Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 42-54 Trường Đại học Cần Thơ 42 ĐỊNH DANH CÁC VI KHUẨN CHUYỂN HÓA ĐẠM BẰNG PHÉP THỬ SINH HÓA VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Phạm Thị Tuyết Ngân 1 và Nguyễn Hữu Hiệp 2 ABSTRACT Nutrient accumulation affects the quality and sustainability of many aquaculture products. Significant research indicates that three groups of bacteria (Nitrosomonas, Nitrobacter and Bacillus) consume excess nutrients very efficiently. Identification of the bacteria was performed by biochemical tests and molecular techniques. Nice isolated bacteria strains from shrimp intensive ponds were tested. It was indicated positive effected on shrimp performance on tanks experiments. Testing by the Griess-Ilosway biochemical test resulted in positive scores for the 05 strains of Bacillus and the 04 strains of Nitrosomonas sp. and a negative score for the 05 strain of Nitrobacter sp. Analysis of DNA sequences and homology was completed with the BLAST server of the National Center for Biotechnology Information using the BLAST algorithm. This molecular analysis showed that: the B9 strain of Bacillus is homologous with Bacillus cereus BRL02-43 (97%); B37 and B38 strains are homologous with Bacillus cereus G9842 (100% and 99%); the B41 strain is homologous with Bacillus amyloliquefaciens SB3297 (100%); and the B67 strain is homologous with Bacillus subtilis BL10 (99%). S6 homology with Uncultured Nitrosomonadaceae bacterium 3CC11 (98%); S8 and S12 homology with Nitrosomonas nitrosa (90% và 91%); N10 and N12 homology with Nitrobacter winogradskyi ATCC 25381 (99% và 100%). Keywords: DNA, Sequencing, Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter. Title: Identification of nitrifying bacteria by biochemical test and molecular technique. TÓM TẮT Tích lũy đạm ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng các đối tượng nuôi thủy sản. Nhiều nghiên cứu cho thấy ba nhóm vi khuẩn (Nitrosomonas, Nitrobacter và Bacillus) tham gia khử đạm rất hiệu quả. Vì vậy định danh các dòng vi khuẩn này là rất cần thiết. Chín chủng vi khuẩn được phân lập từ ao nuôi tôm sú, trên môi trường chuyên biệt đã qua các bước thử nghiệm thành 1 Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ 2 Viện Nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 42-54 Trường Đại học Cần Thơ 43 công trong phòng thí nghiệm trên qui mô bể nuôi. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa cho thấy 05 dòng chọn định danh có đặc điểm giống Bacillus, 04 dòng Nitrosomonas dương tình với thuốc thử Griess- Ilosway và 05 dòng Nitrobacter cho kết quả âm tính với thuốc thử Griess- Ilosway. Kết quả giải trình tự và so sánh với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu gen chương trình BLAST cho thấy: B9 đồng hình với dòng Bacillus cereus BRL02-43 (97%), 02 dòng B37, B38 đồng hình giống với dòng Bacillus cereus G9842 (100% và 99%), Dòng B41 đồng hình giống với dòng Bacillus amyloliquefaciens SB3297 (100%) và dòng B67 có mức độ đồng hình với dòng Bacillus subtilis BL10 (99%). Dòng S6 đồng hình với dòng Nitrosomonadaceae 3CC11 (98%), 02 dòng S8 và S12 đồng hình với dòng Nitrosomonas nitrosa (90% và 91%). Cả 02 dòng N10 và N12 đều có mức độ đồng hình với dòng vi khuẩn Nitrobacter winogradskyi ATCC 25381 (99% và 100%). Từ khóa: DNA, trình tự, Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter. 1 GIỚI THIỆU Tổng sản lượng tôm nuôi trên thế giới tăng liên tục