34 Real-time PCR Các vấn ñề cơ bản Real-time PCR là gì? Trong kỹ thuật PCR, sau khi hoàn tất khuếch ñại ñoạn DNA ñích, người làm thí nghiệm phải tiếp tục làm một số bước thí nghiệm ñể ñọc kết quả xác ñịnh có sản phẩm khuếch ñại mong muốn trong ống phản ứng hay không, và giai ñoạn này gọi là giai ñoạn thí nghiệm sau PCR. Trong giai ñoạn này, người làm thí nghiệm có thể thực hiện ñiện di sản phẩm PCR trên gel agarose ñể xem có vạch sản phẩm khuếch ñại ñúng kích thước mong muốn hay không, cũng có thể thực hiện thí nghiệm lai với các ñoạn dò ñặc hiệu (trên màng, trên giếng hay phiến nhựa ) ñể xem sản phẩm khuếch ñại có trình tự mong muốn hay không. Kỹ thuật PCR mà cần phải có giai ñoạn thí nghiệm ñể ñọc và phân tích sau khi hoàn tất phản ứng khuếch ñại, ngày hôm nay ñược gọi là PCR cổ ñiển (classical PCR). Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch ñại DNA ñích hiển thị ñược ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên ñược gọi là real-time; và do ñặc ñiểm này nên với real-time PCR người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm ñể ñọc và phân tích kết quả ñể xác ñịnh có sản phẩm khuếch ñại ñích hay không vì kết quả cuối cùng của phản ứng khuếch ñại cũng ñược hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng khuếch ñại. Như vậy, nên có thể nói real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA ñích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch ñại trong ống phản ứng ñược hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch ñại xảy ra ñể người làm thí nghiệm có thể thấy ñược. Các vấn ñề kỹ thuật cơ bản cần biết của real-time PCR 1. Biểu ñồ khuếch ñại của real-time PCR Trong real-time PCR, hiển thị cơ bản ñể người làm thí nghiệm có thể quan sát ñược trong quá trình nhân bản DNA của các ống phản ứng là một biểu ñồ khuếch ñại (amplification graph). Biểu ñồ này có trục tung (Y) là cường ñộ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, còn trục hoành (X) là các chu kỳ nhiệt. Trên biểu ñồ khuếch ñại này (biểu ñồ 1), người làm thí nghiệm sẽ thấy ñối với từng 35 ống phản ứng, cường ñộ huỳnh quang mà máy ghi nhận ñược trong những chu kỳ ñầu sẽ rất thấp và hầu như không thay ñổi, hiển thị bằng một ñường thẳng nằm ngang, chúng ta có thể gọi ñây là “giai ñoạn ủ” hay “giai ñoạn tiềm phục”, vì trong giai ñoạn này dù DNA ñích ñã có thể ñược nhân bản thành các bản sao nhưng do số lượng chưa ñủ ñể giúp cho chất phát huỳnh quang nhận ñược ánh sáng kích thích phát ra ánh sáng huỳnh quang ñủ cường ñộ ñể máy ghi nhận. Nhưng một khi số lượng bản sao của DNA ñích ñạt ñến một ngưỡng nhất ñịnh thì ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ ñủ cường ñộ ñể ñược máy ghi nhận và lúc này chúng ta sẽ thấy ñường biểu diễn khuếch ñại bắt ñầu ngóc lên. Cường ñộ huỳnh quang trong ống phản ứng từ lúc này trở ñi sẽ tăng gấp ñôi sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao của DNA ñích tăng gấp ñôi sau mỗi chu kỳ. Chúng ta gọi giai ñoạn này là “giai ñoạn lũy thừa” về cường ñộ huỳnh quang, không phải là giai ñoạn tăng trưởng lũy thừa về số lượng bản sao của DNA ñích. Cường ñộ huỳnh quang trong ống phản ứng sẽ tăng trưởng ñến một mức nào ñó thì ñộ tăng trưởng sẽ chậm dần và ñạt ñến bình nguyên vì các bản sao của DNA ñích, do phản ứng ñã cạn