TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI GIẢNG THỰC HÀNH HÓA SINH TS. Nguyễn Hoài Hương CN. Bùi Văn Thế Vinh Dùng cho sinh viên ngành Môi trường và Công nghệ Sinh học Năm xuất bản: 2009 2 MỤC LỤC Trang Giới thiệu môn học 4 Quy tắc làm việc trong phòng thí nghiệm Hóa sinh 5 1. An toàn khi làm việc với axit và kiềm 5 2. Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm 6 Bài 1 Cách pha chế các dung dịch dùng trong thí nghiệm Hóa sinh 8 I Lý thuyết 8 1. Dung dịch 8 2. Dung dịch đệm 14 II Thực hành 20 III Bài nộp 20 Bài 2 Định lượng đường khử bằng phương pháp Acid dinitro-salicylic (DNS) 21 I Lý thuyết 21 1. Định nghĩa 21 2. Nguyên tắc 21 3. Xử lý mẫu 21 II Thực hành 22 1. Dụng cụ - hóa chất 22 2. Tiến hành thí nghiệm 23 3. Tính kết quả 24 III Bài nộp 24 Bài 3 Định lượng Nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl 25 I Lý thuyết 25 1. Định nghĩa 25 3 2. Nguyên tắc 26 II Thực hành 26 1. Dụng cụ - hóa chất 26 2. Tiến hành thí nghiệm 27 3. Tính kết quả 28 III Bài nộp 28 Bài 4 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford 30 I Lý thuyết 30 1. Định nghĩa 30 2. Nguyên tắc 30 II Thực hành 31 1. Dụng cụ - hóa chất 31 2. Tiến hành thí nghiệm 31 3. Tính kết quả 32 III Bài nộp 32 Bài 5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 33 I Lý thuyết 33 1. Enzyme và đơn vị đo hoạt tính enzyme 33 2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 34 3. Enzyme amylase và phương pháp xác định hoạt tính 35 II Thực hành 36 1. Dụng cụ - hóa chất 36 2. Tiến hành thí nghiệm 36 3. Tính kết quả 38 III Bài nộp Tài liệu tham khảo 38 39 4 GIỚI THIỆU MÔN HỌC Bài giảng “Thực hành sinh hoá” dành cho sinh viên năm thứ hai khoa Môi trường & Công nghệ Sinh học, trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. Với thời lượng 30 tiết và tuỳ thuộc điều kiện, cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm cho phép, sinh viên tiến hành làm 5 bài thực hành gồm các nội dung chính của học phần lý thuyết hóa sinh cơ sở. 1. Giới thiệu phòng thí nghiệm hóa sinh, cách pha chế các dung dịch dung trong thí nghiệm hóa sinh ; 2. Định lượng đường khử bằng phương pháp acid dinitro-salicylic (DNS); 3. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl; 4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford; 5. Xác định hoạt tính enzyme amylase. 5 QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH I. An toàn khi làm việc với axit và kiềm 1. An toàn khi làm việc với axit: Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản ứng với các hơi axit tự do. Khi pha loãng, luôn phải cho axit vào nước trừ phi được dùng trực tiếp. Giữ để axit không bắn vào da hoặc mắt bằng cách đeo khẩu trang, găng tay và kính bảo vệ mắt. Nếu làm văng lên da, lập tức rửa ngay bằng một lượng nước lớn. Luôn phải đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúng. H 2 SO 4 : Luôn cho acid vào nước khi pha loãng, sử dụng khẩu trang và găng tay để tránh phòng khi văng acid Các acid dạng hơi (HCl) thao tác trong tủ hút và mang găng tay, kính bảo hộ. 2. An toàn khi làm việc với kiềm Kiềm có thể làm cháy da, mắt gây hại nghiêm trọng cho hệ hô hấp. Mang găng tay cao su, khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm đậm đặc. Thao tác trong tủ hút, mang mặt nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm. Amoniac: