không có Trytophan). Công thức phân tử dạng không tích điện l C 575 H 907 N 171 O 192 S 12 với Mr = 13 686 Da. Về hình dạng, RNase A giống quả thận, các gốc của trung tâm hoạt động nằm trong vùng hốc (cleft) -l vùng lõm của quả thận. Cấu trúc bậc hai điển hình của RNase bao gồm 4 phiến cấu trúc đối song song ngợc chiều kề bên cạnh 3 chuỗi xoắn ngắn. Trong phân tử có 4 cầu nối disunfide đợc hình th nh từ 8 gốc cystein ở các vị trí 26-84; 40-95; 58-110 v 65-72. Các cầu nối n y có thể bị phá vỡ bởi - mercaptoethanol d thừa, tạo thành 8 nhóm -SH tự do l m phân tử enzyme bị duỗi ra v mất hoạt tính xúc tác [20]. Hầu hết các RNase thuộc siêu họ RNase A đều cấu tạo từ một mạch polypeptide, tức là có cấu trúc monomer, chỉ có một ngoại lệ là RNase trong tinh dịch bò (BS-RNase) có cấu trúc bậc 4 -dimer. BS-RNase đợc tách ra ở dạng dimer, trong đó hai tiểu đơn vị thành phần (subunit) đợc nối với nhau bởi hai cầu disunfide. ở trạng thái cân bằng, BS-RNase dimer là một hỗn hợp gồm hai cấu trúc bậc 4 hoàn toàn khác nhau, đợc ký hiệu là M=M (không có sự trao đổi chéo các đoạn mạch đầu N giữa 2 tiểu đơn vị thành phần) và MxM (có sự trao đổi chéo trên: một đoạn mạch peptide ngắn đầu N của mỗi tiểu đơn vị này sẽ liên kết với phần cấu trúc thân chính của tiểu đơn vị kia) [13]. 1.1.4. Cơ chế xúc tác Phản ứng hoá học do RNase xúc tác là phản ứng thuỷ phân liên kết phosphodiester trong phân tử acid nucleic. Quá trình thuỷ phân ARN do RNase xúc tác xảy ra qua 2 giai đoạn theo cơ chế xúc tác kiềm acid chung với sự tham gia của 2 gốc His-12 và His-119: Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01 5 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học - Giai đoạn 1: Phản ứng diễn ra nhanh, phân cắt chuỗi polymer tạo ra sản phẩm trung gian là phosphate vòng mà không giải phóng nhóm acid. Trong giai đoạn này, His-12 đóng vai trò là chất xúc tác kiềm chung (nhận proton H + ở vị trí 2') còn His-119 đóng vai trò là acid chung (proton hoá nhóm đi khỏi RNA-O-). - Giai đoạn 2: Diễn ra chậm hơn và giải phóng nhóm acid thứ hai thuộc gốc phosphate trong quá trình thuỷ phân dẫn xuất phosphate vòng. Trong giai đoạn này vai trò của 2 gốc His-12 và His-119 lại ngợc lại: His-119 tơng tác với H 2 O theo cơ chế xúc tác kiềm chung (nhận proton) còn His-12 đảm nhận việc proton hoá nhóm đi khỏi (sản phẩm) ở vị trí C-2' [7, 20, 24]. 1.2. Các chức năng sinh học của ribonuclease 1.2.1. Chức năng tiêu hoá Trong cơ thể con ngời cũng nh trong cơ thể động vật bậc cao, tuyến tụy có một vai trò vô cùng quan trọng đối với quá trình tiêu hoá. Các acid ribonucleic có trong thức ăn bị phân giải ở tá tràng dới tác động của RNase do tuyến tụy tiết ra. RNase sẽ thuỷ phân các ARN thành các mononucleotide, phosphate vô cơ và oligonucleotide. Sau đó các dạng này mới tiếp tục bị các enzyme khác trong hệ tiêu hoá phân giải thành các dạng mới giúp cơ thể dễ hấp thụ [24]. 1.2.2. Tham gia vào quá trình sinh tổng hợp ADN và ARN Một vai trò rất quan trọng của RNase trong tế bào là tham gia trực tiếp vào quá trình sinh tổng hợp ADN và ARN [16, 20, 24]. Điển hình trong vai trò này phải kể đến RNase H. RNase H thuỷ phân mạch ARN trong thành phần phân tử lai (heteroduplex) ARN-ADN tạo thành các đoạn có đầu cuối 5'-P và 3'-OH. Enzyme n y không thể hiện hoạt tính với cả ds-và ss-ARN (ARN có cấu trúc mạch kép và cấu trúc mạch đơn). RNase H chính của ngời (HI) đợc tách từ các tế bào tăng bạch hồng cầu K562, đây là một loại tế bào ung th. RNase H đợc phân ra làm 2 loại: RNase HI và RNase HII [24]. Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01 6 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học - RNase HI đóng vai trò loại bỏ ARN mồi trong quá trình sao chép ADN. RNase này có Mr = 89 kDa, cần cation hoá trị 2 cho hoạt tính xúc tác, pH tối u trong khoảng 8,0 8,5 khi có mặt 10 mM Mg 2+ cho thực hiện chức năng của nó. - RNase HII có Mr = 33 kDa và đợc tách chiết từ nhau thai, tham gia vào quá trình sao mã (tổng hợp ARN) [24], để thực hiện chức năng của mình nó cần ion Mg 2+ , pH tối u trong vùng 8,5 -9. 1.2.3. Tham gia vào quá trình chế biến và chín của ARN Quá trình chế biến và chín của ARN là những quá trình sinh hoá phức tạp với sự tham gia của nhiều loại RNase khác nhau [24]. Một trong những RNase đó là RNase P. Enzyme này có mặt ở cả sinh vật thuộc nhóm đơn giản nh vi khuẩn cổ (Archaea), vi khuẩn (Bacteria) tới các loài nhân chuẩn (Eucaria). RNase P là một enzyme có hai thành phần chính là ARN và protein gắn với nhau, trong đó tiểu đơn vị protein chiếm trọng lợng phân tử nhỏ còn tiểu đơn vị ARN đóng vai trò là TTHĐ và chiếm trọng lợng chủ yếu trong thành phần enzyme. ARN có cấu trúc bậc 2 và có thể biểu hiện hoạt tính ngay cả khi không có tiểu phân tử protein [8]. RNase P giữ vai trò thuỷ phân liên kết phosphodiester trên phân tử tiền chất tARN (pre-tARN) tạo nên tARN hoạt động tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein. Ngoài ra RNase P còn cắt mARN đặc hiệu trình tự bằng cách dùng các trình tự định hớng để liên kết với cơ chất qua các liên kết cặp đôi base, sau đó cắt rồi phân li sản phẩm [8,24]. 1.3. Các chức năng sinh học mới của ribonuclease 1.3.1. Tham gia vào phản ứng miễn dịch chống virus Phản ứng miễn dịch của cơ thể xảy ra để chống lại các yếu tố gây bệnh xâm nhập vào cơ thể nh các vi sinh vật (vi khuẩn, virus), độc tố vi sinh vật, các phân tử lạ Đến nay, chúng ta đã tìm ra đợc nhiều loại RNase có khả năng tham gia vào phản ứng miễn dịch chống virus nh RNase L, RNase bạch Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01 7 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học cầu a axit ECP và EDP, Onconase, BS-RNase RNase L là endonuclease đợc tế bào tổng hợp cảm ứng bởi interferon, đợc hoạt hoá bởi 2', 5'-oligoriboadenylate (các gốc A liên kết với nhau bằng các liên kết 2', 5'-phosphodiester) và đợc phosphoryl hoá, có Mr = 83,5 kDa. RNase L thuỷ phân cả ARN của vi khuẩn và của tế bào theo các trình tự UpN, ApU trong cùng một mạch của ARN tạo thành sản phẩm có các đầu cuối 3'- phosphate và 5'-OH. Hoạt động của enzyme này cần sự có mặt của các ion Mg 2+ và ATP. RNase L bị ức chế bởi protein-inhibitor đặc hiệu RL-I (là protein cản trở thực hiện cơ chế chống virus của interferon) [24]. Ngoài RNase L đã nêu trên, còn nhiều RNase khác có hoạt tính chống virus nh ECP, EDN của bạch cầu [18, 22] BS-RNase [22] và cả Onconase [22]. Chúng có hoạt tính kháng khuẩn, thể hiện hoạt tính cytotoxin, neurotoxin và helmintotoxin. EDN là glycoprotein, trong trình tự amino acid của nó, có 5 trình tự glycosyl hoá tại Asn (tại các vị trí 17, 59, 65, 84 và 95). ECP là một protein rất kiềm (với điểm đẳng điện pI = 10,8), có 3 điểm glycosyl hoá bởi oligosacchatide phức tạp giống với EDN [24]. 