dần dNTP và enzyme Taq polymerase không hoạt ñộng hiệu quả nữa, nên sẽ không còn gia tăng số lượng theo cấp số 2 nữa. Chúng ta gọi giai ñoạn này là “giai ñoạn bình nguyên”. Phân tích một ñường biểu diễn khuếch ñại (amplification curve) của một ống phản ứng sau khi hoàn tất ñược các chu kỳ nhiệt, chúng ta sẽ thấy một thông số hết sức quan trọng luôn ñi kèm với nó, ñó là chu kỳ ngưỡng (Ct, threshold cycle). Chu kỳ ngưỡng hay Ct là chu kỳ nhiệt mà ở tại thời ñiểm này thiết bị real-time ghi nhận ñược tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt ñầu vượt qua cường ñộ huỳnh quang nền. Để có thể xác ñịnh ñược cường ñộ huỳnh quang nền, thiết bị real-time thường ghi nhận cường ñộ tín hiệu huỳnh quang xuất hiện trong ống phản ứng trong một số chu kỳ ñầu, chúng ta gọi là các chu kỳ nền (basal cycle), và lấy trung bình cộng của các cường ñộ huỳnh quang này làm cường ñộ huỳnh quang nền. Đường cắt ngang ñi qua cường ñộ huỳnh quang nền này ñược gọi là ñường nền (base line). Chu kỳ ngưỡng là trị số ñược xác ñịnh bằng số chu kỳ mà ở ñó ñường nền cắt ñược ñường biển diễn khuếch ñại. Do ñược tính toán như vậy nên chu kỳ ngưỡng thường là một số lẻ (ví dụ: Ct = 28.35) chứ ít khi là một số chẵn. 36 Có những ống phản ứng có Ct sớm và cũng có những ống phản ứng có Ct xuất hiện muộn hơn, và câu hỏi ñược ñặt ra là lý do nào ñã làm ñược như vậy? Câu trả lời chính xác là do số lượng bản DNA ñích ban ñầu (starting quantity, Sq) có trong ống phản ứng nhiều hay ít. Nếu trong ống phản ứng số lượng DNA ñích nhiều thì sẽ cần ít chu kỳ nhiệt hơn ñể ñạt ñến số lượng bản sao ñủ ñể ống phản ứng cho ñược tín hiệu huỳnh quang mà máy sẽ ghi nhận ñược, còn nếu số lượng DNA ñích ít hơn thì cần nhiều chu kỳ nhiệt hơn. 2. Biểu ñồ chuẩn của real-time PCR Như ñã nói Ct của một ống phản ứng real-time PCR sớm hay muộn (Ct thấp hay Ct cao) là tùy thuộc vào số lượng bản DNA ñích ban ñầu có trong ống phản ứng. Đây chính là một ñặc ñiểm vượt trội của real-time PCR so với PCR cổ ñiển, vì nhờ dựa vào ñặc ñiểm này mà người làm thí nghiệm xác ñịnh ñược số copies của tác nhân ñích có trong mẫu thử, một thông số mà PCR cổ ñiển không thể nào làm ñể có ñược kết quả chính xác. Người làm thí nghiệm chỉ ñọc kết quả PCR cổ ñiển sau khi hoàn tất phản ứng khuếch ñại, và kết quả này nếu ñịnh lượng ñược thì cũng chỉ là kết quả ñịnh lượng 5 10 15 20 25 30 35 Giai ñoạn ủ Giai ñoạn lũy thừa Giai ñoạn bình nguyên Chu kỳ ngưỡng (Ct) Đường nền (base line) Cường ñộ huỳnh quang nền Cường ñộ huỳnh quang Chu kỳ nhiệt Chu kỳ nền Đường biểu diễn khuếch ñại Biu ñ 1: Biểu ñồ một ñường biểu diễn khuếch ñại ghi nhận cường ñộ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận ñược ánh sánh kích thích vào mỗi chu kỳ nhiệt 37 số bản sao của DNA ñích sau khi hoàn tất khuếch ñại. Mà trong PCR, số lượng bản sao cuối cùng không phản ảnh ñược một cách chính xác số lượng bản DNA ñích ban ñầu có trong mẫu thử vì trong ña số các trường hợp số lượng bản sao có trong ống phản ứng PCR là số lượng cực ñại sau khi PCR ñạt ñược giai ñoạn bình nguyên. Tuy nhiên ñể real-time PCR xác ñịnh ñược chính xác số lượng bản ñích ban ñầu có trong mẫu thử, người làm thí nghiệm phải thực hiện real-time PCR các mẫu thử chứa các số lượng bản DNA ñích ban ñầu cần xác ñịnh số lượng cùng lúc với các mẫu chuẩn chứa số lượng DNA ñích ban ñầu ñã biết rõ số lượng, và thường thì các mẫu chuẩn là các mẫu pha loãng theo hệ số pha loãng 10 chứa số lượng DNA ñích ban ñầu. Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt của real-time PCR, trên biểu ñồ khuếch ñại (biểu ñồ 2), các mẫu chuẩn và các mẫu thử sẽ có các ñường biểu diễn khuếch ñại của nó và tương ứng với các ñường biểu diễn khuếch ñại này, các mẫu chuẩn và mẫu thử ñều có một chu kỳ ngưỡng (Ct). Đường biểu diễn vẽ lên mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với số lượng bản DNA ñích ban ñầu có trong các mẫu chuẩn ñược gọi là ñường biểu diễn chuẩn (standard curve). Đây là một ñường thẳng tuyến tính ñi qua các ñiểm tọa ñộ xác ñịnh bởi số lượng bản DNA ñích ban ñầu của từng mẫu chuẩn Đường biểu diễn khuếch ñại của các mẫu chuẩn Đường biểu diễn khuếch ñại của các mẫu thử Biu ñ 2: Biểu ñồ khuếch ñại vẽ lên các ñường biểu diễn khuếch ñại c ủ a các m ẫ u th ử và các m ẫ u chu ẩ n Biu ñ 3: Biểu ñồ chuẩn vẽ lên ñường biểu diễn chuẩn về mối quan hệ giữa số lượng bản DNA ñích có trong các mẫu chuẩn và chu kỳ ngưỡng tương ứng. Trong biểu ñồ ở trên này, chúng ta E2-E4-E7 là các ống phản ứng chứa các mẫu chuẩn còn B4 là ống phản ứng chứa mẫu thử. 38 (trên trục tung) và chu kỳ ngưỡng của ống phản ứng chứa số lượng bản DNA ñích này (biểu ñồ 3). Trên biểu ñồ chuẩn này, trục tung (Y) là Ct còn trục hoành (X) là số lượng bản DNA ñích ban ñầu có trong các mẫu chuẩn. Do các mẫu chuẩn thường ñược pha cách nhau theo hệ số pha loãng 10, nên số lượng bản DNA ñích trong các mẫu chuẩn ñược biểu thị bằng logarith cơ số 10 (log 10 ) của số lượng này. Do vậy trị 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 trên trục X là tương ứng với các số lượng bản ñích là 10 1.5 , 10 2 , 10 2.5 , 10 3 , 10 3.5 , 10 4 , 10 4.5 tức là 32, 100, 316, 1000, 3162, 10000, 31623 copies trong ống phản ứng. Có hai thông số ñược máy tính toán và hiển thị trên một ñường biểu diễn chuẩn. Hai thông số này rất có giá trị ñể người làm thử nghiệm có thể ñánh giá ñược thao tác pipetting của mình trong quá trình làm thử nghiệm. Thông số ñầu tiên là hệ số tương quan R 2 , ñánh giá ñộ chính xác của thao tác pipetting lấy có ñúng thể tích mong muốn hay không. Trị số R 2 phải ñạt là trên hay bằng (≥) 0.99 có nghĩa là ñường biểu diễn chuẩn phải ñạt tuyến tính cao. Khi người làm thử nghiệm không lấy ñược các thể tích chính xác thì chắc chắn các thể tích mẫu chuẩn cho vào real-time PCR mix sẽ không thể nào chính xác ñược, nên R 2 chắc chắn sẽ không thể nào ñạt ≥ 0.99. Một trị số nữa rất có giá trị mà người làm thử nghiệm phải biết rõ ñó là hiệu quả PCR , ñược gọi là E% (PCR efficiency). Một khi PCR ñạt hiệu quả lý tưởng, thì cứ sau mỗi chu kỳ nhiệt cường ñộ huỳnh quang trong một ống phản ứng phải tăng gấp ñôi, còn nếu ở hai ống phản ứng có số lượng bản DNA ñích ban ñầu cách nhau một hệ số pha loãng , thì hai ñường biểu diễn khuếch ñại sẽ cách nhau chu kỳ với cường ñộ huỳnh quang của hai ống phản ứng cũng sẽ cách nhau một hệ số pha loãng A = 2 n . Như vậy, nếu ñộ pha loãng là 10 lần thì Ct của các ñộ pha loãng DNA ñích của mẫu chuẩn liên tiếp nhau sẽ cách nhau là 3.32 chu kỳ (tính toán từ công thức trên với A = 10, sẽ tính ñược n = 3.32 chu kỳ). Trong biểu ñồ chuẩn với