là một chất lỏng và khí rất ăn da, mang găng tay cao su, khẩu trang, thiết bị bảo vệ hệ thống hô hấp. Hơi amoniac dễ cháy, phản ứng mạnh với chất oxy hoá, halogen, axit mạnh. Amoni hydroxyt: chất lỏng ăn da, tạo hỗn hợp nỏ với nhiều kim loại nặng: Ag, Pb, Zn và muối của chúng. Kim loại Na, K, Li, Ca: phản ứng cực mạnh với nước, ẩm, CO 2 , halogen, axit mạnh, dẫn xuất clo của hydrocacbon. Tạo hơi ăn mòn khi cháy. Cần mang dụng cụ bảo vệ da mắt. Chỉ sử dụng cồn khô khi tạo dung dịch natri alcoholate, cho vào từ từ. Tránh tạo tinh thể cứng khi hoà tan. Tương tự khi hoà tan với nước, đồng thời phải làm lạnh nhanh. Oxit canxi rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước, cần bảo vệ da mắt, đường hô hấp do dễ nhiểm bụi oxit. 6 Natri và kali hydroxyt: rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước. Các biện pháp an toàn như trên, cho từng viên hoặc ít bột vào nước chứ không được làm ngược lại. II. Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm 1. Hoá chất thí nghiệm: Các hoá chất dùng để phân tích, làm tiêu bản, tiến hành phản ứng, trong phòng thí nghiệm được gọi là hóa chất thí nghiệm. Hoá chất có thể ở dạng rắn (Na, MgO, NaOH, KCl, (CH 3 COO) 2 ; lỏng (H 2 SO 4 , aceton, ethanon, chloroform, ) hoặc khí (Cl 2 , NH 3 , N 2 , C 2 H 2 ) và mức độ tinh khiết khác nhau: - Sạch kỹ thuật (P): độ sạch > 90% - Sạch phân tích (PA): độ sạch < 99% - Sạch hóa học (PC): độ sạch > 99% Hóa chất có độ tinh khiết khác nhau được sử dụng phù hợp theo những yêu cầu khác nhau và chỉ nên sử dụng hóa chất còn nhãn hiệu. 2. Nhãn hiệu hoá chất: Hóa chất được bảo quản trong chai lọ thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có nhãn ghi tên hoá chất, công thức hóa học, mức độ sạch, tạp chất, khối lượng tịnh, khối lượng phân tử, nơi sản xuất, điều kiện bảo quản. 3. Cách sử dụng và bảo quản hoá chất: Khi làm việc với hóa chất, nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết sức cẩn thận, tránh gây những tai nạn đáng tiếc cho mình và cho mọi người. Những điều cần nhớ khi sử dụng và bảo quản hóa chất được tóm tắt như sau: - Hóa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu ơ, vô cơ, muối, acid, bazơ, kim loại, ) hay theo một thứ tự a, b, c để khi cần dễ tìm. - Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi, phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chất trước khi dùng, dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu. - Chai lọ hóa chất phải có nắp. Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạch nắp, cổ chai, tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong chai. - Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trong chai lọ màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chổ tối. 7 - Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa ngay, không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất. - Khi làm việc với chất dễ nổ, dễ cháy không được để gần nơi dễ bắt lửa. Khi cần sử dụng các hóa chất dễ bốc hơi, có mùi, phải đưa vào tủ hút, chú ý đậy kín nắp sau khi lấy hóa chất xong. - Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ, không ngửi hay nếm thử hóa chất. - Khi làm việc với acid hay base mạnh: Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước khi pha loãng (không được đổ nước vào acid hay base); Không hút acid hay base bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riêng như ống bóp cao su. Trường hợp bị bỏng với acid hay base rửa ngay với nước lạnh rồi bôi lên vết bỏng NaHCO 3 1% (trường hợp bỏng acid) hoặc CH 3 COOH 1% (nếu bỏng base). Nếu bị bắn vào mắt, dội mạnh với nước lạnh hoặc NaCl 1%. Trường hợp bị hóa chất vào miệng hay dạ dày, nếu là acid phải súc miệng và uống nước lạnh có MgO, nếu là base phải súc miệng và uống nước lạnh có CH 3 COOH 1%. Lưu ý các kí hiệu cảnh báo nguy hiểm: 8 BÀI 1: CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH DÙNG TRONG THÍ NGHIỆM HÓA SINH I. Lý thuyết 1.1. Dung dịch Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau về mặt vật lý và hóa học. Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi. Nếu chất hòa tan ở dạng rắn thì gọi là chất tan, nếu là chất lỏng thì gọi là dung chất. Tùy theo tính chất của dung môi mà phân thành dung dịch nước và dung dịch khan. Phần lớn các dung dịch acid, base, muối trong phòng thí nghiệm là dung dịch nước, dùng dung môi là nước. Một số chất khác tan trong dung môi hữu cơ. Hàm lượng chất hòa tan trong dung dịch thể hiện ở nồng độ dung dịch. Có nhiều cách biểu thị nồng độ khác nhau. Mỗi cách sẽ tiện dụng trong chuẩn bị, phân tích và tính toán khác nhau. 1.1.1. Các đơn vị nồng độ dung dịch a) Nồng độ phần trăm, (%) i) Nồng độ phần trăm khối lượng - khối lượng, % (w/w): là số gam chất tan có trong 100g dung dịch. Ví dụ: dung dịch NH 4 Cl 5% (w/w) là trong 100g dung dịch có chứa 5g NH 4 Cl ii) Nồng độ % khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dung dịch. Ví dụ: dung dịch CuSO 4 10% (w/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10g CuSO 4 iii) Nồng độ phần trăm thể tích - thể tích, % (v/v): là số ml dung chất có trong 100ml dung dịch. Ví dụ: dung dịch glycerine 10% (v/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10ml glycerine. b) Nồng độ gam-lit, (g/L): là số gam chất tan có trong 1 lít dung dịch. c) Nồng độ phân tử gam hay nồng độ mol, (Mol/L) hay M: là số phân tử gam (hay số mol) chất tan trong 1 lít dung dịch. Ví dụ: Dung dịch KH 2 PO 4 M/15 là trong 1000ml dung dịch chứa M/15 phân tử gam KH 2 PO 4 . 9 d) Nồng độ đương lượng (N): là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1 lit dung dịch. Số đương lượng chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z) Hệ số đương lượng (z): phụ thuộc vào bản chất của chất đó và phản ứng mà chất đó tham gia. i) Nếu phản ứng là phản ứng acid, base: z là số ion H + hay OH - mà 1 phân tử, ion của chất đó tác dụng vừa đủ. Ví dụ: Phản ứng giữa HCl và NaOH H 2 SO 4 + 2 NaOH → Na 2 SO 4 + 2 H 2 O H 2 SO 4 → 2 H +  z = 2 NaOH → 1 OH -  z = 1 ii) Nếu phản ứng là phản ứng ôxy – hóa khử: z là số electron mà 1 phân tử, ion của chất đó cho hay nhận. Ví dụ: 2 Na 2 S 2 O 3 + I 2 → Na 2 S 4 O 6 + 2 NaI I + 1e → I -  z = 1 S 2+ - 1e → S +  z = 1 e) Nồng độ dung dịch bão hòa: là nồng độ dung dịch khi tối đa chất hòa tan có mặt trong dung dịch. f) Đơn vị nồng độ dùng trong các phép phân tích vi lượng : - Nồng độ mg/mL: số mg chất tan trong 1mL dung dịch - Miligam phần trăm, mg%: mg chất hòa tan trong 100g dung dịch. - Microgam phần trăm, µg%: là số µg chất hòa tan trong 100g dung dịch. - Phần nghìn, 0 / 00 : số g chất hòa tan trong 1000g dung dịch. - Phần triệu, ppm: số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lít