từ năm 1985, đến năm 2006 đạt gần 3,2 triệu tấn trong đó tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) chiếm tỉ lệ khoảng 67% và tôm sú (Penaeus monodon) chỉ chiếm khoảng 30% (Le Hong Phuoc et al., 2008). Trong năm 2010 mặc dù người nuôi tôm trong nước gặp không ít khó khăn nhưng vẫn thu được lợi nhuận, sản xuất và tiêu thụ tôm vẫn thu được kết quả khả quan. Diện tích nuôi tôm nước lợ cả nước trong năm 2010 đạt trên 639.000 ha, sản lượng đạt gần 470.000 tấn. Sản xuất tôm giống tuy còn nhiều bất cập nhưng nhìn chung chất lượng giống tôm nước lợ trong năm 2010 được kiểm soát chặt chẽ, sản xuất giống tôm sú, tôm thẻ chân trắng đạt 43 tỷ con, cung cấp tại chỗ ở các tỉnh có điều kiện tự nhiên, môi trường phù hợp. Theo Tổng cục Thủy sản (Bộ NN & PTNT), năm 2010 diện tích nuôi tôm nước lợ trong cả nước bị thiệt hai hơn 60.000 ha, trong đó diện tích tôm bị bệnh là 26.000 ha chiếm hơn 4% diện tích nuôi cả nước. Bên cạnh thiệt hại về dịch bệnh, người nuôi tôm còn đối di ện với không ít khó khăn do giá thức ăn thủy sản liên lục tăng (hoinghecavietnam.org.vn, 2011) Tốc độ tăng trưởng nhanh đã dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường, gây thiệt hại rất lớn cho người sản xuất. Mặt khác sản phẩm thủy sản xuất khẩu không đạt tiêu chuẩn do dư lượng thuốc kháng sinh, thuốc bảo vệ thực vật và vi sinh vật gây bệnh (Đặng Đình Kim và ctv, 2006). Hiện nay xu hướng sử dụng vi khuẩn hữu ích được áp dụng rộng rãi trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng nhằm giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường theo hướng bền vững. Để hiểu rõ hơn nữa các thành phần giống loài tham gia xử lý môi trường, góp phần xây dựng môi trường nuôi thủy sản bền vững và đạt hiệu quả, một nghiên cứu về việc xác định vị trí phân loại các nhóm vi khuẩn chuyển hóa đạm bằng kỹ Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 42-54 Trường Đại học Cần Thơ 44 thuật sinh học phân tử và phép thử sinh hóa được thực hiện nhằm làm cơ sở cho các nghiên cứu về vi khuẩn chuyển hóa đạm tiếp theo. 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu thí nghiệm Các chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus, Nitrosomonas và Nitrobacter có nguồn gốc từ ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon) thâm canh tại Sóc Trăng được chọn lọc để định danh. Các chủng vi khuẩn này đã qua thử nghiệm và đánh giá thành công về khả năng làm sạch môi trường nước giúp tôm tăng trưởng và tăng tỉ lệ sống trên ương và nuôi tôm sú trong điều kiện phòng thí nghiệm (Phạm Thị Tuyết Ngân và Trương Quốc Phú, 2010; Lê Đông Cung và ctv, 2010). 2.2 Phương pháp nghiên cứu Các chủng vi khuẩn (được bảo quản trong tủ âm sâu -80ºC) đã được phục hồi trên môi trường TSA, sau đó tiếp tục nuôi tăng sinh bằng môi trường Luria Bertani (LB). Các phép thử sinh hóa được thực hiện trên từng nhóm vi khuẩn. Các chủng thuần được nuôi tăng sinh trong môi trường chuyên biệt (LB) và ADN được ly trích để định danh bằng kỹ thuật giải trình tự. 2.2.1 Phép thử sinh hóa Các chỉ tiêu sinh hóa được áp dụng cho các chủng vi khuẩn Bacillus: B9, B37, B38, B41 và B67 thuần được nuôi tăng sinh trong môi trường chuyên biệt sau đó lần lượt thực hiện các phép thử sinh hóa theo mô tả của tác giả Andretta et al., (2004). Các chỉ tiêu được kiểm tra trong phép thử sinh hóa bao gồm: xác định tính di động của vi khuẩn, khả năng sản sinh catalase, phản ứng khử nitrate, khả năng phát triển ở các nồng độ muối, nhiệt độ khác