các mẫu chuẩn cách nhau qua ñộ pha loãng hệ số 10 thì hiệu quả khuếch ñại E ñược tính là bằng công thức 10 -1/slope với slope chính là ñộ ñốc của ñường biểu diễn chuẩn. Một cách lý tưởng, hiệu quả khuếch ñại E của PCR phải ñạt ñược là 2 nghĩa là số lượng bản sao nhân bản từ bản DNA ñích phải tăng gấp ñôi sau mỗi chu kỳ nhiệt trong giai ñoạn tăng trưởng lũy thừa, tức là 2 = 10 -1/slope . Từ công thức này, chúng ta sẽ tính ra ñược ñường biểu diễn chuẩn lý tưởng 39 phải có ñộ ñốc (slope) là -3.32. Như vậy, chúng ta thấy ñộ dốc chính là sự cách biệt nhau về chu kỳ ngưỡng giữa các ống chuẩn có số lượng giảm dần theo hệ số pha loãng 10. Hiệu quả khuếch ñại cũng có thể tính bằng phần trăm (%) với công thức tính từ E là: E% = (E-1) x 100%. Với E ñạt lý tưởng là 2 thì E% = 100 %. Đối với bất cứ một ñường biểu diển chuẩn nào, ñều có thể tính ñược hiệu quả khuếch ñại E % = (10 -1/slope – 1) x 100 %. Do vậy nếu ñộ dốc của một ñường biểu diễn chuẩn là -3.436 thì E sẽ là 10 -(1/-3.436) = 1.954, vậy thì hiệu quả % của khuếch ñại (hiệu quả PCR) sẽ là: E % = (1.954 – 1) x 100% = 95.4 %, có nghĩa là trong giai ñoạn tăng trưởng lũy thừa số lượng bản sao sau mỗi chu kỳ nhiệt sẽ ñược nhân lên 1.954 lần hay hiệu quả PCR là 95.4 %. Dĩ nhiên hiệu quả PCR lý tưởng là 100 %, nhưng trong thực tế thì hiệu quả PCR chấp nhận ñược phải trong khoảng 90 % - 105 %. Người làm thí nghiệm phải biết dùng hiệu quả PCR hiển thị trong biểu ñồ chuẩn ñể ñánh giá thao tác pipetting ñể pha loãng mẫu của mình. Sai lầm ñầu tiên có thể gặp trong thao tác pha loãng mẫu là mang lượng DNA ñích từ mẫu nồng ñộ cao xuống mẫu có nồng ñộ thấp hơn, mà thường là do không thay ñầu pipette sau khi mang thể tích từ nồng ñộ cao xuống nồng ñộ thấp, vì vậy mà số lượng bản DNA ñích có trong các mẫu chuẩn ñược pha loãng sẽ nhiều hơn tính toán. Ví dụ nếu thao tác pha loãng chính xác, thì từ 10.000 copies xuống 1.000 copies rồi 100 copies sẽ chính xác như vậy; nhưng nếu không thay ñầu pipette sau mỗi lần hút mẫu và lượng bản ñích mang theo ở ñầu pipette là 40% thì chúng ta sẽ có các số lượng sẽ là 10.000 copies xuống 4.000 copies rồi 1.600 copies. Vì vậy nên hiệu quả PCR ñược tính toán bằng giá trị E sẽ không ñạt ñược lý tưởng 90 % ñến 105 % mà sẽ cao hơn 105 %. Lý do là chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn sẽ bị gần nhau hơn làm cho ñộ dốc của ñường biểu diễn chuẩn thấp ñi. Ngược lại nếu thao tác pha loãng mà không cho ñủ thể tích mẫu chuẩn hút từ mẫu có số lượng DNA chuẩn cao ñể pha mẫu chuẩn lượng thấp hơn (sai lầm này có thể gặp khi dùng các ñầu pipette bị dính dung dịch trên thành nên không ñẩy ñược hết lượng mẫu từ ñầu pipette xuống mẫu kế), và chính như vậy nên chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn liên tiếp nhau sẽ cách xa nhau làm cho ñộ dốc của ñường biểu diễn chuẩn thấp ñi, và hiệu quả PCR sẽ dưới 95 %. Hiệu quả PCR cũng là một thông số rất có giá trị ñể nhà nghiên cứu tối ưu ñược kỹ thuật real-time PCR mà mình. Nếu hiệu quả PCR thấp thì nguyên do có thể là thiết kế mồi chưa ñạt ñộ nhạy, do tách chiết DNA ñích còn các ức chế ngăn cản phản ứng khuếch ñại. Nếu hiệu quả PCR cao thì nguyên do lại có thể là do sự bắt cặp không ñặc hiệu của mồi hay của ñoạn dò. Như vậy, việc thiết lập biểu ñồ chuẩn là rất cần