TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TPHCM KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM CELLULASE ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL TỪ BÃ MÍA SVTH : KIỀU NGỌC ANH MSSV : 60600048 CBHD: TS. LÊ ĐỨC TRUNG KS. LÊ THỊ QUỲNH TRÂM TP. HỒ CHÍ MINH, 1/2011 Trang i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất tận tình của: Tiến Sĩ Lê Đức Trung – Viện Tài Nguyên Môi Trường, thuộc Đại Học Quốc Gia TPHCM – đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình về hướng đi cũng như các vấn đề có liên quan đến đề tài và hỗ trợ kinh phí để tôi có thể làm tốt luận văn này. Kỹ sư Lê Thị Quỳnh Trâm – Viện Tài Nguyên Môi Trường, thuộc Đại Học Quốc Gia TPHCM – đã hướng dẫn tận tình và luôn động viên tinh thần tôi trong suốt thời gian làm việc. PGS.TS Nguyễn Thúy Hương – Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa Tp HCM – đã hướng dẫn tận tình về các vấn đề có liên quan và tặng giống vi sinh vật dùng trong đề tài. TS. Lê Phi Nga – Bộ môn Hóa Sinh, Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp HCM – đã nhiệt tình hướng dẫn và góp ý, chia sẻ những nội dung liên quan đến đề tài. TS. Lê Thị Thủy Tiên và cán bộ các phòng thí nghiệm 102, 108, 117 – Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa Tp HCM – đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể sử dụng các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm. Cha mẹ, anh chị em tôi đã luôn bên cạnh và hỗ trợ tôi về vật chất và tinh thần khi cần thiết, giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này. Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Đại học Bách Khoa Tp HCM – đã cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc. Xin gởi đến những người kể trên lời cảm ơn chân thành nhất và sâu sắc nhất! Sinh viên thực hiện Kiều Ngọc Anh Trang ii TÓM TẮT Enzyme cellulase được sản xuất từ hai chủng Trichodema reesei và Aspergillus niger bằng phương pháp lên men bán rắn trên cơ chất cám gạo và các loại bã mía chưa tiền xử lý, tiền xử lý với NaOH 0.1 M, nhiệt độ phòng, 12h và tiền xử lý với NaOH 2%, 90 0 C, 1.5h. Hoạt tính cellulase cao nhất đạt được 16.28 UI/g đối với T. reesei và 23.45 UI/g với A. niger trên cơ chất cảm ứng là bã mía tiền xử lý với NaOH 2%, 90 0 C, 1.5h. Bã mía tiền xử lý với NaOH 2%, 90 0 C, 1.5h cũng cho hiệu suất thủy phân cao nhất khi thủy phân với Cellusoft L 5% (v/v), do đó được chọn làm nguyên liệu cho các quá trình thủy phân. Các chế phẩm cellulase phối trộn dạng lỏng thô, rắn qua quá trình sấy và hỗn hợp thu được sau lên men được tạo ra. Tiến hành thủy phân bã mía bằng hệ cellulase phối trộn thu được từ hai chủng T.reesei và A.niger tạo hàm lượng đường khử cao hơn 1.5 - 4 lần so với thủy phân bằng hệ cellulase riêng rẽ thu được từ mỗi chủng. Điều này cho thấy tác động tương hỗ giữa hai hệ cellulase từ T.reesei và A.niger . Thủy phân bã mía bằng chế phẩm cellulase phối trộn dạng lỏng thô và hỗn hợp sau lên men cho kết quả thủy phân cao hơn dạng rắn qua quá trình sấy. Tiến hành thủy phân bã mía bằng cellulase dạng lỏng thô, tỉ lệ phối trộn T. reesei/ A. niger 4/6, hàm lượng cellulase 3UI CMCase/g, 5% bã, 50 0 C, pH 4.8 trong 72 giờ, tạo được 19.19 g/l đường khử, trong đó có 10.57 g/l glucose, đạt hiệu suất thủy phân 43.02% . Kết quả này còn khá thấp so với 34.32g/l đường khử và 25.46 g/l glucose khi thủy phân bằng Cellusoft L 5% (v/v) và chưa đủ để lên men tạo ethanol hiệu quả. Tuy nhiên, nếu được tiếp tục cải thiện về giống, điều kiện nuôi cấy… đây sẽ là một hướng đi tiềm