1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cho ti nay chnh hc vc coi là tiêu chun vàng trong vinh bnh. Trong khong hai thp niên tr li s phát trin nhanh ca khoa hc công ngh  ni soi, siêu âm, chp ct lp vi tính, chp cng t, nuôi cy t bào, bo quu kin cho sinh thit chnh hc phát trin c v s ng l ba chm siêu âm  ni soi  sinh thi n quan trng. S phát tri ngày càng khnh v th cc ch mô bnh hc, góp phn chm nhiu t và nó rt hu ích cho chu tr nh. Mt xét nghim mô bnh hc tin hành theo mt chui k thut liên hoàn bao gm: 1).Ly bnh phm, ct lc; 2).C nh bnh phm; 3).Gi xét nghim; 4).Vùi bnh phm; 5).Ct mnh và dán; 6).Nhuc kt qu. Mu có nhng yêu cu riêng và liên quan rt mt thit vi nhau, ng trc tin kt qu chnh hc. Trong các khâu k u và cuc thc hin bi các bác c thc hin bi các k thut viên gii phu bnh làm vic trong labo. Tùy theo mu ca xét nghim mà vic x lý k thut  tng khâu có nhm khác nhau và có nhng quy trình riêng. K thut nhum Hematoxylin  Eosin (HE) là k thut ph bin nht trong các k thut mô hnh hc, vì hu ht các ch mô bnh hu ch cn và (hoc) phi da vào k thut này. Vì vc gi là k thung quy cho mi loi xét nghim mô bnh hc trong labo gii phu bnh. 2 Hin nay, xét nghim mô bnh hc   y t  trung bình có ti gng hp sai sót các loi trong các khâu k thut và làm gim chng chng 10% xét nghim âm tính hoc ch thut (3). Xut phát t tính thc tin ca k thut nhum HE nhm bo chng trong chô bnh hc, là mt sinh viên sp tt nghip, mt C nhân K thut Y hc nên qua bài khóa lun này em mong mun rng: 1. Thực hiện thành thạo một chuỗi kỹ thuật liên hoàn từ bệnh phẩm ra những tiêu bản nhuộm H - E. 2. Bước đầu đánh giá chất lượng vi thể và một số yếu tố ảnh hưởng đến tiêu bản nhuộm H - E. 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể: Là mt b phn quan trng ca khoa hc tm gii phu bnh vi th có mn và nghiên cu nhng tính chc m ca tc phm vi t chc và t bào.  mt chng mc nht nh, nó cho phép tìm hiu nhng nguyên nhân gây ra nhng ty, góp phn gi sinh bng quy lut phát sinh và phát trin ca t Trong bnh hc, t loi xét nghi tin cy khá ln n   thut ti       c có nhng kinh nghim nh lâu, xét nghim gii phu bnh vi th  tr i tr th c lc cho nhà lâm sàng hc và càng không th thiu i vi nhà nghiên cu y hc. Trên thc tng xét nghim gii phu bnh vi th rt phong phú, phm vi áp dc m rng,   Vit Nam, c bic phát hin bnh. Ngày nay, hu i chuyên khoa lâm sàng và phn ln nhng chuyên khoa cu có s dng nhng kt qu xét nghim gii phu bnh vi th vào công tác ging dy, nghiên cu khoa hc hoc phc v bnh nhân. 1.2. Tổng Quan về Hematoxylin – Eosin. Hematoxylin: là mt phm nhum t nhiên, chit xut bng ete t lõi cây Haematoxylon campechianum mc trong vùng nhi i Campeche  Mexico. Bc