Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI        LÊ THỊ NGỌC THÚY KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM NẤM MỐC ASPERGILLUS SPP. Ở MỘT SỐ NGUỒN DƯỢC LIỆU LÀM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, 2014 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI        LÊ THỊ NGỌC THÚY KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM NẤM MỐC ASPERGILLUS SPP. Ở MỘT SỐ NGUỒN DƯỢC LIỆU LÀM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO HÀ NỘI, 2014 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan số liệu và các kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa ñược sử dụng trong bất kì một học vị nào. Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận án này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Lê Thị Ngọc Thúy Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự quan tâm, giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi từ các thầy cô, gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo PGS.TS. Nguyễn Thị Phương Thảo, người ñã tận tình dìu dắt, dạy bảo và tạo mọi ñiều kiện tốt nhất ñể tôi thực hiện ñề tài và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tôi xin cảm ơn sự nhiệt tình chỉ bảo, giúp ñỡ của các anh chị, các bạn Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã dành cho tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài. Tôi xin cảm ơn sự quan tâm, giúp ñỡ của các lãnh ñạo, các anh chị và các bạn Trạm kiểm ñịnh chất lượng Nông lâm sản và thủy sản Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi và giúp ñỡ tôi thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời biết ơn sâu sắc ñến gia ñình cùng toàn thể bạn bè ñã ñộng viên giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như trong quá trình hoàn thành khóa luận. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Lê Thị Ngọc Thúy Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii 1. MỞ ðẦU 1 1.1. ðặt vấn ñề 1 1.2. Mục ñích và yêu cầu nghiên cứu 2 1.2.1. Mục ñích 2 1.2.2. Yêu cầu 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học 2 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Giới thiệu về thực phẩm chức năng và một số loại thực phẩm chức năng chứa thành phần dược liệu 3 2.1.1. Khái niệm thực phẩm chức năng 3 2.2.2. Tình hình sử dụng dược liệu làm thực phẩm chức năng tại Việt Nam 3 2.2. Tình hình nhiễm nấm mốc trên dược liệu 7 2.2.1. Nguyên nhân 7 2.2.2. Thực trạng 8 2.2.3. Tác hại 10 2.3. Phát hiện và ñịnh danh nấm mốc Aspergillus 11 2.3.1. Một số ñặc ñiểm của nấm mốc Aspergillus 11 2.3.2. ðịnh danh nấm mốc Aspergillus spp 15 2.4. Phương pháp thu thập và lấy mẫu chuẩn 20 2.4.1. Quy ñịnh chung 20 2.4.2. Kỹ thuật lấy mẫu 21 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv 3. VẬT LIỆU – NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1. Vật liệu nghiên cứu 23 3.2. Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 23 3.3. Nội dung nghiên cứu 23 3.4. Phương pháp nghiên cứu 24 3.4.1. Thu thập mẫu dược liệu 24 3.4.2. Xác ñịnh ñộ ẩm trong mẫu dược liệu 27 3.4.3. Phát hiện nấm mốc bằng phương pháp thường quy (52 TCN-TQTP 0001:2003 và 52 TCN-TQTP 0009:2004) 28 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1. Thu thập mẫu 37 4.1.1. Thu thập mẫu dược liệu 37 4.1.2. Xác ñịnh ñộ ẩm của dược liệu 40 4.1.3. Thu thập mẫu thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược 42 4.2. ðánh giá nhiễm nấm mốc Aspergillus spp. ở các mẫu dược liệu bằng phương pháp thường quy 48 4.3. ðánh giá nhiễm nấm mốc Aspergillus spp. ở các mẫu sản phẩm thực phẩm chức năng bằng phương pháp thường quy 60 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 75 5.1. Kết luận 75 5.2. ðề nghị 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Từ viết tắt 1 APA : Aflatoxin production agar 2 A.flavus Aspergillus flavus 3 A.niger Aspergillus niger 4 A.fumigatus Aspergillus fumigates 5 A.parasiticus Aspergillus parasiticus 6 A.versicolor Aspergillus versicolor 7 CYA : Czapek yeast extract 8 DNA : Deoxyribose nucleic acid 9 ELISA : Enzyme – Link Immuno Sorbent Assay (Phương pháp hấp thụ miễn dịch gắn enzyme) 10 GACP-WHO : World Health organization guidelines on Good Agricultural and Collection Practices for medicinal plants (Thực hành tốt trồng trọt và thu hái cây thuốc) 11 MEA : Malt extract agar 12 PCR : Polymerase Chain Reaction 13 PDA : Potato dextro agar 14 PE : Polyetylen 15 RAPD : Randomly Amplified Polymorphic DNA 16 RELP : Restriction Fragmen Length Polymorphism 17 TCN : Tiêu chuẩn ngành 18 TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam 19 TPCN : Thực phẩm chức năng Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1. Các loại thực phẩm chức năng phổ biến……………………… 5 Bảng 2.2: Các loài nấm Aspergillus sinh ñộc tố………………………… 15 Bảng 3.1: Thành phần Thạch Sabouraud……………………………… 29 Bảng 3.2: Thành phần thạch Czapek…………………………………… 30 Bảng 3.3: Thành phần dung dịch Lactofenol Amann…………………… 30 Bảng 3.4: ðặc ñiểm hình thái các loài nấm Aspergillus………………… 34 Bảng 4.1: Danh sách, ñịa ñiểm lấy mẫu nguyên liệu…………………… 37 Bảng 4.2: ðộ ẩm của mẫu dược liệu……………………………………… 41 Bảng 4.3: Mẫu thực phẩm chức năng thu thập ñược…………………… 42 Bảng 4.4: ðặc ñiểm hình thái Aspergillus spp. trên mồi trường Sabouraud (sau 5 ngày nuôi cấy) 49 Bảng 4.5: Kết quả phân lập nấm mốc Aspergillus trên mẫu dược liệu… 53 Bảng 4.6: Hình thái khuẩn lạc nấm mốc Aspergillus của các mẫu dược liệu. Phân lập ñược từ các mẫu dược liệu trên môi trường Czapek (sau 5 ngày nuôi cấy) 56 Bảng 4.7: Tổng hợp kết quả các loài nấm mốc Aspergillus bị nhiễm trên dược liệu……………………………………………………………… 59 Bảng 4.8 ðặc ñiểm hình thái Aspergillus spp. trên mồi trường Sabouraud (sau 5 ngày nuôi cấy) 61 Bảng 4.9 ðặc ñiểm hình thái của Aspergillus spp. Phân lập ñược từ các mẫu thực phẩm chức năng trên môi trường Czapek (sau 5 ngày nuôi cấy) 66 Bảng 4.10: Tổng hợp kết quả các loài nấm mốc Aspergillus bị nhiễm trên mẫu thực phẩm chức năng………………………………………… 72 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang Hình 2.1 : Cấu tạo sợi nấm………………………………………… 13 Hình 4.1: Giảo cổ lam……………………………………………… 38 Hình 4.2: Diệp hạ châu…………………………………………… 39 Hình 4.3: Hoa hòe………………………………………………… 39 Hình 4.4: Mẫu Atiso………………………………………………… 39 Hình 4.5: Mẫu cúc hoa…………………………………………………… 40 Hình 4.6: Thực phẩm chức năng dạng siro……………………… 46 Hình 4.7: Thực phẩm chức năng dạng viên nén………………… 46 Hình 4.8: Thực phẩm chức năng dạng viên sủi………………… 46 Hình 4.9: Thực phẩm chức năng dạng viên nang mềm………… 47 Hình 4.10: Thực phẩm chức năng dạng viên nang cứng………… 47 Hình 4.11: Thực phẩm chức năng dạng trà