ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THANH TÂM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA VÀ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT LIGNAN VÀ STILBENE Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH Mã số: 604429 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. NGUYỄN THỊ THANH MAI 2. GS. OLE VANG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2010 I Lời Cảm Ơn  Trước tiên, tôi xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Thanh Mai, người đã tận tình giúp đỡ, chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Xin cảm ơn tất cả các thầy cô đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập nghiên cứu chương trình sau đại học Xin cảm ơn các thầy cô thuộc dự án DANIDA đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện luận văn tại trường Đại Học Roskilde – Đan Mạch Xin cảm ơn thầy Nguyễn Trung Nhân, người đã cung cấp mẫu thử và cung cấp nhiều lời khuyên quý báu trong quá trình thực hiện đề tài Và cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè và đặc biệt các bạn trong lớp cao học phân tích K16, những người luôn bên tôi động viên, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn thạc sĩ này. Thành phố Hồ Chí Minh tháng 1, 2010. II MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời Cảm Ơn I MỤC LỤC II DANH MỤC CÁC BẢNG VII DANH MỤC CÁC HÌNH VIII DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ IX DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ X 1. Giới thiệu đề tài 1 2. Giới thiệu một số phƣơng pháp nghiên cứu khả năng chống oxi hóa 3 2.1 Khái niệm về gốc tự do 3 2.2 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể 3 2.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể 4 2.4 Các phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 6 2.4.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 6 2.4.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 7 2.4.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng MDA 9 2.4.4 Phƣơng pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II (Iron chelating activity) 10 2.4.5 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO) 10 2.4.5.1 Giới thiệu 10 2.4.5.2 Cấu tạo 10 2.4.5.3 Cơ chế hoạt động của enzyme XO 10 2.4.5.4 Nguyên tắc quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO 11 3. Giới thiệu phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào 12 III 3.1 Nuôi cấy tế bào 12 3.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào 13 3.2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào 13 3.2.2 Phƣơng pháp SRB 13 4. Tổng quan các chất nghiên cứu thuộc họ lignan và stilbene 14 4.1 Lignan 14 4.1.1 Isotaxiresinol (ITR) 15 4.1.2 Secoisolariciresinol (SSR) 15 4.2 Stilbene 16 4.2.1 Resveratrol (RES) 17 4.2.2 Pterostilbene (PTS) 18 4.2.3 Piceatannol (PI) 19 5. Kết quả và thảo luận 21 5.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa 21 5.1.1 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 21 5.1.2 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 25 5.1.3 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme XO 27 5.1.4 Tóm tắt kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa 28 5.2 Kết quả nghiên cứu độc tính tế bào 31 5.2.1 Isotaxiresinol 31 5.2.2 Secoisolariciresinol 34 5.2.3 Resveratrol, Pterostilbene và Piceatannol 37 5.2.4 Tóm tắt kết quả nghiên cứu độc tính tế bào 42 6. Thực nghiệm 45 6.1 Hóa chất và dụng cụ 45 6.1.1 Hóa chất 45 IV 6.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 46 6.1.3 Chuẩn bị mẫu 47 6.1.4 IC 50 và cách xác định 48 6.1.4.1 Định nghĩa 48 6.1.4.2 Cách xác định IC 50 48 6.2 Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa 49 6.2.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 49 6.2.1.1 Nguyên tắc 49 6.2.1.2 Quy trình thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH 49 6.2.1.3 Chuẩn bị hóa chất 50 6.2.