tính nhum, mà nó phi tri qua  bin thành Hematein mi nhulà hing 4  oxy hóa này xy ra do  dung dch nhum t 6 n 3 tun  m i ánh sáng mt tri hoc bng các tác nhân gây oxy  chín Hematoxylin (C 16 H 14 O 6 ) mt 2 nguyên t   tr thành Hematein (C 16 H 12 O 6 ) có s sp xp ki H×nh 1.C«ng thøc cña Hematoxylin H×nh 2.C«ng thøc cña Hematin S oxy hóa liên tc ca Hematein s có hình thành mt hp cht không màu, chính vì vy mà mt s i cho rng quá trình oxy hóa chm mt cách t nhiên t oxy hóa bng cht hóa hc. Phn ng do cht hóa hc s gây nên s oxy hóa Hematein tc khc và quá trình oxy hóa c tip tc nên hình thành mt hp cht không màu, làm cho dung dch nhum không lâu bn. Hematein b chc, vì vy nên phi dùng mt cht gn i th alun (alun ammoniac, potassium hay st): ch        nh   y gi  nhng phm nhu nh nên c  c bit acid nucleic ca nhân. Các s khác nhau v c tính nhum ph thuc vào cách pha ch dung dch Hematoxylin và thành phn gn màu. Ba Hematoxylin tùy theo cht gn màu: Thành phn Cht gn màu (Kim loi)  Nhân  Aluminium, st, tungsten 5  V myelin  Si chun  Dây keo  Si thm, si biu mô  Trc thn kinh  Mucin  t  Mitochondri  ng, st  St, It  Molybden  Tungsten  Chì  Aluminium  Tungsten  St Eosin: Thuc nhu nhuc tính d c và có màu hunh quang vàng - xanh lá cây nht. [2], [3] Hình 3. Công thức của Eosin Vi ngun g    c bi  y nên k thut nhum c ti 1.3. Kỹ thuật cố định, pha, vùi bệnh phẩm, đúc bloc, cắt và dán mảnh, nhuộm tiêu bản H&E: 1.3.1. Kỹ thuật cố định 6 C nh là làm bng nhng cu trúc ca t cha t bào n tn ti ti mc ta hình thái c nh mt t chc là git cht nhng thành phn ca t chn bo qun chúng trong mt tình trng gn vi lúc sng nht. Tr mt s ng hp cn nhun nghiên cu v men, nuôi cy t bào thì nói chung, mi bnh phm cn c nh ngay sau khi ly ra kh. N nh bnh phm không tt thì s làm gim chng xét nghim còn c nh hng thì không th sa chc. Bnh phm sau khi ly ra kh s gây ra thoái hóa, hoi t gi to khi nhnh, các t bào s b tiêu hy bi men ni bào, hình thái ca chúng tr nên méo mó và s sinh ra nhng hình nh gi to gây nhm ln trong chut khác, vic c nh chm s gây tiêu hy các bào quan, không có li cho các nghiên cu v men hng thm bo cho vic gn màu tt khi nhum. Mt bnh phc c nh tt phm bo nhng nguyên tc sau: 1. Mi bnh phm phc c nh ngay sau khi ly. 2. c làm dp nát bnh phm. 3. Bnh phm không ct quá dày. 4.  ng dung dch c nh cn thit. 5. Thi gian c nh dung dch thích hp. 6.  