ĐẠ I H TRƯ B LU KHẢ O SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯ Ợ GVHD: SVTH : Lớ p: I H ỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƯ ỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC B Ộ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LU ẬN VĂN TỐT NGHIỆP O SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN Ợ U VANG CHANH DÂY GVHD: PGS. TS. NGUYỄ N THÚY HƯƠNG SVTH : NGUYỄN XUÂN HỒNG THOA PHAN THỊ HỒNG THẮM p: HC06BSH TPHCM, 2010 CHÍ MINH O SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN CHANH DÂY N THÚY HƯƠNG MSSV: 60604393 MSSV: 60604381 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên chúng em tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp chúng em hoàn thành tốt luận văn này. Chúng em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thúy Hương – người đã tận tình theo sát, chỉ bảo, giúp đỡ, tạo cho chúng em sự say mê trong học tập và nghiên cứu. Ở cô, chúng em thấy được một người thầy hết lòng vì công việc và sự bao dung, quan tâm đến sinh viên. Cô ơi, chúng em cảm ơn cô! Sau này khi ra trường, chúng em sẽ nhớ cô lắm. Chúng em cũng xin cảm ơn các anh chị lớp cao học CH2008, CH2009 đã nhiệt tình giúp đỡ. Xin cảm ơn tất cả các thành viên của lớp HC06BSH, những người bạn đã đồng hành cùng chúng mình trong suốt những năm tháng đại học, đã quan tâm, chia sẽ, động viên, đặc biệt là luôn tạo một không khí vui vẻ để thời gian làm luận văn thật đáng nhớ, một thời sinh viên không thể nào quên. Chúng con xin cảm ơn gia đình đã luôn theo sát, ủng hộ, khích lệ và động viên trong suốt quãng đường mà chúng con đã đi. Cảm ơn các thành viên của nhóm Xù, Quỷ, Bờ ná na, Gec – ko, Tại, Thùy, những người bạn thân thiết nhất đã cùng nhau trải qua mọi niềm vui, nỗi buồn để đạt được kết quả như ngày hôm nay và cũng làm cho quãng đời sinh viên thật đáng nhớ. Chúng ta sẽ mãi như bây giờ nhé! Yêu mọi người rất nhiều! Cuối cùng, xin gửi những lời thân thương nhất đến tất cả những người đã sát cánh cùng chúng tôi trong thời gian qua. TP. Hồ Chí Minh, ĐHBK, tháng 01 năm 2011. Phan Thị Hồng Thắm Nguyễn Xuân Hồng Thoa. TÓM TẮT Chanh dây là một loại trái cây phổ biến, giàu chất dinh dưỡng và có mùi thơm rất đặc trưng, thích hợp để là nguyên liệu lên men rượu. Cellulose vi khuẩn – BC được biết đến là chất mang hiệu quả, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu quá trình lên men rượu vang chanh dây bằng tế bào men Saccharomyces cerevisiae tự do và cố định trên chất mang BC, kết quả thu được như sau: - Xác định được tỉ lệ giống nấm men Saccharomyces cerevisiae thích hợp bổ sung cho quá trình lên men rượu là 7%, pH = 4 là pH thích hợp lên men và nồng độ chất khô thích hợp là Brix 20, thời gian lên men rượu thích hợp đối với rượu chanh dây là 7 ngày. Độ cồn sau 7 ngày lên men đạt khoảng 10.59 o . - Cố định được tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae trên chất mang BC bằng hai phương pháp: bẫy – hấp phụ và nhốt chủ động. Sử dụng chế phẩm nấm men cố định trên BC có kích thước 2cm x 1cm, chế độ lắc 200 vòng/phút của phương pháp bẫy – hấp phụ sau 3 ngày ủ với mật độ là 14.48 x 10 8 CFU/cm 3 để tiến hành lên men. Kết quả thu được cho thấy