NGHIÊN CỨU KHOA HỌC 2013 DIỄN ĐÀN KHOA HỌC 28 ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY VÀ QUANG CHU KỲ ĐẾN SINH TRƢỞNG IN VITRO CỦA MỘT SỐ GIỐNG KHOAI TÂY (SOLANUM TUBEROSUM L.) CÓ KIỂU GENE THÍCH ỨNG KHÁC NHAU TS. Phạm Xuân Tùng, ThS. Phạm Phong Hải & Nguyễn Thị Ánh Dung Trường Đại học Yersin Đ{ Lạt Tóm tắt Ảnh hưởng của hàm lượng GA3 và NAA trong môi trường nuôi cấy v{ quang chu kỳ (QCK) lên sinh trưởng của c}y khoai t}y được khảo sát với hai nhóm giống có kiểu hình thích ứng quang chu kỳ kh|c nhau, ng{y d{i ôn đới và ngày ngắn nhiệt đới núi cao. Kết quả cho thấy các giống ngày dài có phản ứng dương tính với sự gia tăng GA3 đến 0,3 mg/l trong môi trường nuôi cấy v{ QCK đến 16h và bị ức chế sinh trưởng khi gia tăng NAA lên trên 0,1 mg/l. C|c giống ngày ngắn có xu hướng tăng sinh khối, nhưng không tăng chiều cao, với sự kéo d{i quang chu kỳ đến 16h và gia tăng GA3 trong môi trường nuôi cấy, trong khi cần nhiều NAA hơn để tăng trưởng. Tuy vậy, NAA ở hàm lượng 0,3 mg/l ức chế sinh trưởng cây ở cả hai nhóm giống. Abstract Influence of culture media and photoperiod on in vitro growth of potato cultivars (Solanum tuberosum L.) of different genotypes of adaptation The Influence of different levels of GA3, NAA and photoperiods in culture medium on the growth of potato plantlets in vitro was investigated with two groups of potato cultivars of different origins, namely long day temperate region and short day tropical highlands. The results obtained indicated that the long day cultivars responded positively with increasing levels of GA3 of up to 0.3 mg/l and prolonged photoperiod of 16h, but their growth was significantly inhibited with NAA concentration higher than 0.1 mg/l. The short day cultivars exhibited the tendency of increase in total weight of the plantlets, but not the plant height, under the photoperiod of 16h and increasing levels of GA3 while needed higher concentration of NAA in the medium to grow. Nevertheless, NAA level of 0.3 mg/l severely supressed growth of both cultivar groups. I. ĐẶT VẤN ĐỀ ây khoai tây trồng trọt (Solanum tuberosum L.) có nguồn gốc từ vùng núi Andes, Nam Mỹ. S. tuberosum được chia thành hai loài phụ (subspecies): Subsp. tuberosum và subsp. andigena. Subsp. tuberosum được tìm thấy chủ yếu ở vùng đồng bằng Trung - Nam Chile và Nam Bolivia, thích ứng với điều kiện ngày dài của vùng ôn đới. Subsp. andigena phân bố hầu hết ở vùng núi cao trải dài từ Venezuela, Equador, Peru, Bắc Bolivia và thích ứng với điều kiện ngày ngắn, nhiệt độ thấp của vùng nhiệt đới núi cao. Các bằng chứng khảo cổ và thực nghiệm cho thấy, các mẫu khoai tây được người Tây Ban Nha di thực về châu Âu khoảng giữa thế kỷ 16 là từ Mexico và thuộc subsp. andigena (Hawkes, 1982; Hans Ross, 1986). Quá trình thuần hóa, lai tạo, chọn lọc tại châu Âu đã dẫn đến sự hình thành nhóm giống neo-tuberosum thích ứng với điều kiện ngày dài. Do hầu hết các đặc tính hình thái và thích ứng của neo- tuberosum là rất tương đồng với subsp. tuberosum nên nhóm giống này được gộp chung vào subsp. tuberosum. C NGHIÊN CỨU KHOA HỌC 2013 DIỄN ĐÀN KHOA