TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP. HỒ CHÍ MINH KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRÊN MÍA VÀ THỬ KHẢ NĂNG LÊN MEN DỊCH ĐƢỜNG MÍA GVHD: PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG SVTH : PHAN THỊ TƢỜNG VI MSSV : 60602963 TP. HỒ CHÍ MINH, 1/2011 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trƣờng Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học đã tận tình chỉ dạy cho em kiến thức cũng nhƣ phƣơng pháp luận trong suốt 4 năm qua. Sự chỉ dạy tận tình của thầy cô là nền tảng cho em trong quá trình làm luận văn này. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy PGS. TS Nguyễn Đức Lƣợng, chủ nhiệm bộ môn công nghệ sinh học. Thầy đã tận tình giúp đỡ và hƣớng dẫn em trong suốt quá trình làm luận văn. Em cũng xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Nguyễn Anh Khoa, phụ trách phòng thí nghiệm 117B2. Thầy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng em trong suốt quá trình thí nghiệm. Đây là một sự giúp đỡ rất lớn để em hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình cũng nhƣ bạn bè đã ủng hộ không chỉ tinh thần mà còn cả vật chất cho em trong suốt quá trình học đặc biệt trong thời gian làm luận văn tốt nghiệp. Chúc quý thầy cô và các bạn nhiều sức khỏe, tiếp tục gặt hái nhiều thành công trong sự nghiệp! TP Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 01 năm 2011 Phan Thị Tƣờng Vi Luận văn tốt nghiệp SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi i TÓM TẮT Việc gia tăng giá xăng dầu trong thời gian qua do những bất ổn về chính trị cũng nhƣ sự cạn kiệt của nhiên liệu hóa thạch đang thôi thúc các nhà khoa học tìm ra một nguồn nhiên liệu thay thế phù hợp mà ít ảnh hƣởng đến môi trƣờng hơn so với nhiên liệu hóa thạch. Ethanol sinh học là một nguồn nhiên liệu đầy hứa hẹn trong tƣơng lai. Ethanol sinh học đang đƣợc sản xuất ngày càng nhiều trên thế giới không những từ nguồn nguyên liệu giàu tinh bột hay đƣờng mà đang trong quá trình nghiên cứu tận dụng nguồn nguyên liệu lignocellulose. Tuy nhiên, để có đƣợc quá trình sản xuất ethanol từ nguyên liệu lignocellulose hiệu quả và kinh tế thì cần thêm nhiều thời gian để nghiên cứu. Hiện tại, để nâng cao sản lƣợng ethanol sản xuất từ các nguồn nguyên liệu quen thuộc nhƣ tinh bột và đƣờng, một phƣơng pháp đƣợc quan tâm là sử dụng nấm men cố định. Luận văn tốt nghiệp này tập trung vào quá trình nghiên cứu cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên mía và thử nghiệm lên men dịch đƣờng mía. Nấm men cố định trên mía ở điều kiện lắc 100 vòng/phút, trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng cho mật độ tế bào cố định khoảng 2.11. 10 7 tế bào/g mía. Quá trình lên men dịch đƣờng mía bằng chế phẩm nấm men cố định này cho kết quả lên men tốt nhất ở Brix 20%, tỷ lệ giống 10% (10g/100ml dịch lên men) và pH 4 sau 4 ngày lên men trong điều kiện tĩnh ở nhiệt độ phòng. Chế phẩm cố định vẫn cho kết quả lên men tốt sau 6 chu kỳ lên men. Cần nghiên cứu thêm về khả năng tái sử dụng của chế phẩm nấm men cố định. Luận văn tốt nghiệp SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi ii MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC ĐỒ THỊ v DANH MỤC HÌNH vi CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài 2 1.2. Nội dung đề tài 3 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 4 2.1. Công nghệ sản xuất cồn từ dịch đƣờng mía 5 2.2. Phƣơng pháp cố định tế bào 8 2.2.1. Một số kỹ thuật cố định tế bào 8 2.2.2. Yêu cầu đối với chất mang 11 2.2.3. Tác động của kỹ thuật cố định đến tế bào 11 2.3. Giá thể mía 13 2.3.1. Cellulose 14 2.3.2. Hemicellulose 15 2.3.3. Lignin 16 2.3.4. 19 2.4. Ứng dụng phƣơng pháp cố định tế bào trong sản xuất bioethanol 19 2.