bnh phm dính vào thành l. 7. Chú ý nhng hp c c bit: - Glycogen: c nh bng dung dch Grendre. - M: c nh bng dung dch formol 10%, ct lnh và nhum Soudan. Một số dung dịch cố định thông dụng: 7  Dung dm trung tính 10%: Formaldehyde 37% - 40% 100ml c ct 900ml Sodium phosphate monobasic (NaH 2 PO 4 ) 4g Sodium phosphate dibasic anhydrous (NaH 2 PO 4 khan) 6.5g  Dung dch formol 10%: Formandehyde 37% - 40% 100ml c ct hai ln 900ml  Dung dch c nh Bouin: Dung dc bão hòa acid picic 75ml Formaldehyde 37% - 40% 20ml Acid acetic lnh, nguyên cht 5ml  Dung dch Grende: Cn 95% bão hòa acid picric 80ml Formandehyde 37% - 40% 15ml Acid acetic lnh, nguyên cht 5ml 1.3.2. Pha c làm gip nát bnh phc dùng kp có mi dao pha phi sc, mng và dài, ct mt chic  li trên mt v trí ca bnh phm và bnh phm khi pha pht trên mt ming lie, g hoc plastic. Các mu bnh phm dùng trong k thut mô hc ct dày t 3 - 5 mm. Vi bnh phm m c nh vài gi cho cng sau i pha lng hp chuyng máy, bnh phm không c cu cao ca lòng khuôn nha. 8 1.3.3. Vùi bệnh phẩm Cu trúc t bào hoc mô ch nhìn thi kính hin vi khi chúng c ct thành nhng lát mng c   ta mc chi tit ca t bào, hình dng hay cách sp xp ca chúng. C nh mi ch git cht t bào và gi cho các thành phn cc bng  trt ngay thành các lát ct mng, mi liên quan gia các t u trúc mô b bii, thm chí b o ln do ng c. Mun vi ta phi to khuôn cho bnh ph phi làm cho mt chm sâu vào t bào hoc mô mà khi ct không làm bin dng cu trúc ca chúng. Có nhiu ch          c  là parafin. Hin có nhiu loi parafin vm nóng chy i thích hp nht dùng trong k thut mô hc là parafin có nhi nóng chy t 56 - 58 o C. Nu dùng nhi nóng chy ca parafin t bui ta phi chnh nhi ca t parafin lên na, hu qu làm cho bnh phm chín, khó ct và bt mu ti. Ngoài ra, parac pha thêm mt s cht ph  ng chistoplas, c (bnh phm li có nhic) và cn nên bnh phm phc kh c bng cn có n thp (80 o ) n cao (cn tuyi) ri kh cn bng xylen. Tuy nhiên, vi nhng máy chuyn bnh phm va lc, va ly tâm thì vic loi hc, cn và xylen trong bnh pht kt qu tt khi bnh phc chuyn qua t 2 - 3 ln parafin. Vic tm parafin cho bnh pht trong các bình hút chân không (có trong máy chuyn) càng làm cho parafin ngm vào bnh phm nhanh và t 9  gii phu b máy chuyn nên chúng tôi gii thiu c hai quy trình vùi bnh phm bng tay và bng máy chuyn: 1.3.4. Quy trình chuyển tay:  Áp dụng cho các bệnh phẩm có chiều dày dưới 2 mm Cn 90 o - 15 phút Cn 95 o - 15 phút Cn 100 o I - 15 phút Cn 100 o II - 15 phút Cn 100 o III - 15 phút Xylen I - 15 phút Xylen II - 30 phút Xylen III - 30 phút Parafin I - 30 phút Parafin II - 1 gi Parafin III - 1 gi  Áp dụng cho bệnh phẩm có chiều dày từ 5 mm đến dưới 8 mm Cn 80 o - 2 gi Cn 90 o - 6 gi Cn 95 o - 8 gi Cn 100 o I - 4 gi Cn 100 o II - 6 gi Cn 100 o III - 8 gi Xylen I - 4 gi Xylen II - 8 gi Xylen III - 10 gi Parafin I - 4 gi 10 Parafin II - 6 gi Parafin III - 10 gi 1.3.5. Quy trình chuyển máy:  Áp dụng cho các mảnh sinh thiết và các mảnh mô nhỏ Thi gian c nh