HỌC 29 Ngày nay, hầu hết giống khoai tây sản xuất phổ biến được chọn tạo ở vùng ôn đới và thuộc subsp.tuberosum. Các giống này thích ứng với điều kiện ngày dài, sinh trưởng mạnh và tạo củ tốt trong điều kiện ngày dài. Trong điều kiện ngày ngắn (khoảng 12 giờ/ngày) các giống này sinh trưởng hạn chế và tạo củ rất sớm nên năng suất thường thấp hơn tiềm năng có được trong điều kiện ngày dài. Các giống thuộc subsp. andigena, hoặc có nền di truyền andigena, chỉ được trồng chủ yếu ở các vùng nhiệt đới núi cao, nơi quang chu kỳ chỉ 12 giờ/ngày. Trong điều kiện ngày dài, nhiệt độ cao, các giống này sinh trưởng kéo dài, không hoặc tạo củ rất kém. Các quan sát cho thấy, trong nuôi cấy, nhân giống in vitro, các giống khoai tây có phản ứng khác nhau rất rõ rệt với điều kiện môi trường khác nhau, nhưng chưa có nghiên cứu nào cho cho thấy sự khác biệt này liệu có liên quan đến kiểu hình thích ứng khi giống được chọn tạo. Báo cáo này trình bày kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng cây in vitro của một số giống khoa tây thuốc hai nhóm giống được chọn tạo trong điều kiện khác nhau (kiểu hình thích ứng): Ôn đới (ngày dài)và nhiệt đới núi cao (ngày ngắn). Trên cơ sở đó, đề xuất điều kiện môi trường dinh dưỡng và nuôi cây in vitro thích hợp đối với từng kiểu hình thích ứng phục vụ công tác nhân giống ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô. II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu  Giống có kiểu hình thích ứng với ngày dài vùng ôn đới (quang chu kỳ dài): Atlantic, Marcy, Chipeta (nguồn gốc Bắc Mỹ) và Sunto (nguồn gốc Hàn Quốc).  Giống có kiểu hình thích ứng với ngày ngắn (quang chu kỳ ngắn): TKC33, BW7, BW10 (do Trung tâm Khoai tây Quốc tế lai tạo tại Peru, thích ứng với điều kiện nhiệt đới núi cao, ngày ngắn Peru) và TK96.1 (G6) (nguồn gốc Đà Lạt). 2. Phƣơng pháp nghiên cứu Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Yersin Đà Lạt, với nhiệt độ trung bình 25 ±2 o C. Môi trường nuôi cấy cơ bản Murashighe & Skoog (1962) có bổ sung sucrose 30gr/lít sucrose, agar 8gr/lít, với chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung theo yêu cầu của các nghiệm thức cần khảo sát và chuẩn độ pH 5,7±0,1. Các biện pháp kỹ thuật khác được thực hiện theo cách thông thường áp dụng cho nuôi cấy mô thực vật. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của gibberelin (GA 3 ) và naphtalene acetic acid (NAA) đến sinh trưởng in vitro của các giống khoai tây có kiểu hình sinh trưởng khác nhau. Thí nghiệm gồm hai yếu tố, được bố trí theo thể thức thừa số (factorial design) như sau: - Yếu tố G: 8 giống khoai tây thuộc hai nhóm thích ứng mô tả tại phần Vật liệu. Mẫu thí nghiệm là đoạn thân một đốt (các đốt 1-3 từ ngọn xuống) từ các cây in vitro có tình trạng sinh trưởng khỏe, sạch bệnh của các giống được nuôi cấy từ trước. - Yếu tố M: các công thức chất điều hoà sinh trưởng, gồm: M o : GA 3 0,0 mg/l + NAA 0,0 mg/l M 1 : GA 3 0,1 mg/lít (l) + NAA 0,2 mg/l M 2 : GA 3 0,1 mg/l + NAA 0,3 mg/l M 3 : GA 3 0,2 mg/l + NAA 0,1 mg/l M 4 : GA 3 0,3 mg/l + NAA 0,1 mg/l Các tổ hợp nghiệm thức được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trên giàn nuôi có cường độ ánh NGHIÊN CỨU KHOA HỌC 2013 DIỄN ĐÀN KHOA HỌC 30 sáng 3000 lux, quang chu kỳ 12 giờ, với ba lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là năm mẫu cây trong một chai serum 250 ml. Các chỉ tiêu chiều cao cây (cm), và trọng lượng trung bình cây (mg) được thu thập sau 3 tuần nuôi cấy. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của quang chu kỳ đến sinh trưởng cây của các giống khoai tây có kiểu hình thích ứng khác nhau. Tám giống khoai tây vật liệu được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại, với mẫu cây, số mẫu, cường độ ánh sáng như được mô tả trong thí nghiệm 1, trong điều kiện hai quang chu kỳ: Q1 = 12 giờ (h) chiếu sáng, Q2 = 16 h chiếu sáng. Môi trường nuôi cấy là MS có bổ sung sucrose 30 gr/l, agar 8 gr/l, GA3 0,1 mg/l, NAA 0,1 mg/l. Các số liệu thu thập được tiến hành tương tự như với thí nghiệm 1. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy Nhìn chung, các giống khoai tây đều có xu hướng phản ứng rõ với sự thay đổi hàm lượng GA3 và NAA trong môi trường nuôi cấy. Các quan sát cho thấy mặc dù NAA có ảnh hưởng kích thích sinh trưởng cây (chiều cao và trọng lượng cây trung bình), sự gia tăng hàm lượng NAA trong môi trường cao quá mức 0,1 mg/l có ảnh hưởng tiêu cực đến sinh trưởng cây ở hầu hết các giống (Bảng 1 & 2). Nhóm giống có nguồn gốc ôn đới có phản ứng dương tính mạnh với sự gia tăng hàm lượng GA3 trong môi trường nuôi cấy. Gia tăng hàm lượng GA3 từ 0,1 đến 0,2 và 0,3 mg/l có xu hướng tăng cường kích thích sinh trưởng, gia tăng chiều cao và trọng lượng trung bình /cây ở các giống thuộc nhóm này (Bảng 1 & 2). Trong thí nghiệm này, môi trường thích hợp nhất với nhóm giống này là MS + GA3 0,2-0,3 mg/l + NAA 0,1 mg/l. Với nhóm giống có nguồn gốc nhiệt đới núi cao, tình hình diễn ra khá phức tạp. Nhìn chung, sự gia tăng GA3 trong môi trường từ 0,1 (M 1 ) lên đến 0,3 mg/l (M 4 ) không có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng cây. NAA có tác dụng kích thích sinh trưởng tốt ở hàm lượng 0,1 (M 4 ) đến 0,2 mg/l (M 1 ), nhưng ngược lại khi tăng hàm lượng lên 0,3 mg/l (M 2 )(Bảng 1 & 2). Với các giống TKC33, TK96.1 và BW7 tăng trưởng khối lượng cây tốt nhất trên môi trường có 0,3 mg/l GA3 và 0,1 NAA (M4), trong khi đó BW10 tăng trưởng mạnh nhất trên môi trường có 0,1 mg/l GA3 và 0,2 mg/l NAA (Bảng 2). Trong môi trường MS có bổ sung 0,3 mg/l GA 3 và 0,1 mg/l NAA, chiều cao cây giống TKC33 đạt 4,9 cm, và giảm dần trên môi trường M 1 , M 2 , M 0 (Bảng 1). Giống TK96.1 có xu hướng sinh trưởng tốt hơn trên môi trường có hàm lượng NAA cao hơn trong thí nghiệm này (M 1 và M 2 ). Hàm lượng GA3 cao và NAA thấp trong môi trường có xu hướng ức chế tăng trưởng chiều cao cây của giống này (Bảng 1). Trong khi đó, BW7 và BW10 không có phản ứng rõ ràng khi tăng hàm lượng GA3 từ 0,1 lên 0,2 và 0,3 mg/l, nhưng tăng trưởng cây bị ức chế khi tăng hàm lượng NAA từ 0,2 lên 0,3 mg/l (Bảng 1). Có thể thấy giữa các giống khoai tây có sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê (Bảng 1 & 2). Khác biệt giữa các môi trường cũng rất