khi sử dụng chế phẩm nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định trên chất mang BC để lên men rượu đối với rượu vang chanh dây thì hiệu quả lên men vẫn đảm bảo sau 7 lần tái sử dụng. - Sau khi tối ưu các điều kiện, tiến hành lên men rượu và tàng trữ. Chúng tôi tiến hành đánh giá cảm quan và nhận thấy: chất lượng cảm quan của rượu lên men sử dụng tế bào tự do và rượu lên men sử dụng chế phẩm cố định có mùi vị tương đối giống nhau mặc dù độ trong và màu sắc có khác nhau. Rượu sau quá trình lên men rượu có hương vị đặc trưng của rượu chanh dây, chưa hài hòa giữa vị chua và vị rượu do chứa một lượng acid malic có vị chua gắt làm giảm hương vị của rượu. Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương iii MỤC LỤC Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Danh mục đồ thị ix CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu về chanh dây 3 2.1.1 Nguồn gốc 3 2.1.2 Đặc điểm sinh học 3 2.1.3 Thành phần hóa học 4 2.1.4 Ứng dụng 5 2.2 Quá trình lên men rượu 6 2.2.1 Giới thiệu về rượu vang 6 2.2.2 Cơ sở hóa sinh 6 2.2.3 Tác nhân vi sinh vật 9 2.2.4 Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu 11 2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu 12 2.3 Kỹ thuật cố định 18 2.3.1 Lịch sử phát triển 18 2.3.2 Định nghĩa 19 2.3.3 Chất mang 19 2.3.4 Phương pháp cố định 23 2.3.5 Ưu nhược điểm của cố định tế bào 29 2.3.6 Yêu cầu đối với vi sinh vật cố định 30 2.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến cố định vi sinh vật 31 2.3.8 Chất mang cellulose vi khuẩn – BC 32 2.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài 44 Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương iv CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 49 3.1 Vật liệu 49 3.1.1 Chanh dây 49 3.1.2 Giống vi sinh vật 49 3.1.3 Môi trường nuôi cấy 49 3.1.4 Vật liệu, hóa chất 50 3.1.5 Thiết bị và dụng cụ 51 3.2 Phương pháp thí nghiệm 51 3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 51 3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 52 3.2.3 Phương pháp phân tích thí nghiệm 57 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 61 4.1 Khảo sát giống 61 4.1.1 Khảo sát giống S.cerevisiae 28 61 4.1.2 Khảo sát giống A.xylinum 64 4.2 Tạo chế phẩm BC 65 4.2.1 Lên men thu nhận BC 65 4.2.2 Xử lý chế phẩm BC thô 65 4.2.3 Khảo sát phương pháp cố định 66 4.3 Lên men rượu sử dụng tế bào tự do 73 4.3.1 Tối ưu điều kiện lên men rượu 73 4.3.2 Kiểm tra các biến động trong quá trình lên men rượu ở điều kiện tối ưu 76 4.4 Lên men rượu sử dụng chế phẩm cố định BC 82 4.4.1 Khảo sát hiệu quả lên men qua các lần tái sử dụng 82 4.4.2 Kiểm tra tỷ lệ rửa trôi 85 4.5 So sánh lên men rượu tự do với lên men rượu cố định 86 4.6 Kết quả cảm quan 87 Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương v 4.7 Kết quả kiểm tra vi sinh 87 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 88 5.1 Kết luận 88 5.2 Kiến nghị 88 Tài liệu tham khảo 90 PHỤ LỤC 94 Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương vi Danh mục bảng Bảng 2. 1 Thành phần dinh dưỡng trong 100g "thịt quả" 5 Bảng 2. 2 Tỷ lệ đường trong chanh dây 5 Bảng 2. 3 Hàm lượng acid có trong chanh dây 5 Bảng 2. 