nhau, phương pháp nhuộm gram được thực hiện theo mô tả của tác giả Sharmin và Rahman (2007). Phương pháp nhuộm bào tử, khả năng phát triển ở các pH khác nhau áp dụng theo Brown (2005). Khả năng thủy phân Casein dựa theo tác giả Elnasser et al., (2007). Các chỉ tiêu sinh hóa được áp dụng để xác định vi khuẩn nitrate hóa: Bốn chủng vi khuẩn S6, S8, S10, S12 và N6, N7, N8, N10, N12 đã được chọn nuôi tăng sinh để tiến hành kiểm tra phản ứng sinh hóa nhằm xác định nhóm vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter bằng thuốc thử Griess- Ilosway. Lấy 20 mL môi trường chuyên biệt (Lewis và Pramer, 1958) cho vào trong 1.000 mL nước cất bổ sung các hóa chất theo công thức sau: Na 2 HPO 4 (13,5 g/L); KH 2 PO 4 (0,7 g/L); MgSO 4 .7H 2 O (0,1g/L); NaHCO 3 (0,5 g/L); (NH 4 ) 2 SO 4 (2,5 g/L); FeCl 3 .6H 2 O (0,0142 g/L); CaCl 2 .2H 2 O (0,0184g/L). Sau đó cho vào các ống falcon. Sau cùng chuyển 1 mL dung dịch vi khuẩn vào các ống falcon này, ủ trong bóng tối ở 28ºC trên máy lắc (150 vòng/phút) trong vòng 2-4 tuần. Sau Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 42-54 Trường Đại học Cần Thơ 45 2 tuần kiểm tra sự có mặt của NO 2 - ở các ống falcon chứa môi trường vi khuẩn bằng thuốc thử Griess – Ilosvay. Nếu dòng vi khuẩn nuôi là Nitrosomonas thì chúng sẽ khử ammonium trong môi trường nuôi. Phản ứng màu chứng tỏ đó là vi khuẩn Nitrosomonas. 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử Ly trích ADN từ vi khuẩn dựa theo phương pháp được mô tả bởi Boon et al., (2000): Vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong môi trường LB. Lấy 1,8 mL vi khuẩn cho vào ống eppendorf và đem ly tâm với vận tốc 8000 vòng/phút trong 25 phút thu lấy phần kết tủa và loại bỏ phần dung dịch. Sau đó cho vào 400 µl nước khử ion đã khử trùng, trộn đều, rồi lấy 400 µl dung dịch vi khuẩn này cho vào ống eppendorf đã có sẵn 0,6 g hạt thủy tinh (đường kính 0,1-0,11) (B. Braun Biotech International, Melsungel, Germany). Sau đó 0,8 mL Na 3 PO 4 (0.1M có pH=8) được thêm vào ống eppendorf, tiếp tục lắc đều và dập hỗn hợp bằng máy đập trong 1 phút 30 giây, 5 lần với tốc độ 27.000 vòng/phút (máy sử dụng Model MM.200). Sau đó thêm vào 32 µl dung dịch lysozyme (nồng độ 50 mg lysozyme/1 mL Tris-HCL 10 mM, pH =9) và lắc đều. Đảo hỗn hợp trong 30 phút bằng tủ đảo tự động. Thêm vào 60 µl dung dịch SDS 20% và 0,2 mL dung dịch CH 3 COOCH 4 (8M có pH=7,2) rồi trộn đều hỗn hợp bằng tủ đảo tự động trong 10 phút. Tiếp tục ly tâm với vận tốc 7.000 vòng/phút trong 15 phút. Lấy phần dung dịch phía trên sang một tuýp khác. Tiếp tục tinh sạch bằng cách cho vào 800µl dung dịch chloroform: isoanyalcohol (Tỉ lệ 24:1) và lắc đều. Trộn hỗn hợp bằng tủ đảo tự động trong 60 phút. Sau đó ly tâm với vận tốc 15.000 vòng/phút trong 15 phút. Hút lấy phần dung dịch lỏng trên cùng chuyển sang tuýp khác. Thêm vào 0,8 thế tích isoprobannol (100%) so với thể tích dung dịch đã lấy rồi lắc đều. Giữ ở -20 ○ C qua đêm. Sau đó ly tâm 12.0000 vòng/phút trong 30 phút. Bỏ phần nước, lấy phần kết tủa để khô ớ nhiệt độ phòng trong 30 phút hoặc sấy khô bằng máy sấy chân không trong 10 phút. Hòa tan ADN kết tủa bằng 250-500 µl dung dịch TE (pH=8, Tris 10 mM, EDTA 1 mM) tùy thuộc vào lượng ADN. Thêm vào 10 µl RNase ủ ở 37 ○ C trong 10 phút. Giữ DNA ở -20 ○ C để sử dụng cho các bước tiếp theo. Tinh sạch ADN (Boon et al., 2002): Cho 500 µl dung dịch tinh sạch vào tuýp có chứa ADN. Cho hỗn hợp vào bộ làm sạch. Hút sạch nước bằng máy hút, lấy phần ống có chứa ADN để sang ống khác. Cho vào 25 µl TE (pH=8, Tris - HCl 10 mM, EDTA 1 mM). TE trước khi sử dụng giữ ấm ở 65 -70 ○ C . Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút. Đây là sản phẩm tinh sạch. Quy trình khuếch đại (phản ứng PCR): phản ứng bằng máy PCR Perkin Elmer 9700 với cặp mồi chung 16S rRNA (Bacillus) và mồi chuyên biệt (Nitrosomonas, Nitrobacter). Trộn hỗn hợp chạy PCR trong các týp PCR, mỗi một phản ứng có thể tích 50 µl gồm các thành phần sau: Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 42-54 Trường Đại học Cần Thơ 46 Bacillus: nồng độ các thành phần trong phản ứng PCR bao gồm các hóa chất sau: Bufer ABgene (1X); MgCl 2 (2 mM); dNTPs (0,4mM); Primer 16F8 (0,5 µM); mồi 16R1391 (0,5 µM); Taq ADN polymerase (1,25U); ADN (100 ng). Thêm nước cất cho đủ 50 µl. Nitrosomonas: nồng độ các thành phần trong phản ứng PCR bao gồm các hóa chất sau: Bufer ABgene (1X); MgCl 2 (2 mM); dNTPs (0,4 mM); Primer AmoA 1F (0,4 µM); Primer AmoA 2R (0,4µM); Taq (1,25U); ADN (100 ng). Thêm nước cất cho đủ 50 µl. Nitrobacter: nồng độ các thành phần trong phản ứng PCR bao gồm các hóa chất sau: bufer ABgene (1X), MgCl 2 (2 Mm), primer 1F (0,7 µM), primer 2R (0,7 µM). Taq ADN polymerase (0,5 mM), Taq (1,25U), ADN (100 ng), thêm nước cho đủ 50 µl. Cho các tuýp PCR vào máy PCR Perkin Elmer 9700 và thiết lập chu kỳ phản ứng như ở Bảng 1. Điện di và đọc kết quả: Các sản phẩm PCR được bảo quản ở 4ºC, điện di trên gel 1,5% agarose bằng bộ điện di một chiều Embi-Tec có bổ sung 10 mg/mL Ethium Bromide (EtBr). Sản phẩm PCR được quan sát bằng hệ thống chụp hình gel Bio –Rad UV 2000 và so sánh độ dài vạch ADN vi khuẩn với độ dài vạch ADN vi khuẩn đối chứng khu ếch đại tương ứng với độ dài ADN của thang chuẩn. Sau đó chụp hình gel chứa sản phẩm PCR các vi khuẩn chọn định dạng. Sản phẩm PCR nào rõ đẹp được giữ lại và sau đó được chọn giải trình tự. Giải trình tự xác định loài: Định danh bằng phương pháp giải trình tự được thực hiện tại Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ và Phòng xét nghiệm Biotech thuộc Công ty Nam Khoa, TP. Hồ Chí Minh. Tại Đại học Cần Thơ, giải trình tự các dòng vi khuẩn bằng máy giải trình tự ABI 3130, sau đó so sánh với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu của NCBI trên trang Web http://www.ebi.ac.uk (National Center for Biotechnology Information) bằng chương trình BLAST xác định mức độ đồng hình của các dòng vi khuẩn đó với các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu của NCBI. Chuẩn bị mẫu giải trình tự ADN: Gắn ADN: Hút 50-100 μl sản phẩm PCR vào tuýp 1,5 mL. Thêm 4 lầ n thể tích dung dịch gắn ADN đã bổ sung isopropanol, trộn đều. Lấy một cột tinh sạch. Hút hết thể tích ở bước 1 cho vào cột tinh sạch (cho giữa cột). Ly tâm ở nhiệt độ phòng với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 3 phút. Đổ bỏ nước trong tuýp bên dưới (hoặc thay tuýp bên dưới khác). Rửa: Thêm 650 μl dung dịch rửa đã bổ sung cồn vào cột. Ly tâm ở nhiệt độ phòng với tốc độ 10.000 rpm trong 6 phút. Đổ bỏ nước trong tuýp. Ly tâm ở nhiệt độ phòng với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 3 phút để loại tất cả dung dịch rửa. Tách ADN: Đặt cột vào tuýp 1,7 ml sạch. Cho vào 50 μl dung dịch hòa tan. Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 5 phút. Ly tâm ở nhiệt độ phòng với tốc độ 13.000 Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 42-54 Trường Đại học Cần Thơ 47 vòng/phút trong 6 phút. Lúc này tuýp sẽ chứa sản phẩm PCR đã được tinh sạch. Trữ sản phẩm thu được ở -20 ○ C. Bảng 1: Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại ADN của vùng 16S rADN với các đoạn mồi Loài vi khuẩn Bước phản ứng Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian (giây) SL chu kỳ Bacillus sp. 1. Biến tính Biến tính 2. Gắn mồi 3. Kéo dài Kéo dài 94 94 60 72 72 120 60 90 80 180 35 35 35 Nitrosomonas sp. 1. Biến tính Biến tính 2. Bắt cặp 3. Kéo dài Kéo dài 95 95 55 72 72 600 60 60 60 600 35 35 35 Nitrobacter sp. 1. Biến tính Biến tính 2. Gắn mồi 3. Kéo dài Kéo dài 95 95 47 72 72 180 45 40 120 300 35 35 35 Thực hiện phản ứng gắn huỳnh quang: Phản ứng PCR (gắn huỳnh quang) được thực hiện trong thể tích 10 μl với các thành phần BiH 2 O khử ion (5); Big.Dye Buffer (1); PCR primer (1); Big.Dye Terminater v3.1 (2); Sản phẩm PCR (1). Tinh sạch sản phẩm phản ứng gắn huỳnh quang: Sau khi kết thúc phản ứng PCR, lấy các tuýp ra khỏi máy. Thêm 2,5 μl EDTA 125 mM. Thêm 30 μl cồn tuyệt đối, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tâm với tốc độ 1.000 vòng/phút trong 45 phút, rút bỏ nước. Thêm nhẹ nhàng 30 μl cồn 70%. Ly tâm với tốc độ 1.000 rpm trong 20 phút. Rút bỏ dịch. Lặp lại 2 lần. Sấy khô chân không ở 30 ○ C khoảng 20 phút. Các bước làm nên hạn chế ánh sáng trực tiếp. Biến tính: Thêm 20μl HiDye Formamide. Biến nạp trên máy PCR 9700 ở 95 o C trong 7 phút. Để ngay trên nước đá trong 2 phút. Giải trình tự: mẫu được đưa vào máy ABI 3130. Chạy chương trình giải trình tự ADN. Đọc kết quả. 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phép thử sinh hóa 3.1.1 Các đặc tính sinh hóa của Bacillus Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 42-54 Trường Đại học Cần Thơ 48 Kết quả xác định các đặc tính sinh hóa 05 chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc cho thấy các chỉ tiêu kiểm tra gần giống với các chỉ tiêu định danh B. subtilis của các tác giả sau Andretta et al., (2004), Sharmin và Rahman (2007). Hình dạng khuẩn lạc: tròn, hơi rìa, khuẩn lạc phẳng. Bề mặt nhẵn hoặc hơi nhăn. Màu trắng đục đến hơi vàng. Sau thời gian nuôi lâu khuẩn lạc có hiện tượng bám sát vào thạch của môi trường (Hình 1). Kết quả nhuộm bào tử cho thấy bào tử bắt màu xanh của thuốc nhuộm Malachite Green và thành tế bào vi khuẩn bắt màu hồng của Safranin (Hình 2). Qua kết quả phân tích cho thấy thời gian nuôi vi khuẩn càng lâu thì bào tử hình thành càng nhiều. Theo Banwart (2000) trong tất cả các loài không phải tất cả các tế bào đều hình thành bào tử dù ở trong bất kì điều kiện nào. Kết quả các phản ứng tinh bột, Casein, Gelatin, Methyl Red, khử nitrate, V-P, sử dụng carbohydrate cho thấy chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột, Casein và Gelatin. Enzyme hoạt động tối ưu ở pH 8,5 và hoạt tính của enzyme tăng khi nhiệt độ tăng, cao nhất ở nhiệt độ 55 o C. Qua xác định đặc tính sinh hóa cho thấy Bacillus sp. có khả năng thích nghi với các điều kiện môi trường khác nhau (Bảng 2). Vi khuẩn có khả năng sống và có thể phát triển ở môi trường khắc nghiệt. Do đó vi khuẩn này có khả năng phân bố rộng và chiếm ưu thế. 3.1.2 Khả năng khử ammonium và urea của vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter Khả năng khử ammonium: Kết quả khảo sát khả năng khử ammonium bằng thuốc thử Griess-Ilosvay các chủng vi khuẩn S6, S8, S10, S12 cho thấy cả 4 chủng vi khuẩn đều có khả năng khử mạnh ammonium ở giai đoạn 10 ngày nuôi. Như vậy, 4 chủng vi khuẩn trên có thể là