năng có thể thay thế được các chế phẩm cellulase thương mại mắc tiền dùng trong sản xuất bioethanol từ bã mía. Trang iii ABSTRACT Crude unprocessed cellulase was produced by solid state fermentation of Trichoderma reesei and Aspergillus niger on rice bran and three types of sugarcane bagasse: non pretreated, pretreated with NaOH 0.1M, room temperature, 12h and pretreated with NaOH 2%, 90 0 C, 1.5h . The highest cellulase activities by T.reesei and by A.niger with bagasse treated with NaOH 2%, 90 0 C, 1.5 h as inducing substrate were: 16.28 UI/g and 23.45 UI/g, respectively. Some types of cellulase preparations were created, which were crude unprocessed cellulase extract, dried-culture and culture after fermentation. The hydrolytic effectiveness of T.reesei –A.niger cellulase blends on bagasse treated with NaOH 2%, 90 0 C, 1.5 h was superior to the use of unblended T. reesei or A. niger enzymes, the reducing sugar concentration increased 1.5- 4 fold. This suggested that T. reesei–A. niger blends were enhanced synergistically. Crude unprocessed cellulase extract and culture after fermentation were more effective hydolysis yield than dried-culture. Crude unprocessed cellulase extract hydolysis bagasse treated with NaOH 2%, 90 0 C, 1.5 h resulted in 19.19 g reducing sugar/L, 10.57gglucose/L, hydrolysis yield 43.02 % after 72h under corresponding conditions (T.reesei/ A.niger 4/6, 3 UI CMCase/g bagasse, 5% bagasse, 150 rpm, 50 0 C, pH 4.8). The hydrolysate contained lower reducing sugar and glucose concentration compared with 34.32 g/l reducing sugar and 25.46 g glucose/L using Cellusoft 5% (v/v) in the same hydrolysis experiments and not suitable for subsequent fermentation process. However, if further improvements in higher-cellulase species, cultured conditions…the simplified of cellulase production using solid-state fermentation proved its potential to be used on-site as part of a cellulase to ethanol conversion process, in lieu of expensive commercial enzyme preparations. Trang iv KÍ HIỆU VIẾT TẮT − TXL : Tiền xử lý − TT : Thứ tự − BM : Bã mía − CG : Cám gạo − CMC : Carboxymethyl cellulose − DNS : acid 3, 5_ Dinitrosalicylic − CP : Chế phẩm − CP1 : Chế phẩm cellulase dạng lỏng thô − CP2 : Chế phẩm cellulase dạng rắn qua quá trình sấy − CP3 : Chế phẩm hỗn hợp thu được sau nuôi cấy − CP A : Chế phẩm cellulase từ Aspergillus niger − CP T : Chế phẩm cellulase từ Trichoderma reesei − AFEX : Ammonia Fiber Explosion_ Nổ hơi ammonia Trang v MỤC LỤC TÓM TẮT ii KÍ HIỆU VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ix CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Giới thiệu chung về bioethanol và enzyme trong sản xuất bioethanol từ biomass 4 2.1.1. Bioethanol và sản xuất bioethanol từ lignocellulose 4 2.1.2. Enzyme là vấn đề mấu chốt trong sản xuất bioethanol từ lignocellulose 5 2.1.3. Một số công trình nghiên cứu về enzyme cellulase ứng dụng trong sản xuất bioethanol. 8 2.2. Giới thiệu chung về nguồn nguyên liệu bã mía 10 2.2.1. Giới thiệu chung về cây mía và bã mía 10 2.2.2. Các thành phần chủ yếu trong bã mía. 11 2.2.3. Các phương pháp tiền xử lý bã mía 16 2.3. Enzyme cellulase 20 2.3.1. Phân loại. 20 2.3.2. Cấu trúc và tính chất enzyme cellulase 21 2.3.3. Cơ chế tác động của enzyme cellulase lên cellulose. 22 2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân. 24 2.4. Sản xuất chế phẩm cellulase 27 2.4.1. Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase 27 2.4.2. Phương pháp lên men bán rắn thu nhận chế phẩm enzyme. 