thiết khi làm real-time PCR chẩn ñoán, ñặc biệt khi ñể xác ñịnh chính xác số lượng tác nhân ñích ban ñầu có trong mẫu thử. Biểu ñồ chuẩn có công dụng trước tiên là ñánh giá ñược thao tác pipetting của người làm thử nghiệm có ñạt không. Đây là một việc là hết sức quan trọng vì nếu thao tác pipetting mà không chính xác thì sẽ không thể nào có ñược kết quả ñịnh lượng chính xác ñược. Do vậy sẽ thật là i lầm và thiếu hiểu biết nếu nhà sản xuất bộ thuốc thử real-time PCR dành ñể ñịnh lượng tác nhân ñích lại cung cấp sẵn các PCR mix có cho trước các lượng chuẩn của DNA ñích, gọi là các bộ chuẩn, mà không ñể cho người làm thí nghiệm tự pha loãng các mẫu chuẩn ñể cho vào real-time PCR mix. Sau khi ñã ñánh giá ñược thao tác pipetting của người làm thử nghiệm là ñạt, người làm thử nghiệm sẽ sử dụng công dụng thứ hai của biểu ñồ chuẩn, ñó là xác ñịnh ñược số lượng tác nhân ñích ban ñầu có trong mẫu thử. Giá trị này ñược tính toán nhờ vào hàm số biểu thị mối tương quan giữa chu kỳ ngưỡng (Y = Ct) với log 10 của số lượng bản DNA ñích ban ñầu có trong ống phản ứng (X = log 10 Sq). Hàm số ñó là: Y = [slope (X)] + intercept, và các thông số slope và intercept ñều hiển thị trên biểu ñồ chuẩn. Từ hàm số này, người làm thí nghiệm sẽ hiểu ñược tại sao máy tính hiển thị ñược Sq, ñó là nhờ tính toán từ Sq = 10 [(Ct – intercept)/slope] . Từ Sq này, người làm thí nghiệm sẽ tính ñược số lượng tác nhân ñích ban ñầu có trong mẫu thử dựa vào hiệu quả tách chiết nucleic acid ñích từ mẫu thử và các pha loãng nếu có trong quá trình tách chiết củng như thực hiện real-time PCR. Ví dụ: khi sử dụng các bộ thuốc thử phát hiện và ñịnh lượng HCV do công ty Nam Khoa sản xuất thì số copies HCV có trong 1 ml huyết thanh thử nghiệm sẽ bằng N x 71 với N là số copies ñịnh lượng ñược trong ống phản ứng, hay khi khi sử dụng các bộ thuốc thử phát hiện và ñịnh lượng HBV do công ty Nam Khoa sản xuất thì số copies HBV có trong 1 ml huyết thanh thử nghiệm sẽ bằng N x 50 với N là số copies ñịnh lượng ñược trong ống phản ứng (xem phụ lục ñể biết cách tính toán ñể có các hệ số này). real-time PCR Điều kiện ñầu tiên ñể có thể thực hiện ñược real-time PCR là phải có máy real-time PCR. Máy này cũng có một buồng ủ nhiệt chạy ñược chương trình luân nhiệt như máy PCR bình thường, nhưng có thêm một thiết bị ñược gọi là thiết bị real-time. Đây là một thiết bị quang học có hai chức năng: (1) Có các nguồn sáng phát ra ñược các tia sáng kích thích (excitation light) có bước sóng xác ñịnh lên các tube phản ứng real-time PCR; (2) Có ñược camera hay cảm biến quang ghi nhận ñược ánh sáng huỳnh quang phát ra (emission light) từ các tube phản ứng real-time PCR khi các tube phản ứng này ñược chiếu các tia sáng kích thích. Tùy theo hãng và model sản xuất mà có nhiều kiểu thiết bị real-time khác nhau. Các kiểu thiết bị này khác nhau về cách phát ra nguồn sáng kích thích và cách ghi nhận ñược ánh sáng huỳnh quang ñược phát ra từ các tube phản ứng. Tóm tắt có các kiểu sau ñây: 1. Sử dụng nguồn sáng kích thích là ñèn tungstene và dùng các kính lọc ñể chiếu nguồn sáng có ñộ dài sóng nhất ñịnh lên toàn bộ các giếng chứa tube phản ứng Hình 20 minh họa sơ ñồ một thiết bị real-time dùng ñèn tungstene làm nguồn sáng kích thích. Nguồn sáng này ñi qua một kính lọc màu ñược