có ý nghĩa, trong đó ảnh hưởng kích thích của các chất điều hòa sinh trưởng là rất rõ và cho các khác biệt rất có ý nghĩa so với môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng (Bảng 1&2). NGHIÊN CỨU KHOA HỌC 2013 DIỄN ĐÀN KHOA HỌC 31 Bảng 1. Chiều cao cây của tám giống khoai tây nuôi cấy in vitro trên năm môi trƣờng MS có bổ sung GA 3 và NAA với hàm lƣợng khác nhau. M0 M1 M2 M3 M4 Trung bình Atlantic 4,1 mn 5,3 jk 4,4 lm 6,4 g-i 8,1 d 5,7 c Sunto 4,9 kl 4,9 kl 4,4 lm 4,4 lm 5,9 i 4,9 d Marcy 4,2 l-n 4,4 lm 3,9 mn 5,8 ij 4,9 kl 4,7 d 5,2 jk 7,8 de 8,1 d 11,4 a 10,0 b 8,5 a TKC33 2,2 r 4,4 lm 2,7 p-r 3,1 op 4,9 kl 3,5 e TK96.1 2,3 qr 6,4 hi 5,2 jk 4,9 kl 3,1op 3,9 e BW7 2,9 pq 7,4 ef 6,0 i 9,1 c 6,8 f-h 6,4 b BW10 3,7 no 9,3 c 7,2 fg 5,9 i 6,4 hi 6,5 b Trung bình 3,7 c 6,0 a 5,2 ab 6,4 a 6,3 a CV (%) 5,26 Prob (A) ** Prob (B) ** Prob (AB) ** Chú thích: ** Trong cùng cột, giá trị trung bình của các tổ hợp nghiệm thức, trung bình của giống và trung bình của môi trường có cùng ký tự không khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,01 theo Duncan’s multiple range test (DMRT). CV: hệ số biến động. M 0 – M 4 : Xem phần vật liệu và phương pháp. Bảng 2. Trọng lƣợng trung bình /cây của tám giống khoai tây nuôi cấy in vitro trên năm môi trƣờng MS có bổ sung GA 3 và NAA với hàm lƣợng khác nhau. M 0 M 1 M 2 M 3 M 4 Trung bình Atlantic 53 f-h 48 g-j 24 p-s 66 c-e 99 ab 58 c Sunto 47 g-k 51 g-i 43 i-m 101 a 45 h-m 58 c Marcy 36 l-o 33 n-p 30 n-q 43 i-m 24 q-s 33 d Chipeta 45 h-l 93 ab 91 b 97 ab 74 c 80 a TKC33 13 t 38 k-n 16 st 37 l-o 57 fg 32 d TK96.1 8 t 39 j-n 37 l-o 36 no 50g-i 34 d BW7 17 r-t 71 cd 55 fg 97 b 100 a 68 b BW10 28 o-q 63 ef 38 k-n 36 l-o 26 p-r 38 d Trung bình 31 c 55 a 41 b 64 a 59 a CV (%) 8,67 Prob (A) ** Prob (B) ** Prob (AB) ** Chú thích: Tương tự Bảng 1. NGHIÊN CỨU KHOA HỌC 2013 DIỄN ĐÀN KHOA HỌC 32 2. Ảnh hƣởng của quang chu kỳ Kết quả thí nghiệm cho thấy quang chu kỳ 16 h có hiệu quả gia tăng chiều cao cây một cách có ý nghĩa ở các giống có nguồn gốc ôn đới. Điều này phù hợp với dự kiến của các tác giả. Trong khi đó, các giống có nguồn gốc nhiệt đới núi cao không có phản ứng hoặc có xu hướng rút ngắn chiều cao cây (Bảng 3). Kết quả này có vẻ trái với quy luật chung là trong điều kiện ngày dài, cây tổng hợp được nhiều gibberelin hơn, và do đó có xu hướng vươn cao hơn. Tuy nhiên, sức sinh trưởng của thực vật nói chung được điều tiết không chỉ bởi một loại phytohormone, mà do sự phối hợp của cùng một lúc nhiều loại phytohormones. Tổ hợp các loại hormones này trong những điều kiện môi trường sinh thái cụ thể dẫn đến những tình trạng sinh trưởng cụ thể. Kết quả từ thí nghiệm 1 cho thấy các giống thuộc nhóm này có nhu cầu auxin (NAA) khá cao để có thể tăng trưởng chiều cao cây mạnh, trong khi GA3 ít có ảnh hưởng đến tăng trưởng chiều cao cây. Cũng có thể thấy, mặc dù không có tăng trưởng về chiều cao cây, tăng trưởng chung về sinh khối, thể hiện qua trọng lượng trung bình/cây, của nhóm giống ngày ngắn trong điều kiện quang chu kỳ dài (16h) là rất đáng kể và không thua kém nhóm giống ngày dài (Bảng 