Nitrosomonas. Kết quả này chứng minh mật độ vi khuẩn Nitrosomonas đã tăng cao nên khả năng chuyển hóa ammonium sang NO 2 - nhanh. Kết quả hoàn toàn phù hợp với kết quả Hình 1: khuẩn lạc sau 48 giờ trên môi trường Hình 2: Bào tử Bacillus Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 42-54 Trường Đại học Cần Thơ 49 nghiên cứu của Lewis và Pramer (1958), Heselsoe et al., (1999) và Hoàng Phương Hà và ctv (2008). Bảng 2: Kết quả xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa vi khuẩn Chủng vi khuẩn định danh Các chỉ tiêu B9 B37 B38 B41 B67 Thủy phân Casein + + + + + Gelatin + + + + + Starch + + + + + Khử Nitrate + + + + + V-P + + + + + Methyl red + + + + + 65ºC + + + + + 72ºC + + + + + Glucose + + + + + Xylose - - - + + Arabinose + + + - + Sucrose - - - + + Mannitol + + + + + Ghi chú: (+) dương tính; (-) âm tính Khảo sát khả năng khử urea: Khả năng khử urea của 4 chủng vi khuẩn khảo sát cho kết quả như sau: chủng S8 không có khả năng khử được urea điều này chứng tỏ chủng vi khuẩn này không sống được trong môi trường có chứa urea. Các dòng còn lại S6, S10, S12 đều sử dụng được urea sau 10 ngày nuôi. 3.1.3 Khả năng nitrate hóa, ảnh hưởng của Biotin lên tăng trưởng của Nitrobacter sp Khả năng nitrate hóa: Chủng N6 và N7 đã khử nitrite hoàn toàn ở giai đoạn 10 ngày nuôi. Điều này chứng tỏ 2 chủng vi khuẩn trên là Nitrobacter sp., có khả năng khử nitrite mạnh, đã chuyển hóa hoàn toàn lượng nitrite trong môi trường thành nitrate. Đối với 3 chủng vi khuẩn N8, N10 và N12 đều có khả năng khử nitrite yếu và chậm nên sau 10 ngày nuôi, môi trường chỉ chuyển từ màu nâu đỏ sang màu hồng, nitrite vẫn còn trong môi trường nuôi. Cho đến ngày thứ 15, quan sát NO 2 - không còn, điều này có thể giải thích do có sự hiện diện của Nitrobacter sp. đã chuyển hoá hoàn toàn NO 2 - thành NO 3 - , môi trường nuôi trở nên trong suốt. Từ kết quả trên cho thấy khả năng nitrate hóa của các chủng vi khuẩn là khác nhau trong cùng một điều kiện môi trường nuôi. Kết quả nghiên cứu phù hợp với Aleem & Alexander (1960), Block và koops (1992), Grundman và Gappe (2000) khi phân lập Nitrobacter từ đất. Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 42-54 Trường Đại học Cần Thơ 50 3.2 Định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử 3.2.1 Kết quả định danh vi khuẩn Bacillus bằng kỹ thuật PCR Kết quả điện di và sản phẩm PCR cho thấy tất cả 5 chủng vi khuẩn B9, B41, B67 đều có vạch hiện ở vị trí 1.500bp cùng với vị trí của vạch vi khuẩn đối chứng dương Bacillus subtilis S19 (Bộ môn di truyền Sinh học và Động vật, trường Đại học Florence, Italia và thang chuẩn (Hình 3). Điều này chứng tỏ 3 chủng vi khuẩn trên thuộc giống Bacillus. Dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa kết hợp với kết quả PCR các chủng trên thuộc giống Bacillus. Kết quả giải trình tự 5 chủng vi khuẩn Bacillus: Trình tự của 5 chủng vi khuẩn B9, B37, B38, B41, B67 được so sánh với trình tự của vi khuẩn trong ngân hàng gen (gen vạch) bằng chương trình BLAST trên trang web http://www.ebi.ac.uk. Kết quả cho thấy chủng B9 có mức độ tương đồng về trình tự ADN với dòng Bacillus cereus BRL02-43 là 97%; 2 dòng B37, B38 có mức độ tương đồng về trình tự ADN với dòng Bacillus cereus G9842 lần lượt là 100% và 99%; Dòng vi khuẩn B41 có mức độ tương đồng về trình tự ADN với dòng Bacillus amyloliquefaciens SB3297 là 100% và dòng B67 có mức độ tương đồng về trình tự ADN với dòng Bacillus subtilis là 99%. B67 B41 B9 ĐC+ ĐC- Thang