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất bioethanol trên thế giới và trong nƣớc 24 2.5.1. Tình hình sản xuất bioethanol trên thế giới 24 2.5.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất bioethanol trong nƣớc 25 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1. Vật liệu và dụng cụ 28 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi iii 3.1.1. Vật liệu nghiên cứu 28 3.1.2. Dụng cụ 29 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 29 3.2.1. Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm 29 3.2.2. Phƣơng pháp vi sinh vật 31 3.2.3. Phƣơng pháp hóa lý 34 3.2.4. Các công thức tính 35 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37 4.1. Đƣờng chuẩn và đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men 38 4.1.1. Đƣờng chuẩn của nấm men 38 4.1.2. Đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men 38 4.1.3. Đƣờng chuẩn đƣờng tổng 40 4.2. Kết quả cố định 41 4.2.1. Ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng cố định 41 4.2.2. Ảnh hƣởng của chế độ lắc đến khả năng cố định 43 4.3. Kết quả khảo sát quá trình lên men nƣớc mía bằng nấm men cố định 44 4.3.1. Ảnh hƣởng đến thời gian lên men 44 4.3.2. Ảnh hƣởng của độ Brix 46 4.3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống 48 4.3.4. Ảnh hƣởng của pH 49 4.4. Số lần tái sử dụng nấm men cố định 51 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi iv DANH MỤC BẢNG Bảng 4. 1: Kết quả lập đƣờng chuẩn nấm men 38 Bảng 4. 2: Kết quả lập đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men 38 Bảng 4. 3: Kết quả lập đƣờng chuẩn đƣờng tổng 40 Bảng 4. 4: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng cố định 41 Bảng 4. 5: Kết quả ảnh hƣởng của chế độ lắc đến khả năng cố định 43 Bảng 4. 6: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng lên men 44 Bảng 4. 7: Kết quả ảnh hƣởng của độ Brix đến khả năng lên men 46 Bảng 4. 8: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ giống đến khả năng lên men 48 Bảng 4. 9: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH đến khả năng lên men 49 Bảng 4. 10: Kết quả khảo sát số chu kỳ sử dụng chế phẩm cố định 51 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi v DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 4. 1: Đƣờng chuẩn nấm men 38 Đồ thị 4. 2: Đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men 39 Đồ thị 4. 3: Đƣờng chuẩn đƣờng tổng 40 Đồ thị 4. 4: Ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng cố định 41 Đồ thị 4. 5: Ảnh hƣởng của chế độ lắc đến khả năng cố định 43 Đồ thị 4. 6: Ảnh hƣởng của thời gian lên men 45 Đồ thị 4. 7: Ảnh hƣởng của độ Brix đến khả năng lên men 47 Đồ thị 4. 8: Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống đến khả năng lên men 48 Đồ thị 4. 9: Ảnh hƣởng của pH đến khả năng lên men 50 Đồ thị 4. 10: Kết quả tái sử dụng chế phẩm nấm men cố định 51 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi vi DANH MỤC HÌNH Hình 2. 1: Con đƣờng Embden-Meyerhoff- Parnas glycolytic của Saccharomyces cerevisiae 6 Hình 2. 2: Các phƣơng pháp cố định cơ bản 9 Hình 2. 3: Cấu trúc lignocellulose. 13 Hình 2. 4: Cấu trúc cellulose 15 Hình 2. 5: Cấu trúc của hemicellulose 16 Hình 2. 6: Ba tiền chất phenyl - propane của lignin 17 Hình 2. 7: Cấu trúc lignin 18 Hình 2. 8: Hình chụp mía dƣới kính hiển vi điện tử quét 20 Hình 2. 9: Hình chụp dƣới kính hiển vi điện tử quét phần giữa của giá thể mía sau cố định. 21 Hình 2. 10: Hình chụp dƣới kính hiển vi điện tử quét của bề mặt giá thể trong quá trình lên men 22 Hình 2. 11: Các nƣớc sản xuất bioethanol chủ yếu trên thế giới 24 Hình 3. 1: Mía sau khi tiền xử lý 28 Hình 3. 2: Khuẩn lạc nấm men Saccharomyces cerevisiae trên môi trƣờng Hansen 29 Hình 3. 3: Sơ đồ quá trình thí nghiệm 31 Hình 4. 