túi lọc……………… 47 Hình 4.12: Thực phẩm chức năng dạng nước giải khát………… 48 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 1 1. MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt ñới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và ña dạng. Theo thống kê sơ bộ, ở Việt Nam hiện ñã biết khoảng 10.350 loài thực vật bậc cao có mạch, khoảng 800 loài Rêu, 600 loài Nấm và hơn 2000 loài Tảo. Trong ñó có nhiều loài làm thuốc. Tổng sản lượng dược liệu ở Việt Nam hàng năm ước tính khoảng từ 3-5 nghìn tấn. Một số dược liệu quý ñã ñược thế giới công nhận và có tiềm năng phát triển rất lớn như: hồi, trinh nữ hoàng cung, atiso, sâm Ngọc Linh, tràm, hoa hòe Ngày nay, việc tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao ñể làm thực phẩm chức năng là một xu thế ñược rất nhiều các nhà khoa học quan tâm. Việt Nam là một trong những quốc gia thuộc các vùng nhiệt ñới – nơi chứa ñựng giá trị ña dạng sinh học cao chưa ñược khám phá. Bên cạnh ñó, cộng ñồng các dân tộc ở nước ta cũng có vốn tri thức bản ñịa sử dụng các loài ñộng vật, thực vật và khoáng vật làm thuốc. Hai lĩnh vực này ñược các nhà khoa học coi là một tiềm năng, trong việc tìm kiếm nghiên cứu tạo ra những loại thực phẩm chức năng mới, có hiệu lực hỗ trợ ñiều trị cao các bệnh mãn tính, tăng cường sức khoẻ …trong tương lai. Tuy nhiên, hiện nay nguồn dược liệu làm thực phẩm chức năng vẫn chưa ñược kiểm soát chặt chẽ. Nhiều loại nguyên liệu ẩn chứa nhiều nguy cơ gây hại ñối với sức khoẻ như chứa ñộc tố, chứa chất kích thích hay nhiễm nấm men nấm mốc mà không ñược theo dõi trước khi chế biến thực phẩm chức năng bán ra thị trường. Nếu như trong quá trình chế biến không tiêu diệt ñược nấm men, nấm mốc thì tác hại của chúng ñối với sức khoẻ là rất lớn Từ những ñánh giá trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Khảo sát tình hình nhiễm nấm mốc Aspergillus spp. ở một số nguồn dược liệu làm thực phẩm chức năng". [...]... ðánh giá ñư c tình hình nhi m n m m c ngu n dư c li u dùng làm th c ph m ch c năng hi n có trên th trư ng 1.2.2 Yêu c u - L y m u các ngu n dư c li u s d ng làm th c ph m ch c năng bao g m: dư c li u ñã sơ ch , dư c li u bán thành ph m và thành ph m t các ngu n dư c li u trên ñ ti n hành kh o sát - Phân l p các loài n m m c Aspergillus spp nhi m trên các ngu n m u và s n ph m th c ph m ch c năng - ðánh... nh danh n m m c Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus theo “Thư ng quy k thu t ñ nh danh n m m c Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus trong th c ph m“ do B Y t ban hành[1] Tiêu chu n ngành: 52 TCN-TQTP 0001:2003, có hi u l c t ngày 25 tháng 3 năm 2003 và 52 TCN-TQTP 0009:2004 “ Thư ng quy k thu t ñ nh danh n m m c Aspergillus parasiticus, Aspergillus vesicolor... Sabouraud Khi nhi t ñ thích h p 28oC m u n m nuôi c y s có nh ng bi u hi n hình thái ñ c trưng cho loài ð c ñi m s i n m, hình d ng b ng ho c kh năng hình thành b ph n vô tính như túi bào t , bào t vách dày (chlamydospore) trên b m t môi trư ng nuôi c y là ñ c ñi m quan tr ng ñ phát hi n Aspergillus Các ñ c ñi m c a khu n l c c n quan sát: - Hình d ng (thư ng là tròn, g n tròn) - Kích thư c (ñư ng kính, chi... phát hi n ñư c 25 ch ng Aspergillus trên 41 m u dư c li u trong ñó các loài ph bi n là Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Aspergillus