chuẩn Hình 3: Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện Bacillus. Dòng B9 có tổng số nucleotide giải được là 881, cho kết quả đồng hình với dòng Bacillus cereus BRL02-43 là 97% (862/882), có 16 vị trí bị ngắt quãng, mức độ sai biệt không đáng kể (1%). Dòng B37 có tổng số nucleotide giải được là 539, cho kết quả đồng hình với dòng Bacillus cereus G9842 là 100% (539/539), không có vị trí bị ngắt quãng, mức độ sai sai biệt không đáng kể (0%). Từ kết quả giải trình tự có thể kết luận có ít nhất 3 loài vi khuẩn Bacillus (B. cereus, B. subtilis và B. amyloliquefaciens) tồn tại trong môi trường ao nuôi tôm đã tham gia vào quá trình khử đạm cho môi trường. Trong 5 chủng 1500bp 400bp Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 42-54 Trường Đại học Cần Thơ 51 Bacillus được chọn để định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử chỉ có 1 dòng được định danh là loài Bacillus subtilis BL10 với mức độ đồng dạng tới 99%. Như vậy, kết quả phân tích các chuỗi trình tự trên ngân hàng gen đã khẳng định được 3 chủng vi khuẩn B9, B37, B38 là B. cereus. Chủng B41 là B. amyloliquefaciens, và chủng B67 là B. subtilis. 3.2.2 Kết quả giải trình tự vi khuẩn nitrate hóa Kết quả nhận diện vi khuẩn Nitrosomonas sp. bằng kỹ thuật PCR: Kết quả điện di cho thấy tất cả 3 dòng vi khuẩn S6, S8 và S12 đều có vạch hiện ở vị trí 490bp (Hình 4). Điều này chứng tỏ 3 dòng vi khuẩn trên thuộc loài vi khuẩn Nitrosomonas sp. Kết quả giải trình tự 4 dòng vi khuẩn Nitrosomonas: Kết quả đã giải trình tự ADN được 3 dòng trong tổng số 4 được chọn, kết quả như sau: Dòng vi khuẩn S6 có mức độ đồng hình với dòng Uncultured Nitrosomonadaceae bacterium 3CC11 là 98%; 2 dòng vi khuẩn S8 và S12 có mức độ đồng hình với dòng Nitrosomonas nitrosa lần lượt là 90% và 91%. Dòng vi khuẩn S6 có tổng số nucleotide giải được là 415, cho kết quả đồng hình với dòng Nitrosomonadaceae bacterium 3CC11 là 99%. Thang ĐC- S6 S8 S12 Hình 4: Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện Nitrosomonas. Dòng S6 trình tự giải được khi so trên ngân hàng dữ liệu chỉ xác định được đến họ (Nitrosomonadaceae). Kết quả cho biết chúng thuộc nhóm vi khuẩn nitrate hóa. Dòng S8 và S12 trình tự giải được đồng hình với Nitrosomonas nitrosa (90-91%). Như vậy, kết quả phân tích các chuỗi trình tự trên ngân hàng gen đã khẳng định được 3 dòng vi khuẩn S6, S8 và S12 thuộc nhóm vi khuẩn nitrate hóa. 3.2.3 Kết quả giải trình tự Nitrobacter Kết quả nhận diện vi khuẩn Nitrobacter bằ ng kỹ thuật PCR: Kết quả điện di cho thấy tất cả 2 dòng vi khuẩn N10 và N12 đều có vạch hiện ở vị trí khoảng 600bp 490bp [...]... 3CC11 98% S8 và S12 có mức độ tương đồng về trình tự ADN với Nitrosomonas nitrosa lần lượt 90% và 91% Vi khuẩn N10 và N12 đều có có mức độ tương đồng về trình tự ADN với vi khuẩn Nitrobacter winogradskyi ATCC 25381 lần lượt là 99 - 100% 4.2 Đề xuất Tiếp tục khảo sát khả năng khử đạm của các vi khuẩn Bacillus phân lập được ở các qui mô khác nhau Từ đó, ứng dụng vào vi c sản xuất chế phẩm sinh học để xử... Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 42-54 Trường Đại học Cần Thơ spot syndrome virus-infected Litopenaeus vannamei to Vibrio campbellii In Environmental microbiology (2008), 10 (10) 2718-2727 Lê Đông Cung, Phạm Thị Tuyết Ngân và Trương Quốc Phú, 2010 Xác định khả năng chuyển hóa đạm của nhóm vi khuẩn hữu ích tro ng hệ thống ương tôm sú (Penaeus monodon) nước tuần hoàn Tạp chí khoa học, Đại học Cần Thơ,... Isolation of Nitrosomonas in pure cultrure, J Bacteriol 76: 524-528 Nguyễn Lân Dũng 1983 Thực tập vi sinh vật học Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội Phạm Thị Tuyết Ngân, Trương Quốc Phú, 2010 Biến động các yếu tố môi trường và mật độ vi khuẩn Bacillus sp trong bể nuôi tôm sú Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ, 2010, số: 14B, trang 29-42 Sharmin, F and Rahman, M 2007 Isolation and characterization... 