người sử dụng chọn (bằng chương trình ñiều khiển ñể xoay ñĩa chọn kính lọc màu thích hợp ñến ñúng vị trí) chỉ cho một loại ánh sáng có ñộ dài sóng thích hợp ñi qua. Ánh sáng kích thích có ñộ dài sóng chọn lọc này ñược gương dichroic phản chiếu xuống buồng ủ nhiệt có các tube phản ứng. Trong tube phản ứng có chứa một loại hóa chất có khả năng phát huỳnh quang, nếu có sự hiện diện của sợi ñôi DNA ñược khuếch CCD Camera CCD Camera CCD Camera Các kính lọc ánh sáng huỳnh quang phát ra Các kính lọc nguồn ánh sáng kích thích Nguồn ánh sáng kích thích là ñèn Tungsten Gương phản chiếu nguồn sáng kích thích nhưng cho phép ánh sáng huỳnh quang phát ra ñi qua Đĩa mang và thay ñổi vị trí các kính lọc nguồn sáng kích thích Đĩa mang và thay ñổi vị trí các kính lọc ánh sáng huỳnh quang ñến CCD camera Buồng ủ nhiệt của máy PCR Đường ñi của ánh sáng Hình 20: Minh họa sơ ñồ một thiết bị real-time dùng ñèn tungsten làm nguồn sáng kích thích và CCD camera ghi nhận toàn bộ tín hiệu huỳnh quang của các tube phản ứng bị chiếu sáng bởi nguồn sáng kích thích ñại từ DNA ñích và bị chiếu sáng bởi ánh sáng kích thích có ñộ dài sóng thích hợp. Ánh sáng huỳnh quang phát ra từ tube phản ứng sẽ ñi qua gương dichroic, qua kính lọc màu huỳnh quang ñể ñược ghi nhận bởi một CCD camrea. CCD camera này sẽ chụp hình nguyên buồng ủ nhiệt của máy PCR ñể ghi nhận tín hiệu và cường ñộ huỳnh quang ñược phát ra từ các tube phản ứng qua mỗi chu kỳ nhiệt và ñưa về bộ vi xử lý của máy vi tính rồi hiển thị real-time lên màn hình bằng biểu ñồ ñể người làm thí nghiệm thấy ñược cường ñộ của tín hiệu huỳnh quang phát ra từ mỗi giếng phản ứng qua các chu kỳ nhiệt. Thiết bị real-time kiểu này có thể thấy ñược trong các máy real- time PCR thế hệ IQ (ví dụ IQ, MyIQ, IQ5) của hãng Biorad. 2. Thi t bị dùng sợi quang học (fiber optic cables) ñể ñưa nguồn sáng kích thích ñến các tube phản ứng Trong thiết bị này, nguồn sáng kích thích có thể là ñèn laser, hay ñèn tungstene, ñược các sợi quang học dẫn trực tiếp ñến các tube phản ứng, và các sợi quang học học ñồng thời cũng làm luôn nhiệm vụ dẫn ánh sáng huỳnh quang phát ra ñến CCD camera. Thiết bị real- time kiểu này có thể ñược thấy trong các máy realtime PCR của hãng ABI, như các máy real- time ABI 7000 hay ABI 7.500 (hình ). 3. Thiết bị real-time dùng ñèn led làm nguồn sáng kích thích Trong thiết bị này, nguồn sáng kích thích ñược sử dụng là các ñèn LED ñược gắn trên một giá và giá này di chuyển sát trên buồng ủ nhiệt (hình 22) ñể chiếu ánh sánh kích thích lên các tube phản ứng và nhận ánh sáng huỳnh quang phát ra (máy real-time PCR model CFX 96 của Biorad), hay là ñược cố ñịnh tại một vị trí trong buồng ủ nhiệt và các tube phản ứng ñược di chuyển ñến vị trí này nhờ các tube phản ứng ñược gắn Fiber optic cable Nguồn sáng laser hay tungstene Buồng ủ nhiệt Fiber optic cable Thấu kính nhỏ Tube phản ứng Buồng ủ nhiệt Hình 21: Minh họa một thiết bị real-time dùng sợi quang học ñể ñưa ánh sáng kích thích ñến tube phản ứng 43 trên một giá xoay tròn (máy luân nhiệt Ligh-cycler của Roche hay Rotor Gene của Corbett Research). Lợi ñiểm của thiết bị real-time này là ñời sống của ñèn LED có thể kéo dài rất lâu, có thể ñến hàng chục ngàn giờ. H chất và thu c th cho real-time PCR Chìa khóa kỹ thuật chính của hóa