30 2.4.3. Cơ chất cảm ứng nấm sợi sinh tổng hợp cellulase. 32 2.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của nấm sợi trên môi trường bán rắn 33 2.4.5. Chế phẩm cellulase 36 Trang vi CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 40 3.1. Vật liệu 40 3.1.1. Bã mía 40 3.1.2. Giống vi sinh vật 40 3.1.3. Cơ chất dùng trong lên men bán rắn 40 3.1.4. Enzyme thương mại 42 3.2. Nội dung tổng quát 43 3.2.1. Sơ đồ nội dung tổng quát 43 3.2.2. Các phương pháp nghiên cứu 43 3.2.2.1. Phương pháp tiền xử lý bã mía 43 3.2.2.2. Quan sát hình thái giống 44 3.2.2.3. Phương pháp tuyển chọn giống T. reesei có hoạt tính cao 44 3.2.2.4. Phương pháp khảo sát lên men bán rắn sinh tổng hợp cellulase 45 3.2.2.5. Phương pháp thu nhận các loại chế phẩm cellulase 46 3.2.2.6. Phương pháp khảo sát quá trình thủy phân bã mía 47 3.3. Bố trí thí nghiệm 47 3.3.1. Khảo sát quá trình lên men bán rắn sinh tổng hợp cellulase 47 3.3.2. Khảo sát quá trình thủy phân bã mía 50 3.3.3. Khảo sát độ ổn định của enzyme 52 3.4. Phương pháp phân tích 52 3.4.1. Phương pháp xác định hoạt tính CMCase 52 3.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử bằng DNS 54 3.4.3. Phương pháp xác định các thành phần trong bã mía trong bã mía 55 3.2. Phương pháp xử lý số liệu 60 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 61 4.1. Khảo sát ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý đến thành phần và cấu trúc bã mía 61 4.2. Quan sát đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc 65 4.3. Tuyển chọn giống T.reesei có hoạt tính cellulase cao 68 Trang vii 4.4. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy thích hợp với khả năng sinh tổng hợp cellulase trên môi trường bán rắn 68 4.4.1. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp cellulase theo thời gian ứng với các loại bã mía tiền xử lý khác nhau 68 4.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất 71 4.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm 72 4.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ giống 73 4.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng nitrogen 74 4.5. Khảo sát quá trình thủy phân bã mía bằng các loại chế phẩm thu nhận được75 4.5.1. Khảo sát nguồn nguyên liệu thủy phân 75 4.5.2. Enzyme thương mại (Cellusoft L) 77 4.5.3. Chế phẩm cellulase dạng lỏng thô (CP1) 79 4.5.3.1. Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ phối trộn đến hoạt tính CMCase 79 4.5.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn 80 4.5.3.3. Khảo sát hàm lượng chế phẩm enzyme/ bã 82 4.5.4. Chế phẩm enzyme dạng bán rắn sấy khô (CP2) 84 4.5.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn 84 4.5.4.2. Khảo sát hàm lượng chế phẩm enzyme/ bã 85 4.5.5. Chế phẩm dạng bã rắn tươi (CP3) 86 4.5.5.1. Khảo sát tỉ lệ phối trộn thích hợp 87 4.5.5.2. Khảo sát tỉ lệ chế phẩm enzyme/ bã 88 4.5.6. Nhận định, đánh giá tiềm năng của các loại chế phẩm 90 4.5.7. Độ ổn định của cellulase thu được 93 CHƯƠNG 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 95 5.1. Kết luận 95 5.2. Đề nghị 96 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 99 PHỤ LỤC 102 Trang viii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 : Thành phần hoá học của cám mì 41 Bảng 3.2 : Thành phần các khoáng chất, vitamin của cám gạo 41 Bảng 3.3 : Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của loại bã mía cảm ứng và thời gian lên men 48 Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất 49 Bảng 3.5 : Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường lên