1999 Microcolony formation as a viability index for ammonia-oxidizing bacteria: Nitrosomonas europaea and Nitrosospira sp FEMS Microbiol Ecol 28:383–391 Hoàng Phương Hà, Trần Văn Nhị, Phạm Vi t Cường, Nguyễn Thị Kim Cúc 2008 Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn Nitrat hóa phân lập từ nước lợ nuôi tôm tại Quảng Bình và Hà Tĩnh, TC NN & PTNT, số 2/2008 http://hoinghecavietnam.org.vn/index Koops, H... nghị khoa học thủy sản lần 4: 42-54 Trường Đại học Cần Thơ 390bp cùng với vị trí của vạch thang chuẩn (Hình 3) Điều này chứng tỏ 2 dòng vi khuẩn trên thuộc giống Nitrobacter ĐC – N10 N12 Thang 1.000bp 400bp Hình 5: Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện Nitrobacter Kết quả giải trình tự 4 chủng vi khuẩn Nitrobacter: Kết quả 2 chủng vi khuẩn N10 và N12 đều có mức độ đồng hình với dòng vi khuẩn Nitrobacter... 39: 101-12 Đặng Đình Kim, Nguyễn Văn Năm, Lại Thị Chí, Trần Văn Tựa, Nguyễn Đức Thọ, Đặng Thanh Thủy, Bùi Kim Anh, Vũ Văn Dũng và Nguyễn Văn Quyền 2006 Nghiên cứu chế phẩm sinh học vi sinh vật xử lý nền đáy ao nuôi tôm công nghiệp Vi n Công nghệ Sinh học – TTKHTN và CNQG và Vi n Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy Ssản 1 Grundmann, G.L., M Neyra and P Normand, 2000 High-resolution phylogenetic analysis of NO2-... là 99% và 100% 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Đã định danh được 3 loài vi khuẩn Bacillus trong ao nuôi tôm sú thâm canh Trong đó, chủng B9 có mức độ tương đồng về trình tự ADN với B cereus BRL02-43 là 97%, 2 chủng B37, B38 có mức độ tương đồng về trình tự ADN với B cereus G9842 lần lượt là 100% và 99%, chủng B41 có mức độ tương đồng về trình tự ADN với B amyloliquefaciens SB3297 là 100% và chủng... ứng dụng vào vi c sản xuất chế phẩm sinh học để xử lí môi trường Tiếp tục xác định tính đa dạng, định danh và tỉ lệ (%) hiện diện của cộng đồng vi khuẩn hữu ích trong ao nuôi tôm theo phương pháp điện di biến tính (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis: DGGE) 52 Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 42-54 Trường Đại học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO Aleem, M.I.H and M Alexander, 1960 Nutrition and... www.thongke.gov.vn Yousefi Kebria, D.; Khodadadi, A.; Ganjidoust, H.; Badkoubi, A.; Amoozegar, M A., 2009 Isolation and characterization of a novel native Bacillus strain capable of degrading diesel fuel Int J Environ Sci 54 . nghị khoa học thủy sản lần 4: 42-54 Trường Đại học Cần Thơ 42 ĐỊNH DANH CÁC VI KHUẨN CHUYỂN HÓA ĐẠM BẰNG PHÉP THỬ SINH HÓA VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Phạm Thị Tuyết Ngân 1 và Nguyễn. khuẩn chuyển hóa đạm bằng kỹ Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 42-54 Trường Đại học Cần Thơ 44 thuật sinh học phân tử và phép thử sinh hóa được thực hiện nhằm làm cơ sở cho các nghiên. trích để định danh bằng kỹ thuật giải trình tự. 2.2.1 Phép thử sinh hóa Các chỉ tiêu sinh hóa được áp dụng cho các chủng vi khuẩn Bacillus: B9, B37, B38, B41 và B67 thuần được nuôi tăng sinh trong