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 51 6.2.2.1 Nguyên tắc 51 6.2.2.2 Chuẩn bị hóa chất 52 6.2.2.3 Sơ đồ biểu diễn quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 52 6.2.3 Phƣơng pháp ức chế enzyme XO 54 6.2.3.1 Nguyên tắc 54 6.2.3.2 Chuẩn bị hóa chất 54 6.2.3.3 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO 54 6.3 Nghiên cứu độc tính tế bào 56 6.3.1 Phƣơng pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào 56 6.3.2 Phƣơng pháp SRB 57 7. Tài Liệu Tham Khảo 63 V DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ITR Isotaxiresinol SSR Secoisolariciresinol RES Resveratrol PTS Pterostilbene PI Piceatannol Da Dalton ROS Reactive oxygen species DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl NO Nitric oxide SOD Superoxyde dimustase CAT Catalase FDA Flavin adenin dinucleotide Fe Iron Mo Molybdenum NED N-1-naptyletilendiamin dihydroclorur MDA Malonyl dialdehyde XO Xanthine oxidase SRB Sulforhodamine B VI IC 50 Half maximal inhibitory concentration DMSO Dimethylsulfoxide NaCl Sodium chloride PBS Phosphate buffer saline FBS Fetal bovin serum TCA Trichloroacetic acid COX-1 Cyclooxygenase - 1 COX-2 Cyclooxygenase - 1 HPLC High performance liquid chromatography GC Gas chromatography NMR Nuclear magnetic resonance VII DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của PI, RES và PTS 21 Bảng 2. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 21 Bảng 3. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 25 Bảng 4. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc enzyme XO 27 Bảng 5. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc enzyme XO của Allopurinol ở nồng độ từ 0.2 đến 5 uM 27 Bảng 6. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH, gốc tự do NO và enzyme XO của các chất 30 Bảng 7. Kết quả ảnh hƣởng của ITR 300µM lên hình dạng tế bào 33 Bảng 8. Kết quả ảnh hƣởng của ITR lên dạng hình học của tế bào 33 Bảng 9. Kết quả ảnh hƣởng của SSR lên dạng hình học của tế bào 35 Bảng 10. Ảnh hƣởng của RES lên dạng hình học của dòng tế bào DLD-1 40 Bảng 11. Ảnh hƣởng của PTS lên dạng hình học của dòng tế bào DLD-1 41 Bảng 12. Ảnh hƣởng của PI lên dạng hình học của dòng tế bào DLD-1 42 Bảng 13. Tóm tắt kết quả nghiên cứu độc tính tế bào theo phƣơng pháp CC và SRB 44 Bảng 14.Cách pha dung dịch thử hoạt tính DPPH có nồng độ từ 10 đến 100 μM 50 Bảng 15. Cách pha dung dịch thử hoạt tính DPPH có nồng độ từ 1 đến 10 μM 51 Bảng 16.Cách pha dung dịch thử hoạt tính NO có nồng độ từ 10 đến 100 μM 53 Bảng 17. Cách pha dung dịch thử hoạt tính ức chế enzyme XO có nồng độ từ 10 đến 100 μM 56 VIII DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Phản ứng trung hòa gốc DPPH 7 Hình 2. Cơ chế phản ứng lên màu nitrit bằng thuốc thử Greiss 8 Hình 3. Cơ chế phản ứng lên màu của MDA và Acid thiobarbituric 9 Hình 4. Cơ chế xúc tác của XO cho phản ứng biến đổi xanthine thành acid uric 11 Hình 5. Phản ứng tạo acid uric 12 Hình 6. Khung sƣờn cấu trúc Lignan 14 Hình 7. Công thức cấu tạo của Isotaxiresinol 15 Hình 8. Công thức cấu tạo của Secoisolariciresinol 16 Hình 9. Khung sƣờn trans-stilbene 17 Hình 10. Khung sƣờn cis-stilbene 17 Hình 11. Công thức cấu tạo của Resveratrol 17 Hình 12. Công thức cấu tạo của Pterostilbene 18 Hình 13. Công thức cấu tạo của Piceatannol 19 Hình 14. Công thức cấu tạo của Quercetin 51 IX DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1. Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 50 Sơ đồ 2. Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 53 Sơ đồ 3. Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO 55 [...]... có nhiều hoạt tính sinh học nhƣng ít đƣợc sử dụng Do đó mục tiêu của đề tài này là xác định và so sánh hoạt tính chống oxy hóa và độc tính tế bào trên dòng tế bào DLD-1 của các hoạt chất RES, PTS, PI thuộc họ stilbene và SSR, ITR thuộc họ lignan Từ đó đề ra các hƣớng ứng dụng mới cho hợp chất tiềm năng và có thể thay thế RES 2 2 Giới thiệu một số phƣơng pháp nghiên cứu khả năng chống oxi hóa 2.1 Khái... 37oC Tế bào phục vụ cho thí nghiệm đƣợc rửa bằng PBS và tách khỏi chai nuôi cấy tế bào bằng dung dịch trypsin 2% 12 3.