4 Khả năng chịu được hàm lượng cồn trong môi trường của một số nấm men 16 Bảng 2. 5 Ưu nhược điểm của từng loại chất mang 23 Bảng 2. 6 Bảng so sánh ưu nhược điểm của các phương pháp cố định tế bào thông dụng 29 Bảng 2. 7 Cấu trúc BC của một số loài vi sinh vật 33 Bảng 2. 8 So sánh một số tính chất của việc lên men sử dụng nấm men cố định trên gel alginate và nấm men cố định trên BC 44 Bảng 2. 9 Thành phần hóa học của rượu lên men từ các chủng nấm men khác nhau 47 Bảng 3. 1 Thành phần môi trường Hansen 49 Bảng 3. 2 Thành phần môi trường giữ giống (MT3) 50 Bảng 3. 3 Môi trường nhân giống (MT4) 50 Bảng 4. 1 Kết quả lập đường chuẩn của nấm men S.cerevisiae 62 Bảng 4. 2 Kết quả cố định bằng phương pháp nhốt 67 Bảng 4. 3 Mật độ tế bào nấm men cố định trên BC 68 Bảng 4. 4 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến mật độ tế bào cố định trên BC 70 Bảng 4. 5 So sánh 2 phương pháp cố định 72 Bảng 4. 6 Kết quả đo độ cồn 77 Bảng 4. 7 Kết quả đo Brix 78 Bảng 4. 8 Kết quả đo pH 79 Bảng 4. 9 Kết quả đo độ chua 80 Bảng 4. 10 Một số thông số quá trình lên men rượu qua các lần tái sử dụng chế phẩm cố định 82 Bảng 4. 11 Kết quả tỷ lệ rửa trôi 86 Bảng 4. 12 So sánh các biến động trong quá trình lên men ở điều kiện tối ưu của lên men rượu sử dụng chế phẩm tự do và chế phẩm cố định trên BC 86 Bảng 4. 13 Kết quả kiểm tra vi sinh 87 Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương vii Danh mục hình Hình 2. 1 Chanh dây . 4 Hình 2. 2 Cơ sở hóa sinh quá trình lên men ethanol. 7 Hình 2. 3 Nấm men S. cerevisiae 10 Hình 2. 4 Phân loại chất mang. 20 Hình 2. 5 Phương pháp cố định vi sinh vật 23 Hình 2. 6 Cố định tế bào trên bề mặt chất mang. 24 Hình 2. 7 Cố định tế bào trong lòng chất mang 25 Hình 2. 8 Liên kết giữa các tế bào 26 Hình 2. 9 Cố định tế bào bằng màng membrane. 26 Hình 2. 10 Acetobacter xylinum 33 Hình 2. 11 Cấu trúc A – BC tạo ra từ môi trường lắc (a), S – BC tạo ra từ môi trường tĩnh (b). 36 Hình 2. 12 Cấu trúc BC (a) và PC (b) (x 200) 37 Hình 2. 13 Vị trí – quá trình biến dưỡng carbon và tổng hợp cellulose ở A. xylinum 40 Hình 2. 14 Con đường dự đoán của quá trình sinh tổng hợp và tiết ra cellulose khi glucose được tế bào A. xylinum hấp thụ từ bên ngoài 40 Hình 2. 15 Sự tổng hợp vi sợi bởi Acetobacter xylinum. 41 Hình 2. 16 Con đường chuyển hóa carbon của Acetobacter xylinum. 42 Hình 2. 17 Hàm lượng acid hữu cơ từ dịch chanh dây sử dụng. 46 Hình 2. 18 Nồng độ các chất trung gian tạo ra trong rượu lên men từ 3 chủng nấm men . 47 Hình 2. 19 Nồng độ acetate và ester ethyl trong rượu lên men từ 3 chủng nấm men 48 Hình 3. 1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 51 Hình 3. 2 Sơ đồ thu nhận BC 53 Hình 3. 3 Sơ đồ xử lý BC thô 53 Hình 3. 4 Sơ đồ xác định số tế bào sống bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 58 Hình 3. 5 Sơ đồ phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu 59 Hình 4. 1 Hình ảnh đại thể S. cerevisiae trên môi trường đặc 61 Hình 4. 2 Hình ảnh vi thể của S.cerevisiae qua kính hiển vi 62 Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương viii Hình 4. 3 Hình ảnh đại thể của A. xylinum trên môi trường đặc 64 Hình 4. 