1: Chế phẩm mía cố định nấm men S.cerevisiae sau 6 chu kỳ lên men 52 Chƣơng 1: Mở đầu SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 1 CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU Chƣơng 1: Mở đầu SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 2 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Khi nào dầu cạn kiệt? Nhiều ƣớc đoán khác nhau cho rằng điều đó sẽ xảy ra bất cứ khi nào trong vòng 20 năm đến hơn một thế kỷ. Sự giảm sút nhanh của năng lƣợng hóa thạch thúc đẩy sự phát triển của năng lƣợng hạt nhân, nhiên liệu tế bào và năng lƣợng mặt trời. Nhƣng cái gì có thể thay thế cho xăng dầu dùng trong các động cơ đốt trong của các phƣơng tiện giao thông trên thế giới. Và cái gì sẽ đại diện cho dầu hóa học nhƣ là nền tảng cho sự mở rộng tổng hợp cái trở nên không thể thiếu trong thế kỷ thứ 20. Đó chính là nhiên liệu sinh học. Thử nghiệm sản xuất nhiên liệu sinh học hiện đại và kinh tế đầu tiên đƣợc Brazil tiến hành dùng glucose (nhƣ sucrose) hiện diện trong mía đƣờng cung cấp nguồn vật liệu lên men sẵn có. Mỹ là quốc gia sản xuất ethanol đứng thứ hai thế giới chủ yếu sản xuất ethanol từ bắp (ngô). Hiện nay, các nhà khoa học đang mở rộng nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học từ các nguồn nguyên liệu lignocellulose vì tính sẵn có với trữ lƣợng lớn và rẻ tiền của chúng. Đây là một hƣớng đi đầy hứa hẹn trong tƣơng lai. Tuy nhiên, sản xuất ethanol sinh học từ vật liệu lignocellulose còn nhiều hạn chế cần phải khắc phục nhƣ hiệu suất lên men thấp, tiêu tốn nhiều năng lƣợng để xử lý nguyên liệu, lƣợng ethanol tạo ra thấp…Hƣớng đi này cần thêm nhiều nghiên cứu để đƣa vào sản xuất ở qui mô lớn trong tƣơng lai. Hiện tại, để nâng cao hiệu suất lên men và giảm chi phí cho quá trình sản xuất ethanol sinh học, chúng ta cần tập trung vào cải thiện các quá trình sẵn có. Một trong những phƣơng pháp đƣợc chú ý nhiều là sử dụng nấm men cố định trong lên men. Nấm men cố định có hiệu suất lên men cao, có khả năng chịu đƣợc nồng độ cơ chất cao, lên men đƣợc trong điều kiện pH thấp và thời gian lên men ngắn là những ƣu điểm nổi bật. Có nhiều giá thể đã đƣợc nghiên cứu để ứng dụng trong sản xuất ethanol nhƣ alginate, mạt cƣa, dăm bào, vỏ cam, bã mía, mía…Trong số đó, mía là một cơ chất rẻ tiền, sẵn có và có nhiều triển vọng đặc biệt trong việc ứng dụng lên men dịch đƣờng và mật rỉ đƣờng. Với cấu trúc cellulose, mía có khả năng thu hút đƣợc nấm men hấp phụ lên bề mặt. Cấu trúc mao mạch với lƣợng đƣờng sẵn có trong mía có thể cung cấp cho nấm men tăng sinh và phát triển sâu bên trong cấu trúc giá thể. Cấu trúc chắc chắn của mía, giúp chế phẩm mía cố định có thể đƣợc tái sử dụng nhiều lần và chịu đƣợc những tác động trong quá trình lên men. Sự gần gũi giữa mía và dịch đƣờng lên men cũng là một yếu tố thuận [...]... phẩm mía cố định trong sản xuất ethanol sinh học từ dịch đƣờng là hoàn toàn có thể thực hiện và giúp tăng năng suất lên men 1.2 Nội dung đề tài Đề tài Nghiên cứu cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên mía và thử nghiệm khả năng lên men dịch đƣờng mía tập trung vào việc khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên mía, cũng nhƣ quá trình lên men dịch. .. đƣờng mía bằng chế phẩm nấm men cố định đƣợc ở trên Các yếu tố nhƣ thời gian và chế độ lắc là hai yếu tố đƣợc quan tâm khi cố định nấm men trên mía bằng phƣơng pháp hấp phụ và tăng sinh Mía đã cố định nấm men đƣợc thử nghiệm sản xuất ethanol từ dịch đƣờng mía Tiến hành khảo sát các yếu tố thời gian lên men, độ Brix, tỷ lệ giống và pH để tối ƣu các yếu tố này trong quá trình lên men bằng chế phẩm nấm men. .. định trên mía, lƣợng ethanol thực tế là 91.72% (0.47) và 88.94% (0.45) lý thuyết, là giá trị có thể chấp nhận đƣợc So sánh với những kết quả thu đƣợc với nấm men tự do, nồng độ ethanol thu đƣợc tƣơng