ti thiu là 3 gi. 1) Ra nh c chy. 2) Cn 80 o - 10 phút. 3) Cn 95 o x 3 ln x 15 - 20 phút 4) Cn 100 o x 3 ln x 15 phút/ ln 5) Cn 100 o / xylen t l 1:1 - 15 phút 6) Xylen x 2 ln x 15 phút/ ln 7) Parafin x 3 ln x 15 ln/ phút 8) Parafin hút chân không t 15 - 20 phút. Nu không có hút chân không thì  i ln 5 phút. 9)   Áp dụng cho các mô thông thường 1) Cn 80 o - 1 gi 2) Cn 95 o x 3 ln x 1 gi/ ln 3) Cn 100 o x 3 ln x 1 gi/ ln 4) Xylen x 3 ln x 1 gi/ ln 5) Parafin x 3 ln x 1 gi/ ln 6) Parafin hút chân không 1 gi 7)  1.3.6. Đúc bloc Bnh phm sau khi qua quá trình t yêu cu thì có th gi vô thi hn. Mui làm cho parafin   bên [...]... hoc khuy dung dch vi phỳt cho n khi tan hon ton yờn ớt nht 1 gi Kt qu nhum tt nht sau 12 gi - Lc trc khi dựng Cú kt ta v vỏng trờn b mt l bỡnh thng i vi thuc nhum ny - Thi gian nhum cú th thay i t 4 - 8 phỳt - Nu dựng nhum t bo cú th pha thnh 1.5 - 2 lớt Thuc nhum bo tng: Eosin Vi Eosin bỏn cựng Hematoxylin c pha nh sau: - Mt l Eosin hũa tan trong 1 lớt nc ct 2 ln - Lc cho tan ht - Lc trc khi nhum... nhum nhõn baz - hematin v mt phm nhum bo tng acid - eosin Vic nhum nhõn c nhum tng dnngi ta dựng li khi nhng cu trỳc ca nhõn rừ nột nht Ngc li vic nhum bo tnggim dn bng cỏch nhum sm lờn ri loi phm tha bng cn cú nng thp 1.3.8.3 Phng phỏp nhum Hematoxylin - Eosin (Hematoxylin Instant) - Tiờu bn ty nn 3 ln Xylen x 2 ln/ phỳt - Chuyn vo cn 100o, cn 90o, cn 80o x 2 phỳt mi b - Ra nc chy 5 phỳt - Nhum nhõn... dch Hematoxylin nhanh t 5 - 7 phỳt - Ra nc chy 5 phỳt - Bit húa trong cn acid (acid HCL 0.5% trong cn 70o) vi giõy - Ra nc chy ớt nht 5 phỳt (kim tra di kớnh hin vi xem nhõn nhum ó c cha Nu nht quỏ thỡ nhum thờm, ngc li nu sm quỏ thỡ ty tip trong cn acid v ra nc chy tip 5 phỳt) - Lm xanh bng dung dch lithi carbonat hoc natri carbonat bóo hũa - Ra nc chy 5 phỳt - Nhum bo tng trong Eosin t 3 - 5 phỳt -. .. 5 phỳt - Nhum bo tng trong Eosin t 3 - 5 phỳt - Ra qua nc - Loi phm tha trong cn 95o vi giõy - Ty nc bng cn tuyt i Lm trong bng Xylen Gn lamelle bng Baume Canada 13 1.3.8.4 Kt qu: - Nhõn t bo t xanh - xanh en - Bo tng t hng n - Hng cu mu 14 Ch-ơng 2 đối t-ợng và ph-ơng pháp nghiên cứu 1.1 i tng nghiờn cu 1.1.1 Mu xột nghim: tiờu bn nhum H - E Mi c s 200 500 tiờu bn 1.1.2 X lý cỏc mu xột nghim ... phỏp nhum Hematoxylin - Eosin (H&E) 1.3.8.1 Thuc nhum: Thuc nhum nhõn hematoxylin: Hematoxylin l mt loi thuc nhum t nhiờn, nú c bit n t nm 1863 Bn thõn Hematoxylin khụng cú c tớnh nhum m phi tri qua quỏ trỡnh oxy húa mt 2 nguyờn t hydro tr thnh Hematein Pha dung dch Hematoxylin nhanh: - Cho phn A v phn B vo mt bỡnh cha hn 1 lớt - Thờm 1 lớt nc ct 2 ln