3). Bảng 3. Chiều cao cây và trọng lƣợng cây trung bình của tám giống khoai tây nuôi cấy in vitro trong hai điều kiện quang chu kỳ khác nhau. Chú thích: ** trong mỗi chỉ tiêu, các giá trị trung bình có cùng ký tự không các biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,01 theo DMRT. Chiều cao trung bình/cây (cm) Trọng lượng trung bình/ cây (mg) Q1=12 h Q2=16h Q1=12 h Q2=16h Atlantic 5,4 ef 5,8 d 54 ef 97 c Sunto 5,8 d 6,7 c 51 f 122 b Marcy 5,2 f 6,0 d 8 h 19 g Chipeta 5,7 de 7,5 b 76 d 161 a TKC33 4,8 g 4,6 g 19 g 49 f TK96.1 4,6 g 4,1 h 15 gh 51f BW7 5,8 d 4,7 g 104 c 49 f BW10 8,7 a 6,6 c 60 e 78d Trung bình 5,7 5,7 54 CV(%) 2,67 5,36 Prob ** ** NGHIÊN CỨU KHOA HỌC 2013 DIỄN ĐÀN KHOA HỌC 33 Kết quả thu được từ thí nghiệm này là phù hợp với kết quả từ thí nghiệm 1, khi các giống ngày dài và giống ngày ngắn được nuôi cấy trên các môi trường in vitro có hàm lượng GA3 và NAA khác nhau. Các giống ngày dài sinh trưởng mạnh hơn khi hàm lượng GA3 trong môi trường tăng (tương ứng với sự kéo dài quang chu kỳ), nhưng bị ức chế khi tăng NAA. Các giống ngày ngắn ít mẫn cảm hơn với hàm lượng gia tăng của GA3 và cần nhiều NAA hơn để tăng trưởng. IV. KẾT LUẬN 1) Trong điều kiện quang chu kỳ 12h, các giống khoai tây có nguồn gốc ôn đới (ngày dài) sinh trưởng và tăng trưởng sinh khối tốt hơn khi hàm lượng GA3 trong môi trường tăng, trong nghiên cứu này là từ 0,1 đến 0,3 mg/l. Hàm lượng GA3 trong môi trường nuôi cấy thích hợp là 0,2-0,3 mg/l. 2) Với cùng điều kiện quang chu kỳ 12h, các giống khoai tây có nguồn gốc nhiệt đới núi cao (ngày ngắn) không phản ứng với sự gia tăng hàm lượng GA3 trong môi trường nuôi cấy và cần nhiều NAA hơn để tăng trưởng. Hàm lượng NAA thích hợp trong môi trường là 0,2 mg/l. 3) Hàm lượng NAA trong môi trường ở mức 0,3 mg/l có ảnh hưởng ức chế sinh trưởng cây khoai tây in vitro. 4) Quang chu kỳ 16h có ảnh hưởng gia tăng đáng kể chiều cao cây và sinh khối các giống khoai tây ngày dài nuôi cấy in vitro. Với các giống ngày ngắn, quang chu kỳ 16h có tác dụng tăng sinh khối chung, nhưng không có tác dụng gia tăng chiều cao cây một cách có ý nghĩa. Tài liệu tham khảo 1. Hawkes, J.G., (1982), History of the potato. In: The potato crop. P.M. Harris (ed.), 2. Chapman & Hall, John Willey & Sons, New York-London. 3. Murashige, T. and F. Skoog (1962), A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15, 473-497. 4. Ross, H. (1986), Potato breeding- problems and perspectives, Verlag Paul Parey. . ĐÀN KHOA HỌC 28 ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY VÀ QUANG CHU KỲ ĐẾN SINH TRƢỞNG IN VITRO CỦA MỘT SỐ GIỐNG KHOAI TÂY (SOLANUM TUBEROSUM L. ) CÓ KIỂU GENE THÍCH ỨNG KHÁC NHAU TS. Phạm Xuân. sát ảnh hưởng của quang chu kỳ đến sinh trưởng cây của các giống khoai tây có kiểu hình thích ứng khác nhau. Tám giống khoai tây vật liệu được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với ba l n l p l i,. cho nuôi cấy mô thực vật. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của gibberelin (GA 3 ) và naphtalene acetic acid (NAA) đến sinh trưởng in vitro của các giống khoai tây có kiểu hình sinh trưởng khác