tự, tuy nhiên, điểm khác nhau chính là mức độ lên men cao hơn của nấm men cố định cho thấy khả năng sản xuất cồn cao hơn và hiệu suất lên men cao thu đƣợc với nấm men cố định Chúng ta cũng biết rằng nấm men. .. men tự do Bên cạnh đó, nấm men cố định cũng chịu đƣợc pH thấp và có khả năng chống chịu với những thay đổi về nhiệt độ tốt hơn nấm men tự do [19, 25] 2.3 Giá thể mía Thân mía chứa chủ yếu là nƣớc, đƣờng (sucrose và glucose hoặc fructose) và thành phần lignocellulose (hay còn gọi là bã mía) Trong đó phần lignocellulose đóng vai trò chính trong việc cố định nấm men lên giá thể mía 25% lignin Trong tế... cao và ổn định còn nồng độ đƣờng sót thì thấp (0.34 – 3.60g/l) với mức độ biến đối từ 97.67 – 99.80%, hiệu suất (90.11 – 94.28%) và sự ổn định của chất xúc tác trong lên men ethanol Quá trình lên men bằng giá thể mía cố định trải qua 10 chu kỳ mà sản lƣợng ethanol tạo đƣợc vẫn ổn định Trong trƣờng hợp lên men từ nƣớc mía ( 173.85g đƣờng ban đầu/l) và mật rỉ (154.07 g đƣờng ban đầu/l) bởi nấm men cố định. .. bào Tế bào cố định thƣờng chịu tác động lên sự trao đổi chất mà thấy rõ nhất là ở các điều kiện hoạt động tối ƣu của tế bào Buzas và cộng sự (1989) cho rằng pH tối ƣu cho lên men khi dùng S .cerevisiae tự do là 4, trong khi khả năng lên men của tế bào cố định trong alginate thì độc lập với pH Sự định lƣợng pH nội bào trong tế bào S .cerevisiae tự do và cố định trên alginate lần lƣợt là 6.9 và 6.8 Sự giảm... báo cáo với S .cerevisiae cố định trên ceramics Tế bào S .cerevisiae nhốt trong gelatine cũng cho nồng độ polysaccharide, DNA và RNA cao hơn khi so sánh với tế bào tự do SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 12 Chƣơng 2: Tổng quan lý thuyết Quá trình cố định cải thiện đáng kể đến khả năng chống chịu stress của tế bào vi sinh vật Nấm men cố định có khả năng chịu đƣợc nồng độ cơ chất và ethanol cao hơn nấm men tự do Bên... thấm của màng tế bào và thành phần môi trƣờng có sẵn So sánh những báo cáo của các nghiên cứu về tế bào cố định và tự do cho thấy có những tác động lên sự hoạt hóa năng lƣợng chuyển hóa của nấm men, gia tăng hấp thụ cơ chất và sản xuất sản phẩm, sản lƣợng phụ phẩm lên men thấp, giá trị pH nội bào của nấm men cố định cao hơn, sự gia tăng tính chống chịu những chất độc và chất ức chế và gia tăng hoạt tính... chế phẩm nấm men cố định Đồng thời kiểm tra khả năng tái sử dụng của chế phẩm nấm men cố định trên mía ứng dụng trong lên men dịch đƣờng mía SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 3 Chƣơng 2: Tổng quan lý thuyết CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 4 Chƣơng 2: Tổng quan lý thuyết 2.1 Công nghệ sản xuất cồn từ dịch đƣờng mía Mía đƣờng (Saccharum officinarum) là cây chịu hạn nhiệt đới và cận nhiệt đới... đặc dịch đƣờng mía đƣợc loại ra bằng ly tâm, phần dịch còn lại (mật rỉ) chứa đến 65% khối lƣợng đƣờng Cả dịch đƣờng mía và mật rỉ đƣờng (sau khi chỉnh nồng đồ đƣờng) thƣờng chứa những khoáng chất và chất dinh dƣỡng hữu cơ thích hợp cho sản xuất ethanol bằng lên men bởi Saccharomyces cerevisiae [4] Ở Brazil, 70% nhà máy sản xuất ethanol từ mía đƣờng dùng quá trình lên men theo chu kỳ với khả năng lên men . tốt nghiệp này tập trung vào quá trình nghiên cứu cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên mía và thử nghiệm lên men dịch đƣờng mía. Nấm men cố định trên mía ở điều kiện lắc 100 vòng/phút,. ngày lên men trong điều kiện tĩnh ở nhiệt độ phòng. Chế phẩm cố định vẫn cho kết quả lên men tốt sau 6 chu kỳ lên men. Cần nghiên cứu thêm về khả năng tái sử dụng của chế phẩm nấm men cố định. . Khuẩn lạc nấm men Saccharomyces cerevisiae trên môi trƣờng Hansen 29 Hình 3. 3: Sơ đồ quá trình thí nghiệm 31 Hình 4. 1: Chế phẩm mía cố định nấm men S .cerevisiae sau 6 chu kỳ lên men 52 Chƣơng