4 Khả năng lên men tạo BC của A. xylinum trong môi trường lỏng ở chế độ tĩnh 64 Hình 4. 5 Hình ảnh qua kính hiển vi (x100) của A.xylinum 65 Hình 4. 6 BC tươi sau khi lên men 65 Hình 4. 7 BC sau khi xử lý và cắt thành các kích thước khác nhau 66 Hình 4. 8 BC trước (a) và sau khi xử lý (b) 66 Hình 4. 9 BC sau khi cố định bằng phương pháp nhốt 67 Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương ix Danh mục đồ thị Đồ thị 4. 1 Đường chuẩn nấm men S.cerevisiae 63 Đồ thị 4. 2 Đường cong sinh trưởng của nấm men S.cerevisiae 63 Đồ thị 4. 3 Mật độ tế bào nấm men cố định trên BC với các kích thước và chế độ khuấy đảo khác nhau 69 Đồ thị 4. 4 Mật độ tế bào cố định trên BC theo ngày ủ 71 Đồ thị 4. 5 Khảo sát pH cho quá trình lên men 73 Đồ thị 4. 6 Khảo sát thời gian lên men tối ưu cho quá trình lên men 74 Đồ thị 4. 7 Khảo sát tỷ lệ giống thích hợp cho quá trình lên men 75 Đồ thị 4. 8 Khảo sát nồng độ chất khô thích hợp cho quá trình lên men 76 Đồ thị 4. 9 Độ cồn theo ngày lên men 77 Đồ thị 4. 10 Brix theo ngày lên men 78 Đồ thị 4. 11 pH theo ngày lên men 79 Đồ thị 4. 12 Độ chua theo ngày lên men 80 Đồ thị 4. 13 Các biến động trong quá trình lên men ở các điều kiện tối ưu 81 Đồ thị 4. 14 So sánh Brix giữa lên men đối chứng (ĐC) và qua các lần tái sử dụng chế phẩm 83 Đồ thị 4. 15 So sánh pH giữa lên men mẫu đối chứng (ĐC) và qua các lần tái sử dụng chế phẩm 83 Đồ thị 4. 16 So sánh V NaOH giữa lên men mẫu đối chứng (ĐC) và qua các lần tái sử dụng chế phẩm 84 Đồ thị 4. 17 So sánh độ cồn giữa mẫu lên men đối chứng (ĐC) và qua các lần tái sử dụng chế phẩm cố định 84 [...]... lượng sản phẩm rượu vang Thời gian lên men phụ thuộc nhiều yếu tố: nhiệt độ lên men, nồng độ đường, chủng nấm men Thời gian lên men bắt đầu từ khi cấy chủng nấm men vào môi trường lên men, qua các giai đoạn sinh sản, phát triển, bắt đầu lên men, lên men mạnh, lên men yếu Người ta chưa xác định rõ khi nào là lên men kết thúc Người ta thường xác định điểm kết thúc lên men bằng cách nếm không khí cảm thấy... enzyme, vitamin Hàm lượng đường của rượu biến đổi từ 4.5% đến 16% Rượu vang đỏ thường được lên men từ nước ép và vỏ quả nho, còn rượu vang trắng được lên men chỉ từ nước nho Rượu vang được lên men không qua chưng cất, nồng độ rượu dao động từ 10 – 15o Trên thế giới, nhất là ở các nước Châu Âu, rượu vang đã có từ lâu đời và được dùng rất phổ biến Nhưng ở nước ta, sản phẩm rượu vang vẫn chưa được quan tâm nhiều,... với nội dung là Khảo sát quá trình lên men rượu vang từ quả chanh dây sử dụng nấm men tự do và chế phẩm nấm men cố định trên chất mang Cellulose vi khuẩn” 2 Chương 2: Tổng quan tài liệu GVHD: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về chanh dây 2.1.1 Nguồn gốc Có khoảng 400 loại chanh dây được trồng ở các nước nhiệt đới, nhưng chỉ có 30 loại ăn được Chanh dây là loại trái... nấm men trong lên men rượu vang thuộc giống Saccharomyces Chúng là nhóm vi sinh vật kỵ khí tùy tiện Trong quá trình lên men giai đoạn đầu yêu cầu oxy cao nhất để nấm men sinh sản, phát triển tăng sinh khối Nếu có giai đoạn nhân giống thì cũng cần phải cung cấp oxy bằng cách lắc hoặc sục khí Độ thoáng khí của môi trường ngược lại rất bất lợi cho quá trình lên men rượu, khi bắt