men 49 Bảng 3.6 : Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ giống 49 Bảng 3.7 : Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng nitrogen 50 Bảng 3.8: Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn glucose 53 Bảng 3.9 : Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn glucose (DNS) 55 Bảng 3.10: Thành phần NDS. 56 Bảng 4.1: Đường kính phân giải của enzyme thu từ các chủng T.reesei A, B, C 68 Bảng 4.2 : So sánh hiệu quả thủy phân bã mía tạo đường của ba loại chế phẩm 91 Bảng 5.1 : Kết quả khảo sát các điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh tổng hợp cellulase trên môi trường bán rắn. 95 Trang ix DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Sơ đồ sản xuất bioethanol từ biomass . 6 Hình 2.2 : Cây mía 10 Hình 2.3 : Bã mía và bãi thải bã mía ở công ty mía đường NIVL (Long An). 10 Hình 2.4 : Cấu trúc của lignocelluloses. 11 Hình 2.5 : Mối quan hệ cellulose – hemicellulose - lignin trong cấu trúc lignocellulose . 12 Hình 2.6 : Cấu trúc của cellulose 12 Hình 2.7 : Kiểu Fringed fibrillar và kiểu Folding chain 13 Hình 2.8 : Cấu tạo hóa học của đại diện hemicellulose. 14 Hình 2.9: Ba tiền chất phenyl – propane của lignin 15 Hình 2.10: Cấu trúc lignocellulose trước và sau khi tiền xử lý. 16 Hình 2.11: Các amino acid liên kết CD và CBD 21 Hình 2.12: Quá trình tác động exo-glucanase lên đầu vùng kết tinh của cellulose. 23 Hình 2.13: Cơ chế thủy phân cellulose của enzyme cellulase. 24 Hình 2.14 : Ảnh hưởng của nồng độ enzyme. 26 Hình 2.15: Nâm sợi Trichoderma reesei 29 Hình 2.16: Nấm sợi Aspergillus niger 30 Hình 3.1 : Sơ đồ nội dung thí nghiệm 43 Hình 3.2: CP1 (lỏng) và CP2 (sấy) với hai chủng tương ứng A. niger và T. reesei. 47 Hình 3.3 :- Bộ dụng cụ soxhlet 58 Hình 3.4: - Hệ thống phân tích NDS và ADS…………………………………… …65 Hình 4.1: Phân tích thành phần bã mía trước khi tiền xử lý 61 Hình 4.2: Thành phần bã mía trước tiền xử lý theo nghiên cứu của Binod Parameswaran và cộng sự (2009). 61 Hình 4.3: Phân tích thành phần bã mía sau tiền xử lý 63 Hình 4.4 : Cấu trúc và màu sắc của bã mía chưa tiền xử lý, bã mía xử lý ở nhiệt độ phòng, 12 giờ và xử lý ở 90 0 C, 1.5 giờ (từ trái qua) 65 Hình 4.5 : Bã mía tiền xử lý ở 90 0 C, 1.5 giờ. 65 Hình 4.6: Khuẩn ty T. reesei và A. niger phát triển trên môi trường PGA 66 [...]... để sản xuất nhiên liệu sinh học trong tương lai Vì thế , vấn đề nghiên cứu tạo các chế phẩm cellulase ứng dụng trong sản xuất bioethanol từ lignocellulose là vấn đề hết sức cần thiết mang tính đi tắt đón đầu Do vậy, em đã chọn thực hiện đề tài “ Bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm cellulase ứng dụng trong sản xuất bioethanol từ bã mía Qua đó, đề tài cung cấp thêm những cơ sở dữ liệu về tạo chế phẩm cellulase. .. tổng chi phí trong công nghệ sản xuất bioethanol từ lignocellulose Do đó việc nghiên cứu giảm giá thành của enzyme cellulase là một vấn đề mấu chốt trong việc ứng dụng enzyme cellulase vào công nghiệp sản xuất bioethanol từ lignocellulose Vấn đề nghiên cứu giảm giá thành enzyme cellulase hiện nay tập trung vào các hướng như: − Tăng hiệu suất sinh enzyme cellulase trong sản xuất enzyme cellulase thương... vi sinh vật ) − Sản xuất enzyme cellulase với các nguồn cơ chất rẻ tiền − Sản xuất enzyme cellulase có độ ổn định cao, có thể tái sử dụng được − Sản xuất enzyme cellulase có hoạt tính cao bằng phương pháp lên men bán rắn − Sản xuất chế phẩm cellulase thô nhằm giảm chi phí khâu tinh chế enzyme Với việc ứng dụng vào công nghệ sản xuất bioethanol từ lignocellulose, thị