fumigatus Qua vi c s d ng k thu t Elisa ñ phát hi n Aflatoxin k t qu cho th y vi c s n xu t aflatoxin ñư c gi i h n trong 1 loài Aspergillus flavus 2.2.2.2 Tình hình nhi m n m m c trên dư c li u trong nư c Theo th ng kê, t l s dư c li u b m c m t... các s n ph m th c ph m ch c năng có ngu n g c t dư c li u t ñó có l a ch n phù h p ñ i v i các s n ph m th c ph m ch c năng này Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 2 2 T NG QUAN TÀI LI U 2.1 Gi i thi u v th c ph m ch c năng và m t s lo i th c ph m ch c năng ch a thành ph n dư c li u 2.1.1 Khái ni m th c ph m ch c năng Th c ph m ch c năng (Functional foods) ñư c... nh ng ñ c ch t có kh năng gây ung thư….Nhi m Aflatoxin gây ra các b nh trên gia c m, gia súc, nh hư ng ñ n s c kh e, năng su t và ch t lư ng s n ph m c a chúng.[12] Aspergillus nhi m trong các nguyên li u th o dư c b nhi m n m m c làm gi m ch t lư ng dư c li u, các ñ c t do Aspergillus ti t ra gây nh hư ng l n ñ n s c kh e con ngư i khi s d ng 2.3 Phát hi n và ñ nh danh n m m c Aspergillus 2.3.1 M t... aflatoxin và có kh năng gây b nh - Aspergillus parasiticus Loài này tương t như loài Aspergillus flavus, ch có hai ñi m khác là chúng ch có m t b cu ng ñính bào t và b m t cu ng nh n ho c xù xì Chúng cũng có th t o aflatoxin và gây b nh - Aspergillus niger Nhóm này g m có trên dư i 10 loài Chúng có màu ñen khi quan sát b ng m t thư ng do chúng t o bào t ñính màu ñen, nhưng l i có màu nâu khi quan sát dư i kính... ch c năng là th c ph m có l i cho m t hay nhi u ho t ñ ng c a cơ th như c i thi n tình tr ng s c kho và làm gi m nguy cơ m c b nh hơn là so v i giá tr dinh dư ng mà nó mang l i" Theo IFIC, th c ph m ch c năng là nh ng th c ph m hay thành ph n c a ch ñ ăn có th ñem l i l i ích cho s c kho nhi u hơn giá tr dinh dư ng cơ b n B Y t Vi t Nam ñ nh nghĩa th c ph m ch c năng là th c ph m dùng ñ h tr ch c năng. .. tác d ng dinh dư ng, t o cho cơ th tình tr ng tho i mái, tăng s c ñ kháng và gi m b t nguy cơ gây b nh Tuỳ theo công th c, hàm lư ng vi ch t và hư ng d n s d ng, th c ph m ch c năng còn có các tên g i sau: th c ph m b sung vi ch t dinh dư ng, th c ph m b sung, th c ph m b o v s c kho , s n ph m dinh dư ng y h c.[5] 2.2.2 Tình hình s d ng dư c li u làm th c ph m ch c năng t i Vi t Nam V i xu hư ng “Tr... ngh lên men (s n xu t enzyme amylase, protease), acid h u cơ (acid citri, acid glucomic) M t s loài l i t o thành mycotoxin có kh năng gây ung thư (Aspergillus flavus, Aspergillus paraciticus, Aspergillus versicolor…) 2.3.1.2 C u t o s i n m và h s i n m S i n m là m t ng hình tr dài, có vách ngăn ngang Các s i n m v a phát tri n theo chi u dài, v a phân nhánh và t o thành các vách ngăn Các nhánh l . ñược tình hình nhiễm nấm mốc ở nguồn dược liệu dùng làm thực phẩm chức năng hiện có trên thị trường. 1.2.2. Yêu cầu - Lấy mẫu các nguồn dược liệu sử dụng làm thực phẩm chức năng bao gồm: dược. THỊ NGỌC THÚY KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM NẤM MỐC ASPERGILLUS SPP. Ở MỘT SỐ NGUỒN DƯỢC LIỆU LÀM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI. LIỆU 2.1. Giới thiệu về thực phẩm chức năng và một số loại thực phẩm chức năng chứa thành phần dược liệu 2.1.1. Khái niệm thực phẩm chức năng Thực phẩm chức năng (Functional foods) ñược