dung dịch. - Phần tỷ, ppb: số µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch. 1.1.2. Cách pha dung dịch có nồng độ xác định a) Pha dung dịch có nồng độ phần trăm theo khối lượng, % (w/w) i) Chất tan là chất rắn khan: Ví dụ: Pha 500g dung dịch NaOH 40% (w/w) 100g dung dịch cần 40g NaOH 500g dung dịch cần X g? 10 Lượng NaOH cần để pha dung dịch : X= (40*500)/100= 200g Lượng nước cần thiết: 500-200=300g (hay 300ml) Vậy, cân 200g NaOH và đong 300 ml nước cất, hòa tan ta được 500g dung dịch NaOH 40% ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO 4 .5H 2 O; Na 2 HPO 4 . 12H 2 O; ) Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn. Ví dụ: Pha 320g dung dịch CuSO 4 10% (w/w) từ CuSO 4 .5H 2 O M(CuSO 4 ) = 160 và M(CuSO 4 .5H 2 O) = 250 Lượng CuSO 4 khan để pha dung dịch là: X = (10*320)/100 = 32g Lượng CuSO 4 .5H 2 O cần dùng: Y = (250*32)/160 = 50g Lượng nước cất thêm vào: 320 -50 = 270g (hay ml) Vậy, cân 50g CuSO 4 .5H 2 O, đong 270ml nước cất, hòa tan ta được 320g dung dịch CuSO 4 10%. b) Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn: Ví dụ: Pha 500g dung dịch NaOH 5% từ dung dịch NaOH 10% Lượng NaOH cần để pha dung dịch 5% là: X = (5*500)/100 = 25g Lượng dung dịch NaOH 10% cần dùng là: Y = (100*25)/10 = 250g Lượng nước cất thêm vào: 500-250 = 250g Vậy, đong 250ml nước cất và 250g dd NaOH 10%, hòa tan ta được 500g NaOH 5% c) Pha dung dịch bão hoà: Lấy chất tan cần pha vào becher, thêm một ít nước cất và khuấy cho tan. Nếu sau khi khuấy, chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dung dịch bão hòa. Nếu chất tan tan hết, thêm chất tan và tiếp tục khuấy, cứ như thế cho đến khi chất tan không còn tan được nữa. d) Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích i) Chất tan là chất rắn khan Cân lượng chất tan cần thiết, chuyển sang bình định mức, dùng nước cất hòa tan và định mức đến thể tích đúng. Ví dụ: Pha 1 lít dung dịch NaCL 5% (w/v) Lượng NaCl cần để pha dung dịch: X = (5*1000)/100 = 50g [...]... 3.2.1.3) xúc tác cho phản ứng th y phân liên kết 1,4- và 1,6-glycoside từ đầu khơng khử của chuỗi polysaccharide Sản phẩm chủ y u là glucose và dextrin Enzyme n y mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC Nhiều glucoamylase hoạt động mạnh ở pH 3,5-5,5 b ) C á c p hư ơ n g p h á p đ o h oạt tín h en zym e -a m ylase 35 N g u y ê n tắ c c h u n g dự a trê n c ơ sở th ủ y p h â n tin h b ộ t b ở i e n z y m e tro n... e n z y m e p h ả i b ị b ấ t h o ạ t ư ớ c k h i tiế p x ú c v ớ i c c hấ t tr ơ Hình 1 Động học phản ứng enzyme 1.3 E n zy m e a m y la se v à p h ư ơ n g p h áp xác đn h h oạt tín h ị a ) K h a i q u á t về en zy m e am ylase A m y la s e là c á c e n z y m e x ú c tá c c h o c á c p n ứ n g th ủ y p h â n tin h b ộ t, g ly c o g e n , ảh v à c á c p o ly s a c c h a rid e tư ơ n g ựt A m y la s... tuyệt đối cho vào bình Kjeldahl, cho tiếp 5ml H2SO4 đậm đặc sẽ th y xuất hiện màu nâu đen (do ngun liệu đã bị oxi hóa) Cho thêm vào 200mg chất xúc tác, lắc nhẹ, đ y kín để khoảng 3 phút Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun, đ y miệng bình bằng một phễu th y tinh Lưu ý giai đoạn n y phải thực hiện trong tủ Hotte, đặt bình hơi nghiêng trên bếp, tránh trường hợp khi sơi mạnh hóa chất bắn ra ngồi, khi đã sơi... trình đường chuẩn y = ax +b 3 Tính R2 = 4 Tính tóan kết quả thí nghiệm, chọn hệ số pha lõang nào? 32 BÀI 5 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME I Lý thuyết 1.1 Enzyme và đơn vị đo hoạt tính enzyme a) Định nghĩa Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cao Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định Hoạt động hay hoạt tính của enzyme càng mạnh... chất được chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn Vì v y có thể đánh giá hoạt tính xúc tác của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa cơ chất hoặc tốc độ tích l y sản phẩm phản ứng Về ngun tắc có thể hai nhóm phương pháp chính sau: - Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định... (Enzyme Unit, viết tắt U) do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB) định nghĩa: Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn 1 U = 1 mol sản phẩm = 1 mol cơ chất (10-6 mol)/phút ii) Katal: Năm 1979, Hội đồng Danh pháp của IUB khuyến cáo nên sử dụng Katal làm đơn vị cơ bản của hoạt tính enzyme... là phụ thuộc vào tỉ lệ phân ly của mạch nhánh thành ion, hay nói tóm lại là phụ thuộc vào pH mơi trường Dung dịch đệm là dung dịch có pH khơng thay đổi nhiều lắm khi một lượng nhỏ acid (H+) hoặc base (OH-) được thêm vào Như v y, dung dịch đệm bao gồm một cặp acid base liên hợp (acid y u và muối của acid y u n y hoặc base y u và muối của base n y) và tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH của dung dịch Việc... g iả m đ ộ n h ớ t m -a m y la s e bề n v ớ i n h iệ t, n h n g k é m bề n v ớ i a c id ư - -a m y la s e (Exo -1,4-glucanase; EC 3.2.1.2) có nhiều ở thực vật (hạt, củ), xúc tác cho phản ứng th y phân liên kết 1,4-glycoside từ đầu khơng khử tạo thành maltose và dextrin phân tử lớn Enzyme n y mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC, nhưng bền với acid hơn -a m y la s e - Glucoamylase (Exo -1,4-g lu c a... glucose chuẩn 10 mg/ ml (bảo quản tủ lạnh vài ng y) 2 Tiến hành a) Chiết xuất đường trong thực vật - 5g rau cải ngọt → nghiền nhỏ → cho vào becher 100ml + 10ml cồn 900 → đun cách th y (sơi 3 lần) → khu y đều bằng đũa th y tinh → để nguội → lọc (chỉ gạn l y phần trong) - Cho tiếp 10ml cồn 800 vào cốc đựng bã, khu y đều, đun sơi 2 lần trên nồi đun cách th y Để nguội → lọc (lặp lại 2 lần) - Đưa phần bã... các loại đệm có các khoảng đệm khác nhau thành 1 dung dịch là khơng có vấn đề gì Tuy nhiên sử dụng các đệm nào còn t y thuộc vào ứng dụng sao cho thành phần của đệm khơng phản ứng với các cấu tử trong hệ phản ứng khảo sát theo chiều hướng có hại Các phản ứng thường th y là phản ứng tạo kết tủa hay tạo phức hoặc oxy hóa khử Có dung dịch chứa hỗn hợp 1 acid y u (Ví dụ: acid acetic) với muối của nó (Ví . hoạt tính 35 II Thực hành 36 1. Dụng cụ - hóa chất 36 2. Tiến hành thí nghiệm 36 3. Tính kết quả 38 III Bài nộp Tài liệu tham khảo 38 39 4 GIỚI THIỆU MÔN HỌC Bài giảng Thực hành sinh hoá” dành cho sinh. HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI GIẢNG THỰC HÀNH HÓA SINH TS. Nguyễn Hoài Hương CN. Bùi Văn Thế Vinh Dùng cho sinh viên ngành Môi trường và Công nghệ Sinh học Năm xuất bản: 2009 2 MỤC. các nội dung chính của học phần lý thuyết hóa sinh cơ sở. 1. Giới thiệu phòng thí nghiệm hóa sinh, cách pha chế các dung dịch dung trong thí nghiệm hóa sinh ; 2. Định lượng đường khử bằng phương