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào 3.2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào Nghiên cứu sự phát triển của tế bào dựa trên phƣơng pháp đếm tế bào sinh ra hoặc tế bào phát triển theo thời gian Phƣơng pháp đếm tế bào và xác định kích thƣớc dựa trên sự phát hiện và sự... 25,12,17 Một số nghiên cứu gần đây cho thấy nó gián tiếp có nhiều hoạt tính sinh học nhƣ ngăn ngừa vi khuẩn, trị nấm, kháng virus, chống ung thƣ, chống viêm khớp và hoạt tính chống oxy hóa mạnh, … 11,12,16,19,24,25,56 14 acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu nhƣ Tris-base để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lƣợng 22,31,40,57 4 Tổng quan các chất nghiên cứu thuộc họ lignan và stilbene. .. thành công của hóa học tổ hợp và khảo sát lâm sàng Từ đó, một lần nữa con ngƣời đã bắt đầu hiểu rõ giá trị của các sản phẩm tự nhiên và làm sống lại nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên bằng cách kết hợp các kỹ thuật tách và xác định nhanh, tổng hợp song song, tính toán và có lẽ thêm nhiều kỹ thuật mới vào trong hóa dƣợc của các hợp chất thiên nhiên29 Các hợp chất phenolic đại diện cho một nhóm lớn của các... quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ƣu và dễ thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu Dƣới đây chúng tôi xin giới thiệu một số phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa đơn giản, ổn định và đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực tế 5 2.4 Các phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 2.4.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH Năm 1922 Goldschmidt và Renn đã phát hiện ra một gốc tự do... các lignan nhƣ secoisolariciresinol (SSR) và isotaxiresinol (ITR) đƣợc công bố có hoạt tính ức chế chu trình chết của khối u gan 11,12,16,17,24,25 Từ các kết quả nghiên cứu về hoạt tính chống oxi hóa và độc tính tế bào của RES nên hiện nay hợp chất này đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các loại dƣợc phẩm hiện có trên thị trƣờng Trong khi đó, các hợp chất khác thuộc họ phenolic cũng đƣợc tìm thấy có nhiều hoạt. .. (PIC) và transpterostilbene (TPS), cũng đƣợc báo cáo là thể hiện các hoạt tính ngăn ngừa bệnh, kháng viêm và chống oxi hóa Các nghiên cứu sự ức chế sinh trƣởng hay chu trình chết apoptosis đƣợc thực hiện trên các dòng tế bào lymphocyte, tế bào melanocyte, các tế bào dạng biểu bì 13,27,36,37,46,50 Trong khi đó, các hợp chất lignan đƣợc biết đến nhƣ là những estrogen thực vật, có hoạt tính chống oxy hóa. .. trên số tế bào theo CC .34 Đồ thị 8 Sự phụ thuộc nồng độ SSR trên số tế bào theo SRB 35 Đồ thị 9 Ảnh hƣởng của SSR lên đƣờng kính của dòng tế bào DLD-1 36 Đồ thị 10 Sự phụ thuộc thời gian vào số tế bào phát triển dƣới sự phơi nhiễm các chất RES, PTS, PI tƣơng ứng với hình (A), (B), (C) theo phƣơng pháp CC 38 Đồ thị 11 Sự phụ thuộc nồng độ của các chất phơi nhiễm RES, PTS và PI vào số tế bào. .. trans-resveratrol (RES), một hợp chất stilbene có nhiều trong quả nho, đậu phộng, đậu nành,… đã đƣợc nghiên cứu nhiều về hoạt tính sinh học Các công bố khoa học cho thấy RES có các hoạt tính nhƣ kháng viêm, chống oxy hóa, ức chế sinh trƣởng tế bào và các thuộc tính ngăn ngừa và bảo vệ tim mạch, Ngoài ra, RES cũng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn 4,13,16,20,26,30,36,37,39,46,47,48,49,58 Các hợp chất stilbene khác,... cơ thể, và những chất kháng oxy hóa có phân tử lƣợng thấp nhƣ glutathinon, vitamin E, vitamin C hoặc cũng có thể là những hợp chất có trong thực phẩm, rau quả nhƣ các hợp chất thuộc họ phenolic: flavonoid, stilbene, lignan, tannin 3,9 3 Giới thiệu phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào 3.1 Nuôi cấy tế bào Dòng tế bào ung thƣ ruột kết ngƣời DLD-1 đƣợc thu từ bộ sƣu tập tế bào American Type và đƣợc nuôi