chất và thuốc thử có trong tube phản ứng real-time PCR chính là chất huỳnh quang ñược thêm vào PCR mix. Chất huỳnh quang này phải làm thế nào ñể tube phản ứng có thể phát ñược huỳnh quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích một khi trong tube phản ứng này có sự hiện diện sản phẩm khuếch ñại của PCR từ DNA ñích, và sẽ không thể phát ñược huỳnh quang nếu không có sản phẩm khuếch ñại trong ống. Cho ñến nay, các nhà khoa học ñã tìm ra ñược nhiều chất huỳnh quang như vậy. Trong phạm vi nội dung của bài này, chúng tôi chỉ xin trình bày một số chất huỳnh quang thường ñược sử dụng nhất. . Ch t phát huỳnh quang là một lo i màu hu nh quang chèn vào s i ñôi Màu huỳnh quang chèn vào sợi ñôi DNA là một loại màu huỳnh quang có ái lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi ñôi DNA và ái lực này là do khả năng chèn của màu vào giữa sợi ñôi DNA và làm cho sợi ñôi DNA phát ñược ánh sáng huỳnh quang khi nhận ñược nguồn sáng kích thích. tắc kỹ thu t real-time PCR dùng màu huỳnh quang chèn Nguyên tắc của kỹ thuật này là khi không có sự hiện diện sản phẩm khuếch ñại của PCR, chất huỳnh quang bị phân tán trong dung dịch PCR mix, do vậy mà tube phản ứng sẽ không bị phát huỳnh quang hay chỉ phát huỳnh quang không ñáng kể khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích. Nhưng khi có sự hiện diện sản phẩm khuếch ñại của PCR thì màu huỳnh quang sẽ bị chèn vào và tập trung trên các sợi ñôi DNA của sản phẩm khuếch ñại và sẽ làm cho tube phản ứng bị phát huỳnh quang khi bị chiếu bởi Đèn LED Lọc bước sóng kích thich Cảm biến quang Gương dichroic Buồng ủ nhiệt Tube phản ứng Hình 22: Hệ thống 6 ñèn LED cùng với 6 cảm biến quang ñược gắn trên một giá và ñược di chuyển sát trên buồng ủ nhiệt có trong thiết bị Real-time PCR của máy real-time PCR CFX 96 của Biorad [...]... Gene và Light Cycler; *Thích h p cho kênh màu FAM và SYBR c a các máy real- time PCR thông d ng; Thích h p cho kênh Joe c a các máy PCR thông d ng ♣ V i real- time PCR dùng HRM làm màu chèn, nhà nghiên c u cũng như ngư i làm th nghi m hoàn toàn có th th c hi n real- time PCR ñ không ch ñ nh lư ng m t cách ñ c hi u ñư c tác nhân ñích có trong m u th , mà còn có th th c hi n ñư c multiplex real- time PCR. .. các máy real- time PCR thông d ng và r t t i ưu trên real- time PCR c a Biorad hay Applied Biosystem (dùng ñúng kênh màu FAM hay SYBR green I); BOXTO thì dùng kênh màu Joe có trên nhi u máy real- time PCR thông d ng, có th k t h p v i real- time PCR dùng Beacon probe g n ch t phát huỳnh 49 quang là FAM, nh v y mà có th ñ nh lư ng DNA ñích b ng FAM và phân tích HRM curve v i kênh Joe B ng 5: Trình bày các. .. cao và l i có th c ch PCR Chính vì như c ñi m này mà ñư ng bi u di n ñ nh ch y s không cao, ñ phân gi i các ñ nh ch y c a các s n ph m khu ch ñ i có trình t khác bi t hay /và chi u dài khác bi t cũng r t th p, không th phân bi t ñư c chúng v i nhau Chính vì v y mà real- time PCR s d ng SYBR I làm ch t phát huỳnh quang không th ng d ng trong multiplex real- time PCR, trong real- time PCR phát hi n các SNP... i probe, và th m chí c primers ñư c s d ng làm ch t phát huỳnh quang cho real- time PCR Trong ph m vi bài này, chúng tôi xin trình bày k m t s thư ng ñư c s d ng hi n nay Real- time PCR s d ng Taqman probe t