1.3.2. Hoạt tính cytotoxin Hoạt tính cytotoxin là một trong các hoạt tính sinh học quan trọng của RNase. Trong số hơn 100 enzyme thuộc siêu họ RNase A đợc biết cho đến nay, chỉ có BS-RNase (enzyme từ tinh dịch bò) và các RNase từ 3 loài ếch: ếch báo phơng Bắc Rana pipiens, ếch bò Rana catesbeiana và ếch đồng Nhật Bản Rana japonica -là có hoạt tính cytotoxin [12, 16, 20, 25]. Cơ sở của hoạt tính cytotoxin là khả năng thoát khỏi sự kiểm soát của protein ức chế (RI) trong bào tơng [6, 10, 14, 15, 20], nhờ đó RNase dễ dàng phân cắt cơ chất ARN đặc hiệu trong tế bào, giúp hiệu quả diệt khối u đợc nâng cao. Hai enzyme có hoạt tính cytotoxin đợc nghiên cứu nhiều là Onconase (ONC) và BS-RNase: -Onconase là một protein đợc tinh sạch từ trứng và phôi sớm của loài ếch Rana pipiens có hoạt tính chống ung th. Protein này còn đợc kí hiệu Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01 8 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học là P 30. Đó là một protein-monomer, có phân tử cấu tạo từ một chuỗi polypeptide với Mr = 12 000 Da và có tính tơng đồng cao với RNase A [25]. -Onconase bám vào tế bào với 2 lực bám khác nhau: một lực bám có K d = 6,2x10 -6 và một lực bám có K d = 2,5x10 -7 . ủ ở 4 0 C làm tăng tỉ lệ Onconase bám vào tế bào tỉ lệ với nồng độ bám ở 37 0 C và cũng làm tăng độ mẫn cảm của tế bào với hoạt tính gây độc của Onconase. Các dẫn liệu này cho thấy rằng bớc mà Onconase bám vào thụ thể trên bề mặt tế bào là bớc khởi đầu cho sự thể hiện độc tính của nó. Hoạt tính này có thể bị ức chế bởi NaN 3 và 2-deoxyglucose. Hoạt tính gây độc tế bào của nó gấp 10 lần Monensin. Hoạt tính RNase rất cần thiết cho sự thể hiện độc tính vì khi Onconase đợc alkyl hoá hoạt tính ribonucleolytic của nó chỉ còn lại 2% so với hoạt tính này của enzyme ban đầu và khả năng ức chế sự tổng hợp protein tế bào của Onconase đã đợc alkyl hoá cũng bị giảm đi tơng ứng 100 lần. Không giống nh RNase A, Onconase không bị ức chế bởi protein ức chế RNase có trong tế bào chất (RI), chất ức chế RNase từ nhau thai (PRI) [16, 25]. Onconase bám trên bề mặt các tế bào nhờ các thụ thể, chúng xâm nhập vào trong tế bào và thực hiện quá trình phân huỷ ARN của tế bào đó, nhờ đó ức chế quá trình tổng hợp protein và làm cho tế bào bị chết [25]. -BS-RNase đợc tách chiết từ tinh dịch bò, chúng là một dạng đồng đẳng dimer của RNase A từ tụy bò, có độc tính với các tế bào của động vật có vú. Trái ngợc với BS-RNase dimer, dạng monomer của BS-RNase lại không có độc tính và bám chặt với chất ức chế của RNase trong tế bào chất. BS-RNase dimer đi vào trong tế bào theo phơng thức hấp thụ chứ không phải là nội nhập bào qua trung gian thụ thể tế bào và sau đó không tơng tác với chất ức chế của RNase trong tế bào chất, thể hiện hoạt tính phân huỷ ARN của tế bào [13]. Hoạt tính gây độc tế bào của BS-RNase có liên quan đến cấu trúc bậc bốn của nó: chỉ dạng BS-RNase dimer có hoạt tính cytotoxin, còn dạng BS- RNase monomer hoàn toàn không độc với tế bào [13]. Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01 9 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học ở trạng thái cân bằng, BS-RNase dimer là một hỗn hợp gồm hai cấu trúc bậc bốn hoàn toàn khác nhau, có thể biến đổi qua lại: M=M và MxM (Picolli và cộng sự 1992). Sự biến đổi thuận nghịch của M=M và MxM là kết quả của sự biến đổi của các chuỗi xoắn ở đầu tận cùng N giữa các tiểu đơn vị nh là nó đã diễn ra trong suốt quá trình dimer hoá nhân tạo RNase A [15]. Hoạt tính cytotoxin của dạng MxM cao hơn của dạng M=M vì nó tồn tại bền vững trong môi trờng khử của bào tơng. Thay thế Cys-31 hay Cys-32 bằng Ser không ảnh hởng đến hoạt tính enzyme, nhng làm giảm lợng của dạng MxM ở trạng thái cân bằng và giảm hoạt tính cytotoxin [13]. Hiện nay, ngoài các RNase tự nhiên có hoạt tính chống ung th ngời ta đã tạo ra nhiều dạng biến thể (variant) của RNase A và RNase tụy ngời mang hoạt tính cytotoxin, kể cả ở dạng dimer [6, 15] và monomer [5, 9, 14]. 1.3.3. Các chức năng sinh học khác Ngoài những chức năng chính đã kể trên đây, RNase còn biểu hiện nhiều hoạt tính khác đặc trng cho từng loại tế bào, từng loại mô trong các cơ quan khác nhau của cơ thể: - RNase 5 (Angiogenin) tham gia vào sự hình thành mao mạch -kích thích sự phát triển mao mạch mới [24]. - BS-RNase gây ức chế miễn dịch [13]. - Một số RNase thể hiện độc tính chọn lọc: hoạt tính kháng khuẩn (ECP, EDP), kháng giun, kháng côn trùng [24]. Bên cạnh các RNase, trong cơ thể ngời còn có một số protein biểu hiện hoạt tính ribonucleolytic nh Lactoferrin, ABzyme -Lactoferrin có trong sữa, huyết thanh và dịch ngoại tiết (mật, nớc mắt), Mr = 80 kDa. Chức năng sinh lý chính của Lactoferrin trớc đây đợc cho là vận chuyển sắt. Tuy nhiên, protein này còn có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích phân chia tế bào, tham gia điều hoà quá trình tạo nguyên bào tủy xơng và có các tính chất kích thích miễn dịch. Protein này có 3 dạng iso khác nhau là Lf-, Lf- và Lf-. Ngời ta đã chỉ ra rằng 2 trong 3 isoform của Lactoferrin Nguyễn Thị Nguyên Lớp 03-01 10 [...]... trong tách chiết tinh sạch để nghiên cứu tính chất của protein, bởi vì khả năng kết tủa của một protein phụ thuộc nhiều vào hình dạng và kích thớc phân tử của nó Để tìm vùng nồng độ muối tối u để tủa RNase từ một số nội tạng của lợn, chó và dê chúng tôi tiến hành phơng pháp phân đoạn protein từ dịch chiết tủa ở các vùng nồng độ muối khác nhau trong khoảng từ 0%-80% bão hoà Từ các dịch chiết (trong acid... Lớp 03-01 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Chơng III kết quả và thảo luận RNase từ nội tạng của động vật ở nớc ta cho đến nay vẫn cha đợc nghiên cứu nhiều vì vậy trong giới hạn khóa luận này chúng tôi bớc đầu đã tiến hành thu nhận dịch chiết mô và phân đoạn protein trong các dịch chiết nhận đợc, sau đó xác định hoạt tính enzyme trong dịch chiết mô và trong các phân đoạn protein từ mỗi loại... chiết khác nhau Từ kết quả nhận đợc rút ra sự phân bố hoạt tính enzyme và phân bố protein, trên cơ sở đó rút ra kết luận phân đoạn nào có thể dùng làm nguồn enzyme Và sau đó là nghiên cứu một số tính chất hóa lí và xúc tác cơ bản (tính bền nhiệt, pH opt) của enzyme này và nghiên cứu khả năng làm sạch RNase từ một số chế phẩm bằng phơng pháp sắc kí trao đổi ion 3.1 kết quả phân đoạn protein từ dịch chiết... tổng số của DCTL b (11639 so với 9083 U), nhng lợng protein của DCTLb cao hơn lợng protein của DCPLa ~1,4 lần Ngợc lại, hoạt tính đặc trng của các phân đoạn protein từ DCPLa lại cao hơn nhiều so