hoc nc ó c ion húa Khụng dựng nc mỏy - Lc hoc khuy... cho mu nhõn m hn cỏc mụ khỏc 4.2 Mt s yu t chớnh ca K thut vi th liờn quan nh hng n tiờu bn nhum Hematoxylin v Eosin - C nh bnh phm khụng tt lm gim hn cht lng xột nghim v c nh hng l khụng th sa cha c 31 - Li v c nh bnh phm rt hay xy ra i vi cỏc trng hp Labo xột nghim gii phu bnh khụng trc tip thc hin Ch yu l phỏt húa cht cho cỏc khoa/phũng - ỳc bloc: cỏc li cú th xy ra nh: nhit parafin khụng m bo... gi - Mt s yu t lm bn tiờu bn nh: vi khun, nm (do dung dch dỏn mnh bo qun khụng tt, khụng ngõm lam kớnh) - H quỏ lõu trờn bn h hoc mt s c s bn h quỏ núng cú th gõy gión cu trỳc mụ - S gp np mnh ct (mnh ct b nhn nhỳm) hoc b rỏch l do thao tỏc tói mnh ct trờn bn h khụng t yờu cu (Vin Quõn i trung ng 108 tói trờn thit b chuyờn dng ng dung dch dỏn: nhanh & hiu qu hn so vi tói trc tip trờn lam kớnh) 32 -. .. Kết luận 1 i vi em- mt sinh vi n chuyờn ngnh K thut Y hc sp ra trng khi ó nm vng v lý thuyt cỏc quy trỡnh k thut c bn - thc hin thnh tho mt chui k thut chuyn, ct, nhum t bnh phm ra nhng tiờu bn nhum H E thỡ em nhn thy rng k thut khú nht l ct mnh V thc hin c k thut vi th nhum H E t yờu cu k thut thỡ thi gian ti thiu phi lm vic liờn tc trong labo ba thỏng, di s hng dn ca cỏc anh ch k thut vi n cú kinh... nhum H E: - S thnh tho thao tỏc, c bit l trờn mỏy ct mnh v lm c vic ny, yu t con ngi l rt quan trng - C nh bnh phm khụng tt lm gim hn cht lng xột nghim v c nh hng l khụng th sa cha c - Li v c nh bnh phm rt hay xy ra vỡ vi cỏc Labo xột nghim phỏt húa cht cho cỏc khoa/phũng, cỏc khoa/phũng khụng chỳ ý hoc coi nh vai trũ ca vic c nh v dựng thay bng nc mui sinh lý, nc ct gõy hoi t bnh phm - ỳc bloc:... Labo Gii phu bnh vin Lao Phi Trung ng, 463 Hong Hoa Thỏm, Ba ỡnh, H Ni 15 Labo Gii phu bnh Bnh vin K2, Lng Tu, xó Tam Hip, Thanh trỡ, H Ni Labo Gii phu bnh Bnh vin 108, S 1 Trn Hng o, Hai B Trng, H Ni 1.2.3 Phng tin nghiờn cu: Kớnh hin vi quang hc 1.2.4 Quy trỡnh nghiờn cu Lm thun thc k thut ti b mụn n cỏc c s o Quan sỏt, ghi chộp o Theo dừi quy trỡnh k thut vi th nhum H E do k thut vi n ti c s tin . H - E. 2. Bước đầu đánh giá chất lượng vi thể và một số yếu tố ảnh hưởng đến tiêu bản nhuộm H - E. 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể: . pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (Hematoxylin Instant). - Tiêu bn ty nn 3 ln Xylen x 2 ln/ phút. - Chuyn vào cn 100 o , cn 90 o , cn 80 o x 2 phút mi b. - Rc chy 5 phút. - Nhum. albumin 1 -  c dùng cho ng là ph bin nht. 1.3.8 Phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (H&E) 1.3.8.1 Thuốc nhuộm: Thuốc nhuộm nhân hematoxylin: Hematoxylin