đầu sang giai đoạn lên men, ... thích cho sự phát triển và lên men rượu của nấm men không cố định mà phụ thuộc nhiều yếu tố, cụ thể những yếu tố chính sau:  Loài, chủng nấm men  Thành phần của môi trường lên men  Điều kiện lên men (nhiệt độ) Đối với các loại nấm men rượu vang, pH tối thích của chúng khoảng từ 4 – 5, của nấm men bia 6.0, của nấm men rượu là 4 – 4.5, của đa số các loài nấm men là 3.5 Nấm men có khả năng phát triển... Chanh dây cũng là một loại quả giàu chất xơ, giúp ngăn ngừa các bệnh về tim mạch Ngoài ra, chanh dây còn có tác dụng an thần, gây ngủ nhẹ, giảm sự lo âu hồi hộp, hạ huyết áp, giảm cơn đau bụng cơ năng và đau bụng kinh [41] 5 Chương 2: Tổng quan tài liệu GVHD: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương 2.2 Quá trình lên men rượu 2.2.1 Giới thiệu về rượu vang Rượu vang là loại đồ uống có cồn, tạo ra từ quá trình lên men. .. phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu Trong quá trình lên men, ngoài sản phẩm chính là rượu và CO2 thì còn tạo ra nhiều sản phẩm phụ khác Bằng cách phân tích sắc kí khí, các nhà phân tích đã phát hiện trên 50 chất khác nhau, nhưng có thể xếp thành 4 nhóm chính: acid, este, aldehyde, rượu cao phân tử 2.2.4.1 Sự tạo thành acid Trong quá trình lên men rượu luôn tạo ra các acid hữu cơ... lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều ester, aldehyl và tổn thất rượu theo CO2 tăng Nhiệt độ lên men cao nhất là 39oC và thấp nhất là 4 – 6 oC Nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất rượu vang đã xác định được khoảng nhiệt độ lên men rượu vang trắng thích hợp là 15 – 30 oC, nếu lên men ở những thang độ thấp hơn thì càng tốt Còn lên men rượu vang đỏ (nước quả lẫn với xác vỏ) phải chiết xuất các chất thơm... xuất rượu vang phát triển, để đáp ứng đủ nhu cầu tiêu thụ và tăng tính đa dạng của rượu vang, ở các nước trên thế giới còn sử dụng nhiều loại trái cây như: táo, đào, dâu, cam, mận, chuối… để sản xuất rượu vang Chanh dây được biết đến là một loại trái cây có mùi thơm đặc biệt, chứa nhiều chất dinh dưỡng và cũng là một đối tượng đáng chú ý để sử dụng làm nguyên liệu lên men rượu Sản phẩm rượu vang lên men. .. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU Rượu vang là thức uống có cồn phổ biến được thu từ quá trình lên men dịch nho Khác với các loại rượu cao độ khác, rượu vang là một trong những loại rượu nhẹ, có thể nói là một thức uống bổ dưỡng, ngoài hàm lượng vitamin tương đối đầy đủ, hàm lượng khoáng khá cao, rượu vang còn chứa đường khử là loại đường dễ hấp thu Các kết quả phân tích về thành phần dinh dưỡng của vang như: acid amin, . Lipid Hàm lượng 4-1 7 mg 3 5-6 4 mg 0. 4-2 .1 mg 70 0-2 410 IU 3 0-7 0 mg 0. 6-0 .8 g 1. 2-2 .4 g 8. 5-1 0 g 0. 2-0 .3 g [38]. Bảng 2. 2 Tỷ lệ đường trong chanh dây Loại chanh dây Thành phần. phẩm rượu vang lên men từ chanh dây góp phần đa dạng hóa các sản phẩm thức uống hiện nay. Việc lên men rượu vang (lên men chính) được thực hiện bằng cách bổ sung thêm giống nấm men vào nước. cho quá trình lên men 76 Đồ thị 4. 9 Độ cồn theo ngày lên men 77 Đồ thị 4. 10 Brix theo ngày lên men 78 Đồ thị 4. 11 pH theo ngày lên men 79 Đồ thị 4. 12 Độ chua theo ngày lên men 80 Đồ thị