với hoạt tính đặc trng của các phân đoạn từ DCPLb Nguyễn Thị Nguyên 32 Lớp 03-01 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 3.1.2.5 Đánh giá chung về nguồn RNase nội tạng của lợn Hoạt tính chung của chiết:... chiết rút enzyme từ các nguồn RNase khác nhau trong đó có cả RNase có trong nội tạng động vật Môi trờng chiết rút enzyme có thể là: các dung dịch đệm Tris-HCl có pH trong vùng trung tính đêm Citrate, dung dich H2SO4, các dung dịch saccaroza đẳng trơng, u trơng hay nhợc trơng Tuỳ từng mục đích mà sử dụng môi trờng chiết rút thích hợp [22] Trong phạm vi của khoá luận này chúng tôi sử dụng dung dịch H... Nguyễn Thị Nguyên 26 Lớp 03-01 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Chúng tôi áp dụng phơng pháp này với RNase từ nội tạng của một số động vật cũng không ngoài mục đích đó Để cho đơn giản, từ mỗi DC chúng tôi đã thu 4 phân đoạn protein tủa trong các khoảng nồng độ muối đạt tơng ứng là 0-20%, 20-40%, 40-60% và 60-80% bão hòa (chi tiết xem phần phơng pháp nghiên cứu) Đã nhận đợc tất cả 18 DC,... pháp nghiên cứu 2.1 vật liệu và hoá chất 2.1.1 Vật liệu -Các mô động vật mua ở chợ vào lúc sáng sớm khi còn tơi Nội tạng của lợn và chó mua ở Chợ 19/5, riêng nội tạng của dê phải đặt mua từ Đan Phợng - Hà Tây mang về Chợ Ngọc Hà Sau đó, các mô này đợc mang về bảo quản trong tủ lạnh -ARN nấm men mua của hãng Sigma 2.1.2 Thiết bị và hoá chất -Thiết bị: cân điện tử, máy li tâm lạnh, máy khuấy từ, máy quang... của ngời làm giảm hiệu ứng gây dị ứng của các tác nhân gây dị ứng có hoạt tính RNase ở một số loại thực vật Các activator của RNase có thể đợc sử dụng để điều trị bệnh nhiễm trùng virus Hoạt hoá RNase L cần thiết để ức chế sinh sản của nhiều virus trong tế bào Các chất đồng đẳng phosphothoiat của 2,5-oligoadenylate (hoạt hoá hiệu quả RNase L) ngăn chặn phát triển nhiễm trùng virus Các inhibitor của RNase... tôi sử dụng dung dịch H 2SO4 0,25 N và đệm PBS 10 mM, pH = 7,2 để chiết rút RNase từ các mô khác nhau Dung dịch H2SO4 0,25 N có tác dụng vô hiệu hoá các enzyme thuỷ phân có trong lizosom (bào quan giàu enzyme trong các tế bào động vật) Theo nhiều tài liệu thì dung dịch axit này đã đợc nhiều phòng thí nghiệm sử dụng để nghiền mô của động vật nhằm tách nhiều enzyme trong đó có RNase [1, 22] Dung dịch đệm... chung của DC a giảm theo dãy: DCTL > DCGL > DCLL > DCPL Nên chiết rút RNase từ tụy lợn và phổi lợn bằng acid, còn enzyme từ LL hay GL có thể chiết rút bằng dung dịch acid hay dung dịch đệm PBS đều tốt Các phân đoạn TL-2a, TL-3a và TL-4a LL-3a và LL-4a; GL-3a, GL-3b và GL-4b; PL-3a và PL-4a là các phân đoạn có A0 cao nhất từ các DC mô tơng ứng và có thể sử dụng để làm nguồn RNase cho các nghiên cứu khác . Ribonuclease từ nội tạng của động vật nhằm tìm hiểu khả năng khai thác để sử dụng làm thuốc Mục đích của khoá luận là: nghiên cứu xác định phân bố hoạt tính ribonuclease trong các nội tạng của một số động. cập tới ribonuclease tách từ nội tạng của một số động vật. Khoá luận mang tiêu đề: Nguyễn Thị Nguyên Lớp 0 3-0 1 1 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Nghiên cứu điều tra nguồn Ribonuclease. virus. Tuy nhiên ribonuclease từ nội tạng của động vật còn ít đợc nghiên cứu. Để góp phần tìm hiểu thêm về các nguồn RNase tự nhiên ở nớc ta, trong nội dung giới hạn của khoá luận này tôi xin