trường về enzyme cellulase dự kiến... 2: Tổng quan tài liệu 2.1.3 Một số công trình nghiên cứu về enzyme cellulase ứng dụng trong sản xuất bioethanol Ở các nước đang phát triển như Việt Nam, việc nghiên cứu sản xuất enzyme cellulase theo các hướng sử dụng cơ chất rẻ tiền, sản xuất enzyme cellulase có hoạt tính cao bằng phương pháp lên men bán rắn, và sản xuất chế phẩm cellulase thô được đánh giá là thích hợp nhất về mặt kinh tế và công... thực phẩm Bã mía là một loại phế phẩm thu được trong công nghiệp sản xuất đường từ cây mía Mía cây sau khi tách hết nước mía bằng các qui trình nghiền/ép và rửa, mía trở thành bã, một loại vật liệu có chứa nhiều thành phần cellulose [33, 41] Hình 2.3 : Bã mía và bãi thải bã mía ở công ty mía đường NIVL (Long An) Mía là một loại cây trồng có khả năng chuyển hóa năng lượng mặt trời rất cao, minh chứng... chuyển giao công nghệ sang một số nước như Trung Quốc (sản xuất ethanol từ lõi bắp, 2006), Tây Ban Nha (sản xuất ethanol từ thân lúa mì, 2007), Louisiana (sản xuất ethanol từ bã mía, 2007) Hiện nay, nhiều công ty và tổ chức năng lượng đang nghiên cứu để hoàn thiện hơn nữa công nghệ sản xuất bioethanol từ lignocellulose (Service, 2007) Các hướng nghiên cứu tập trung vào kỹ thuật enzyme, kỹ thuật di truyền... Bách Khoa TPHCM) nghiên cứu về tạo chế phẩm cellulase từ T viride trên môi trường có thành phần 75% cám gạo, 18% trấu, 6% carot, 1% (NH4)2SO4 ; độ ẩm 58-60%, nhiệt độ 36-400C, pH 5, 8% giống, lên men trong 4 ngày thu được chế phẩm có hoạt tính cellulase 4 UI/gCT [11] Trang 9 Chương 2: Tổng quan tài liệu Qua đó cho thấy, vấn đề nghiên cứu tạo chế phẩm cellulase phục vụ cho sản xuất bioethanol là một vấn... của cellulase trong công nghệ sản xuất bioethanol từ lignocellulose, đòi hỏi phải có bước cải tiến những chế phẩm enzyme cellulase về các mặt như : khả năng xúc tác hiệu quả trên nguồn cơ chất cellulose không tan, ổn định ở nhiệt độ cao và pH thích hợp, ít bị ức chế bởi sản phẩm cuối… Hiện nay, công ty Genencor International and Novozymes Biotech đã công bố công nghệ sản xuất cellulase ứng dụng trong. .. lý bã mía dùng làm cơ chất cảm ứng trong lên men bán rắn và làm nguyên liệu thủy phân tạo đường lên men được ü Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase với hai chủng giống Trichoderma reesei và Aspergillus niger trên môi trường bán rắn ü Nghiên cứu tỉ lệ phối trộn các loại cellulase thô thu được từ hai chủng giống trên ü Ứng dụng thủy phân bã mía bằng các chế phẩm cellulase. .. loại đường và tạo những chủng cây trồng sản sinh cấu trúc lignocellulose kém bền vững hơn, ít thành phần lignin hơn [35] Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu đề tài Biomass, xử lý phế phẩm nông nghiệp, do TS Phan Đình Tuấn, trường đại học Bách khoa TP.HCM phụ trách Biomass là đề tài của nghiên cứu công nghệ xử lý các phế phẩm trong sản xuất nông nghiệp như rơm, rạ, bã mía, trấu… nhằm sản xuất bioethanol (cồn . bã mía 10 2.2 .1. Giới thiệu chung về cây mía và bã mía 10 2.2.2. Các thành phần chủ yếu trong bã mía. 11 2.2.3. Các phương pháp tiền xử lý bã mía 16 2.3. Enzyme cellulase 20 2.3 .1. Phân. PHÁP 40 3 .1. Vật liệu 40 3 .1. 1. Bã mía 40 3 .1. 2. Giống vi sinh vật 40 3 .1. 3. Cơ chất dùng trong lên men bán rắn 40 3 .1. 4. Enzyme thương mại 42 3.2. Nội dung tổng quát 43 3.2 .1. Sơ đồ nội. chất phenyl – propane của lignin 15 Hình 2 .10 : Cấu trúc lignocellulose trước và sau khi tiền xử lý. 16 Hình 2 .11 : Các amino acid liên kết CD và CBD 21 Hình 2 .12 : Quá trình tác động exo-glucanase