c k thu t real- time PCR s d ng Taqman probe 1 a 0)('&% Trong k thu t này, real- time PCR mix ngoài các thành ph n cơ b n c a PCR mix, còn ch a hai thành ph n quan tr ng ñ probe có th phát huỳnh quang... thí nghi m ch cho thêm m i, n ng ñ 10-25 pm cho m t th tích ph n ng, và n u c n thì cho thêm dUTP và UNG ñ ch ng ngo i nhi m, là có ñư c real- time PCR mix ñ th c hi n real- time PCR B ng dư i ñây Cách pha SYBR PCR master mix t NKSYBR PCR master mix 2X ñ sau ñó phân thành 100 mix v i th tích ph n ng là 25 µl và th tích m u cho vào PCR mix là 5 µl B ng 4: 9 STT Thành ph n g c N ng ñ hay hàm lư ng g c... trình luân nhi t real- time PCR dùng SYBR I là màu chèn V i real- time PCR s d ng SYBR I làm ch t phát huỳnh quang; thi t b real- time s ghi nh n ñư c s phát huỳnh quang t i ña t thích, là ng ph n ng, khi nh n ánh sáng kích cu i giai ño n nhi t ñ kéo dài c a chu kỳ PCR Do v y m t chương trình luân nhi t cho real- time PCR s d ng SYBR có th là: 1 chu kỳ: 40oC/10’ (n u trong PCR mix có dUTP và UNG), 1 chu... 3mM, và thêm m t ít DMSO, BSA Ngoài ra, tùy thu c vào thi t b real- time PCR có ñòi h i PCR mix ph i thêm màu huỳnh quanh n n hay không ñ thi t b nh n di n ñư c v trí và xác ñ nh ñư c giá tr ngư ng huỳnh quang ban ñ u c a t ng gi ng th nghi m, mà ngư i làm thí nghi m có cho thêm ch t huỳnh quang n n vào PCR mix hay không Ví d v i các máy realtime th h IQ c a Biorad thì huỳnh quang n n cho vào PCR mix... Scorpion primers, Lux primers, BD-QZyme primers Xin tham kh o tài li u Real- time 59 PCR Applications Guide (http://www.gene-quantification.de /real- time- pcr- guide-biorad.pdf) ñ rõ hơn Các ng d ng c a real- time PCR Đ nh l ng tác nhân ích có trong m u th Đ c trưng c a real- time PCR là phát hi n s n ph m khu ch ñ i trong quá trình ch y PCR khi s n ph m khu ch ñ i t DNA ñích ñư c nhân b n ñ t ñ s lư ng ñ... 610 BHQ2, BHQ3, DABCYL Quasar 705 690 705 BHQ3 Thi t k m i và Taqman probe Thi t k m i cho real- time PCR dùng Taqman probe cũng theo các qui lu t thi t k m i chung cho PCR (trình bày trong ph n thi t k m i dành real- time PCR dùng màu huỳnh quang chèn) Trong real- time PCR dùng Taqman probe thì nên thi t k m i có nhi t ñ ch y kho ng 55oC - 60oC và th p hơn nhi t ñ ch y c a Taqman probe 53 kho ng 5oC -... quang và thi t b real- time s ghi nh n ñư c huỳnh quang này n u lư ng s n ph m khu ch ñ i ñ t ñ ngư ng ñ huỳnh quang phát ra t A qua ñư c kính l c ñ ñ n ñư c CCD camera hay c m quang c a thi t b real- time Cơ ch ho t ñ ng c a probe lai như v y nên k thu t này còn g i là k thu t FRET real- time (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 58 Cũng như t t c các cơ ch phát huỳnh quang khác c a real- time PCR, . thí nghiệm có thể thấy ñược. Các vấn ñề kỹ thuật cơ bản cần biết của real- time PCR 1. Biểu ñồ khuếch ñại của real- time PCR Trong real- time PCR, hiển thị cơ bản ñể người làm thí nghiệm có. mà real- time PCR sử dụng SYBR I làm chất phát huỳnh quang không thể ứng dụng trong multiplex real- time PCR, trong real- time PCR phát hiện các SNP (single nucleotide polymorphism), hay real- time. ứng (xem phụ lục ñể biết cách tính toán ñể có các hệ số này). real- time PCR Điều kiện ñầu tiên ñể có thể thực hiện ñược real- time PCR là phải có máy real- time PCR. Máy này cũng có một